不同產(chǎn)地半夏藥材HPLC特征圖譜的建立

吳建明 華 杰 丁京偉 朱 婷 葉志學(xué)

浙江維康藥業(yè)股份有限公司，浙江 麗水 323000

半夏(Pinelliae Rhizoma)為天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.的干燥塊莖。夏、秋二季采挖，洗凈，除去外皮和須根，曬干。具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)的功效。用于濕痰寒痰、咳喘痰多、痰飲眩悸、風(fēng)痰眩暈、痰厥頭痛、嘔吐反胃、胸脘痞悶、梅核氣；外治癰腫痰核[1]?，F(xiàn)代學(xué)者[2-5]已從半夏中分離得到多種類型化學(xué)成分，其中具有生物活性的成分主要包括生物堿類、有機(jī)酸類、揮發(fā)油類、黃酮類、甾體類和糖類等?，F(xiàn)代藥理研究[2，6-8]表明，半夏除對呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)有不同程度的影響外，還具有抗腫瘤、抗早孕、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和催眠的作用。

半夏產(chǎn)地全國分布較多，直到民國除山東外，半夏似未真正形成大宗的道地產(chǎn)區(qū)，民國時(shí)期半夏以湖北荊州，浙江富陽、衢州、嚴(yán)州等為道地產(chǎn)地，現(xiàn)代產(chǎn)地較多，半夏大規(guī)模人工栽培，湖北、甘肅、四川、貴州、云南、安徽、河北、河南、湖南等省均有大面積種植，以湖北潛江、天門、京山、江陵、襄陽、鐘祥等地產(chǎn)半夏質(zhì)量較佳[9-10]。

中藥指紋圖譜是目前中藥產(chǎn)品質(zhì)量控制主要手段之一，可更全面地反映中藥產(chǎn)品整體特征[11]，目前指紋圖譜研究常用高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法等[12]。2020年版《中國藥典》半夏藥材標(biāo)準(zhǔn)中控制的質(zhì)量屬性有性狀、鑒別、檢查、浸出物定等，缺乏整體控制手段，故擬對其關(guān)鍵質(zhì)量屬性主要化學(xué)成分(指紋圖譜)控制進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)研究。本試驗(yàn)收集了不同產(chǎn)地的半夏藥材，探索采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器對其進(jìn)行專屬性鑒別，再分別對色譜條件及供試品溶液制備方法進(jìn)行考察，建立了半夏藥材HPLC指紋圖譜，為更好地控制半夏藥材質(zhì)量提供了可靠的方法依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料 鳥苷對照品(批號：PS010291，成都普思生物科技股份有限公司)；腺苷對照品(批號：PS001227，成都普思生物科技股份有限公司)；夏佛塔苷對照品(批號：PS000955，成都普思生物科技股份有限公司)。半夏藥材(J20021701、山東省菏澤市鄆城縣；J20021702、山東省菏澤市鄆城縣；J20022002、湖北荊門市京山縣；J20030301、甘肅省隴南市西和縣；J20030901、甘肅省隴南市西和縣；J20031001、甘肅省隴南市西和縣；J20032001、甘肅省隴南市西和縣；J20032002、甘肅省隴南市西和縣；J20032501、貴州省畢節(jié)市赫章縣；J20033001、四川省南充市南部縣；J20033002、四川省南充市南部縣；J20040701、湖北省荊門市鐘祥縣；J20040801、甘肅省隴南市西和縣；J20062801、湖北荊門市京山縣；J20062802、湖北荊門市京山縣；J20081201、甘肅省隴南市西和縣；J20081202、甘肅省隴南市西和縣)，均購自浙江惠松制藥有限公司)。甲醇【色譜純，批號：186347，賽默飛世爾科技(中國)有限公司)】；乙醇(分析純，批號：20191011)、甲醇(分析純，批號：20190912)、甲酸(分析純，批號：1801089)、磷酸(分析純，批號：20191015)，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 取鳥苷、腺苷、夏佛塔苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成濃度分別為0.02 mg/mL的溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備 取半夏藥材適量粉碎，過四號篩(65目)，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min(功率900 W，頻率60 kHz)，放冷，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，取上清液濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) SVEA C18Opal 型色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；柱溫為30 ℃；流速為0.9 mL/min；檢測波長為270 nm。

表1 半夏藥材HPLC特征圖譜梯度洗脫表

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 取空白(甲醇)、鳥苷、腺苷、夏佛塔苷、半夏藥材J20032002，按“2.2”“2.3”項(xiàng)下方法制備對照品溶液和供試品溶液，按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測分析。結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，空白溶劑未在供試品色譜相應(yīng)位置出峰，供試品色譜中含有與鳥苷、腺苷、夏佛塔苷對照品保留時(shí)間且紫外吸收光譜一致的峰(詳見表2)，說明該方法專屬性良好。

從下至上依次為：空白(甲醇)、鳥苷、腺苷、夏佛塔苷、半夏藥材J20032002供試品

表2 對照品與半夏藥材供試品紫外圖譜吸收

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取半夏藥材J20032002，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5針，每次進(jìn)樣10 μL，將得到5針指紋圖譜以AIA格式依次導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012版)》計(jì)算軟件進(jìn)行分析，參數(shù)設(shè)置為：以試驗(yàn)第一個(gè)樣色譜圖為參照圖譜，生成方法中位數(shù)，時(shí)間窗0.1；多點(diǎn)校正；全峰匹配，計(jì)算相似度結(jié)果，并對指紋圖譜中10個(gè)明顯特征峰進(jìn)行標(biāo)記，計(jì)算9個(gè)標(biāo)記峰與標(biāo)記S峰(鳥苷)的相對保留時(shí)間及相對峰面積。如圖2所示。

從下至上依次為：精密度1、精密度2、精密度3、精密度4、精密度5

結(jié)果表明，連續(xù)進(jìn)樣的5針供試品溶液指紋圖譜相似度均大于0.99，各供試品溶液與對照指紋圖譜之間的相似度均大于0.99，各特征峰的峰相對保留時(shí)間RSD均小于1.0%，除峰9外，各特征峰相對峰面積小于10.0%，其中峰9由于受基線噪音影響，導(dǎo)致其相對峰面積RSD較大。綜合分析，該方法儀器精密度良好。

在對企業(yè)工程領(lǐng)域法律風(fēng)險(xiǎn)源進(jìn)行全面摸排調(diào)查，并分析評估內(nèi)外部法律環(huán)境基礎(chǔ)上，形成了全面覆蓋工程各環(huán)節(jié)的法律風(fēng)險(xiǎn)防控模式，法律風(fēng)險(xiǎn)防范工作實(shí)現(xiàn)了由事后救濟(jì)型向事先預(yù)防、過程控制型轉(zhuǎn)變。其基本內(nèi)涵是：通過組織機(jī)制建設(shè)，構(gòu)建工程法律風(fēng)險(xiǎn)管理體制；通過點(diǎn)線面的聯(lián)動(dòng)機(jī)制和流程再造，實(shí)現(xiàn)法律風(fēng)險(xiǎn)防控程序化；通過法律風(fēng)險(xiǎn)防控與基層業(yè)務(wù)的融合、多重管理機(jī)制管理手段相結(jié)合，構(gòu)建全面風(fēng)險(xiǎn)管理體系，實(shí)現(xiàn)法律風(fēng)險(xiǎn)防控同制度創(chuàng)新、技術(shù)創(chuàng)新的融合。為構(gòu)建工程法律風(fēng)險(xiǎn)全過程全方位防控模式，企業(yè)的主要做法是：

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取半夏藥材J20032002，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件各進(jìn)樣10 μL，將得到的指紋圖譜以AIA格式依次導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012版)》計(jì)算軟件進(jìn)行分析，參數(shù)設(shè)置為：以試驗(yàn)第一個(gè)樣色譜圖為參照圖譜，生成方法中位數(shù)，時(shí)間窗0.1；多點(diǎn)校正；全峰匹配，計(jì)算相似度結(jié)果，計(jì)算9個(gè)標(biāo)記峰與標(biāo)記S峰(鳥苷)的相對保留時(shí)間及相對峰面積。如圖3所示。

從下至上依次為重復(fù)性1、重復(fù)性2、重復(fù)性3、重復(fù)性4、重復(fù)性5、重復(fù)性6

結(jié)果表明，6個(gè)供試品呈現(xiàn)出的色譜相似度均大于0.99，各供試品溶液與對照指紋圖譜之間的相似度均大于0.99，各特征峰(同精密度項(xiàng)下)相對保留時(shí)間RSD均小于1.0%；除峰9外，其余各特征峰相對峰面積小于10.0%，其中峰9由于受基線噪音影響，導(dǎo)致其相對峰面積RSD較大。綜合分析，該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取半夏藥材J20032002，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件各進(jìn)樣10 μL進(jìn)樣檢測，將得到的指紋圖譜以AIA格式依次導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012版)》計(jì)算軟件進(jìn)行分析，參數(shù)設(shè)置為：以0 h色譜圖為參照圖譜，生成方法中位數(shù)，時(shí)間窗0.1；多點(diǎn)校正；全峰匹配，計(jì)算相似度結(jié)果，計(jì)算9個(gè)標(biāo)記峰與標(biāo)記S峰(鳥苷)的相對保留時(shí)間及相對峰面積。如圖4所示。

從下至上依次為：0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h

結(jié)果表明，不同時(shí)間點(diǎn)測得的色譜相似度均大于0.99，各時(shí)間點(diǎn)供試品溶液與對照指紋圖譜之間的相似度均大于0.99，各特征峰(同精密度項(xiàng)下)相對保留時(shí)間RSD均小于1.0%，相對峰面積RSD均小于10.0%，該供試品溶液在常溫放置8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜的差異分析 按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，對17批半夏藥材供試品溶液進(jìn)行指紋圖譜檢測，將得到的指紋圖譜以AIA格式依次導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012版)》計(jì)算軟件進(jìn)行分析，參數(shù)設(shè)置為：數(shù)據(jù)剪切0～5 min以及 45 min，以S1(J20021701)為參照圖譜，生成方法中位數(shù)，時(shí)間窗0.1；多點(diǎn)校正11個(gè)峰；全峰匹配，計(jì)算相似度結(jié)果，生成對照指紋圖譜如圖5。比較各批次樣品指紋圖譜的相似度、共有峰相對峰面積等差異，評價(jià)不同批間樣品的質(zhì)量差異。

圖5 17批半夏藥材特征圖譜

S1-S17依次為J20021701、J20021702、J20022002、J20030301、J20030901、J20031001、J20032001、J20032002、J20032501、J20033001、J20033002、J20040701、J20040801、J20062801、J20062802、J20081201、J20081202

相似度結(jié)果顯示，17批半夏藥材之間相似度在0.715～1.000之間，17批藥材分別與擬合的對照指紋圖譜的相似度結(jié)果在0.869～0.990范圍內(nèi)。

選擇占總峰面相對較大(占總峰面積2%)、響應(yīng)值較高、分離度較好的共有峰作為特征峰，經(jīng)評估，半夏藥材對照指紋圖譜中不低于總峰面積2%共有色譜峰有9個(gè)，分別為共有峰2、3、4、5、6、8、9、10、11，并以這9個(gè)共有峰作為特征峰，統(tǒng)計(jì)各特征峰的相對保留時(shí)間與峰面積。結(jié)果如圖6所示，見表3～5。

表3 對照指紋圖譜共有峰占總峰面積比例

表4 特征峰相對保留時(shí)間

表5 特征峰相對峰面積

3 討論

不同來源的半夏藥材由于受產(chǎn)地、種植、采收、貯藏等影響致使其所含的有效成分的含量具有一定的差別，從而影響了臨床療效[13]。指紋圖譜能夠反映出待測樣品的整體性、特征性，通過建立指紋圖譜，對半夏藥材中多種有效成分進(jìn)行控制，保證藥材質(zhì)量均一性和穩(wěn)定性。

首先根據(jù)半夏化學(xué)成分組成、處方藥味的制備方法選擇高效液相色譜-二極管陣列檢測器，再分別對色譜條件及供試品溶液制備方法進(jìn)行考察，初步確定指紋圖譜研究用色譜條件。

3.1 供試品溶液制備方法選擇 以色譜峰個(gè)數(shù)、整體分布呈現(xiàn)等為指標(biāo)，采用超聲處理30 min的方式，對供試品溶液提取溶媒進(jìn)行了研究。先對比70%乙醇、95%乙醇、甲醇、水超聲提取所得色譜峰差異進(jìn)行判斷，再根據(jù)結(jié)果考察20%甲醇、50%甲醇、水超聲提取所得指紋圖譜。結(jié)果表明，在同一洗脫條件下，以水為提取溶媒時(shí)，指紋圖譜色譜峰個(gè)數(shù)、整體分布及部分峰分離情況更好，故選擇水作為提取溶媒。

3.2 檢測波長確定 結(jié)合確定的方法所測半夏指紋圖譜的3D圖(時(shí)間-波長-響應(yīng)值)分析可知，230～290 nm波長呈現(xiàn)的色譜峰相對較多，對比不同波長下指紋圖譜可知，270 nm波長下呈現(xiàn)的色譜峰響應(yīng)值更高，各峰分布較為均勻，整體譜圖呈現(xiàn)良好，故選擇270 nm為半夏指紋圖譜檢測波長。

3.3 流動(dòng)相的考察研究 通過查閱大量半夏藥材高效液相色譜指紋圖譜方法研究，初步以甲醇-水為流動(dòng)相，并且對比“甲醇-水”與“甲醇-0.1%甲酸”“甲醇-0.1%磷酸”分別作為流動(dòng)相體系時(shí)半夏指紋圖譜呈現(xiàn)情況。結(jié)果顯示，不同流動(dòng)相體系，色譜峰個(gè)數(shù)及響應(yīng)值均存在差異，其中以甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)洗脫出的色譜峰信息更多且部分色譜峰分離度更好，故暫選“甲醇-水”作為半夏指紋圖譜流動(dòng)相體系。以“甲醇-水”流動(dòng)相體系進(jìn)行洗脫程序的優(yōu)化，最終確定流動(dòng)相為以甲醇為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫。

3.4 特征峰的確認(rèn) 根據(jù)17批次半夏藥材指紋圖譜直觀分析，可知各批次相應(yīng)較大色譜峰個(gè)數(shù)基本一致，但不同批次相同色譜峰響應(yīng)值存在差異，尤其是保留時(shí)間5～10 min左右色譜峰；由相似度結(jié)果可知，17批藥材中僅半夏J20030301、J20030901與對照指紋圖譜相似度低于0.9，兩次均來自甘肅省隴南市西和縣，根據(jù)相似度結(jié)果初步分析兩批次與其他質(zhì)量存在一定差異；各特征峰(S峰除外)相對峰面積RSD值在23.4%～101.7%，除去相似度低于0.9的兩批次后，各特征峰(S峰除外)相對峰面積的RSD值在24.9%～70.0%，說明不同批次間特征峰相對保留時(shí)間存在較大差異。

17批半夏藥材中共有峰11個(gè)，統(tǒng)計(jì)對照指紋圖譜中各共有峰中峰面積占共有峰總峰面積百分比可知，11個(gè)共有峰中只有2個(gè)峰(峰1、峰7)占總峰面積比值低于2%，考慮到批次間質(zhì)量化學(xué)成分含量存在差異，峰面積較小、分離度較差的共有峰受檢測條件等影響較大，不適宜作為特征峰用于藥材的質(zhì)量控制，故選擇占總峰面相對較大(占總峰面積2%)、響應(yīng)值較高、分離度較好的共有峰作為特征峰，經(jīng)評估，半夏藥材對照指紋圖譜中不低于總峰面積2%共有色譜峰有9個(gè)。

綜上分析，不同批次間化學(xué)成分種類及含量均存在一定差異，且不同批次間各主要成分的相對含量差異也較大，故半夏藥材整體質(zhì)量評價(jià)以主要化學(xué)成分的控制，即特征圖譜為主，相似度作為參考；根據(jù)17批次樣品譜圖中特征峰的相對保留時(shí)間平均值，制定特征圖譜的規(guī)定值，考慮到儀器、色譜柱等可能會影響色譜峰的保留時(shí)間，設(shè)置特征峰相對保留時(shí)間允許范圍為規(guī)定值的±10%。

4 結(jié)論

以SVEA C18Opal 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇—水(梯度洗脫)為流動(dòng)相；流速為0.9 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為 270 nm，采用HPLC法測定。

建立的半夏特征圖譜中共標(biāo)記9個(gè)特征性明顯的共有色譜峰，如圖7對照特征圖譜所示，根據(jù)17批次樣品譜圖中特征峰的相對保留時(shí)間平均值，制定特征圖譜的規(guī)定值，最終確立特征圖譜標(biāo)準(zhǔn)為：供試品特征圖譜中呈現(xiàn)9個(gè)特征峰，與鳥苷參照物相應(yīng)的峰為S峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對保留時(shí)間，應(yīng)在規(guī)定值的±10%之內(nèi)。相對保留時(shí)間規(guī)定值為：0.503(峰1)、0.563(峰2)、0.643(峰3)、0.928(峰4)、1.000(峰5)、1.490(峰6)、1.536(峰7)、2.171(峰8)、2.210(峰9)。試驗(yàn)證明，該方法經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果可靠，可用于半夏藥材的質(zhì)量控制。

峰5(S)：鳥苷；峰7：腺苷；峰9：夏佛塔苷