澤瀉醇B對HepG2細(xì)胞體外糖吸收的影響初探

王晨煒 蔡增宏 丘志龍 林燕玲 曾敏潔 李玲燕 韓 丹 秦家樂 張偉云，2*

1.廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系/廈門市中藥生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門 361023；2.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，福州 350122

糖尿病在中醫(yī)中被稱為“消渴病”，近年來已成為全球性公共衛(wèi)生問題，其中以2型糖尿病為主[1]。中醫(yī)治療消渴病已有悠久的歷史，記載了許多有效的復(fù)方，澤瀉因降血糖功效在許多治療消渴的復(fù)方中都有被應(yīng)用[2-3]。澤瀉為澤瀉科植物東方澤瀉Alismaorientale(Sam.)Juzep.或澤瀉Alismaplantag-aquaticaLinn.的干燥塊莖。澤瀉性寒，味甘、淡，歸腎、膀胱經(jīng)，具有利水滲濕、泄熱、化濁降脂的功效[4]?，F(xiàn)代藥理研究[5-7]證實(shí)，澤瀉具有降血糖、調(diào)血脂、抗腫瘤、抗炎、利尿、抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用。澤瀉藥材中主要成分為萜類成分，包括三萜類、倍半萜類和二萜類，據(jù)文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道，其中三萜類化合物可能是澤瀉降血糖活性的有效成分之一，而澤瀉醇B是澤瀉三萜類中的重要化合物，在澤瀉中有較高含量[10]。目前有研究報(bào)道澤瀉三萜單體能夠刺激3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取作用，其中包含澤瀉醇B、澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A等，其結(jié)構(gòu)均為原萜烷型四環(huán)三萜[11-12]，但尚未有關(guān)澤瀉醇B對于HepG2細(xì)胞葡萄糖吸收作用的報(bào)道，本文旨在通過建立HepG2細(xì)胞模型探索澤瀉醇B對HepG2細(xì)胞體外糖吸收的影響。HepG2細(xì)胞系高度分化的肝癌細(xì)胞株，其生物學(xué)特性與正常肝細(xì)胞相近，在高水平的胰島素條件下，該細(xì)胞表面胰島素受體的數(shù)目下降程度與胰島素水平及刺激持續(xù)的時(shí)間呈正相關(guān)，且細(xì)胞能無限增殖，具有易于體外培養(yǎng)的特點(diǎn)，故HepG2細(xì)胞常被用于體外糖吸收的細(xì)胞模型建立[13-14]。羅格列酮為噻唑烷二酮類降糖藥，是目前治療2型糖尿病的常用藥物之一[15-16]。本實(shí)驗(yàn)以澤瀉醇B為研究對象，以羅格列酮為陽性對照物，采用流式細(xì)胞儀測定HepG2細(xì)胞吸收2-NBDG后的熒光強(qiáng)度，以此觀察澤瀉醇B對HepG2細(xì)胞糖吸收的影響，初步探究澤瀉醇B是否有降血糖活性的潛力。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Multiskan Go全波長酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher科技有限公司生產(chǎn)；FC500分析型流式細(xì)胞儀，美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)；IC1000細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，上海睿鈺生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 材料 澤瀉醇B(HPLC≥ 98%)購自成都瑞芬思生物科技有限公司；葡萄糖熒光示蹤劑、CCK-8試劑盒、羅格列酮，均購自美國APExBIO公司；胰島素、DMEM低糖培養(yǎng)基、1×PBS緩沖液、100×青霉素-鏈霉素溶液，均購自Biosharp生物科技有限公司；0.25%胰蛋白酶-EDTA，購自Thermo Fisher科技有限公司；葡萄糖(GC≥99.5%)，購自美國西格瑪Sigma-Aldrich公司；胎牛血清，購自德國Cegrogen Biotech公司。

2 方法

2.1 HepG2細(xì)胞培養(yǎng) 取HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含1%青霉素、鏈霉素，10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，放入37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 CCK-8法細(xì)胞增殖/毒性檢測 取HepG2細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基稀釋至3×104cells/mL，按每孔100 μL接種至96孔板中，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設(shè)置對照組與待測藥物實(shí)驗(yàn)組，對照組不進(jìn)行藥物處理，待測藥物實(shí)驗(yàn)組分成兩組分別加入 100 μL 1 μmol/L和 100 μL 10 μmol/L澤瀉醇B，1 h后，吸去藥物，加入 100 μL 10% CCK-8，培養(yǎng)2 h，用全波長酶標(biāo)儀在450 nm下測定各組細(xì)胞的吸光度，以對照組作為100%，進(jìn)行結(jié)果的比較分析。

2.3 HepG2細(xì)胞糖吸收測定 準(zhǔn)備無血清DMEM低糖培養(yǎng)基(5.5 mmol/L)、無血清DMEM高糖培養(yǎng)基(30 mmol/L)，并配置1 μmol/L胰島素，通過高糖環(huán)境模擬胰島素抵抗[17]。以無血清DMEM低糖培養(yǎng)基模擬低糖環(huán)境；以無血清DMEM高糖培養(yǎng)基模擬高糖環(huán)境；以無血清DMEM低糖培養(yǎng)基加入1 μmol/L胰島素模擬在胰島素刺激下的低糖環(huán)境；以無血清DMEM高糖培養(yǎng)基加入1 μmol/L胰島素模擬在胰島素刺激下的高糖環(huán)境。參考文獻(xiàn)[18]方法，取匯合度70%～80%的細(xì)胞，將細(xì)胞稀釋成3×104cells/mL，每孔2 mL接種至24孔板中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設(shè)置空白對照組、羅格列酮陽性對照組、澤瀉醇B組，空白對照組不進(jìn)行藥物處理，陽性對照組分別加入1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L的羅格列酮，澤瀉醇B組分別加入1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L 的澤瀉醇B。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組內(nèi)設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，其中1孔額外加入10 μmol/L的2-NBDG處理細(xì)胞，另一孔不做處理，加藥結(jié)束后培養(yǎng)1 h，加入 450 μL PBS轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞管，用流式細(xì)胞儀在488 nm下測定1000個(gè)細(xì)胞吸光度平均值。設(shè)置空白對照組的熒光強(qiáng)度為100%。將未加入2-NBDG處理的細(xì)胞熒光強(qiáng)度作為背景值，用于扣除細(xì)胞和藥物本身的背景熒光強(qiáng)度。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1 澤瀉醇B對HepG2增殖/毒性影響 以0.1%DMSO為空白對照，1 μM澤瀉醇B細(xì)胞活力為 (99.17±0.25)%，10 μM澤瀉醇B細(xì)胞活力 (98.96±0.27)%，兩組結(jié)果均提示澤瀉醇B對細(xì)胞生長的影響較小，無顯著性差異。

3.2 不同濃度澤瀉醇B在低糖環(huán)境下對HepG2糖吸收的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在低糖環(huán)境下，10 μmol/L 的澤瀉醇B對HepG2細(xì)胞的糖吸收有明顯促進(jìn)作用，葡萄糖吸收率增加達(dá)116%(如圖1)。

圖1 澤瀉醇B在低糖環(huán)境下對HepG2糖吸收的影響圖(n=3)

3.3 不同濃度澤瀉醇B在高糖環(huán)境下對HepG2糖吸收的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在高糖環(huán)境下，5 μmol/L的澤瀉醇B對HepG2細(xì)胞的糖吸收率增加達(dá)156%，其促進(jìn)糖吸收活性與羅格列酮差異不大，提示了澤瀉醇B能顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞對葡萄糖的吸收(如圖2)。

圖2 澤瀉醇B在高糖環(huán)境下對HepG2糖吸收的影響圖(n=3)

3.4 不同濃度澤瀉醇B在胰島素刺激的低糖環(huán)境下對HepG2糖吸收的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在胰島素刺激的低糖環(huán)境下，1 μmol/L和10 μmol/L的澤瀉醇B對HepG2細(xì)胞的糖吸收都產(chǎn)生促進(jìn)作用，其中10 μmol/L的澤瀉醇B對HepG2細(xì)胞的糖吸收的促進(jìn)作用十分顯著，葡萄糖吸收率增加達(dá)48%(如圖3)。

圖3 澤瀉醇B在胰島素刺激的低糖環(huán)境下對HepG2糖吸收的影響圖(n=3)

3.5 不同濃度澤瀉醇B在胰島素刺激的高糖環(huán)境下對HepG2糖吸收的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在胰島素刺激的高糖環(huán)境下，1 μmol/L和10 μmol/L的澤瀉醇B對HepG2細(xì)胞的糖吸收都表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用，前者葡萄糖吸收率增加達(dá)23%，后者葡萄糖吸收率增加達(dá)31%，兩組表現(xiàn)出的促進(jìn)糖吸收活性效果都與羅格列酮相近(如圖4)。

圖4 澤瀉醇B在胰島素刺激的高糖環(huán)境下對HepG2糖吸收的影響圖(n=3)

4 討論

羅格列酮是用于治療2型糖尿病的西藥[17]，有相關(guān)文獻(xiàn)[19]指出長期使用羅格列酮會(huì)使患者出現(xiàn)心衰、肝功能損傷等副作用，而使用中藥治療糖尿病及其并發(fā)癥不僅能標(biāo)本兼治，藥效明顯，且無明顯不良反應(yīng)[20]。因此探究中藥有效降血糖活性成分對臨床上治療糖尿病有十分重大的意義。

實(shí)驗(yàn)采用澤瀉醇B為實(shí)驗(yàn)對象，以羅格列酮為陽性藥物，探究澤瀉醇B對HepG2細(xì)胞糖吸收的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在模擬的低糖環(huán)境下 10 μmol/L、高糖環(huán)境下5 μmol/L、胰島素刺激的低糖環(huán)境下10 μmol/L、胰島素刺激的高糖環(huán)境下1 μmol/L用量的澤瀉醇B均展示出了與羅格列酮相近的促進(jìn)葡萄糖吸收的活性，初步提示澤瀉醇B可能為澤瀉降血糖的有效化學(xué)成分之一。因本實(shí)驗(yàn)僅用細(xì)胞模型初步探究了澤瀉醇B促進(jìn)葡萄糖吸收的活性，今后可進(jìn)一步采用小鼠模型[21]開展實(shí)驗(yàn)，研究澤瀉醇B是否具有降血糖活性并深入探究其作用機(jī)制。另外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示羅格列酮在有無胰島素條件下對糖吸收的影響沒有顯著差異，其具體原因及作用機(jī)制尚需深入研究。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在模擬的4種環(huán)境下，不同濃度的澤瀉醇B對HepG2細(xì)胞的糖吸收均有促進(jìn)作用，提示澤瀉醇B可能為澤瀉降血糖的有效成分之一。該結(jié)果為研究澤瀉降血糖物質(zhì)基礎(chǔ)提供了數(shù)據(jù)參考，為后續(xù)研發(fā)澤瀉相關(guān)藥物降低血糖、治療糖尿病提供了初步依據(jù)。