牛樟芝的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

邱 理 李 華 陸 佳 吳躍麗 張愷東 黎嘉茗

廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510663

牛樟芝(Antrodiacinnamomea)最早發(fā)現(xiàn)于我國(guó)臺(tái)灣，是當(dāng)?shù)靥赜械恼湎∷幱镁贩N，屬擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、多孔菌目 (Polyporales)、白肉迷孔菌科(Fomitopsidaceae)、薄孔菌屬(Antrodia)，野生牛樟芝子實(shí)體生長(zhǎng)在腐爛空心的牛樟樹(shù)(Cinnamomumkanehirai)內(nèi)壁[1]。牛樟芝具有多種藥理作用，如抗腫瘤、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)及保肝等作用，也可用于治療食物和藥物中毒、腹瀉、腹痛、高血壓和皮膚瘙癢等[2-3]。目前牛樟芝未有較完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為了更好地控制牛樟芝藥材的質(zhì)量，本研究制定了牛樟芝的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 SARTORIUS CP225S萬(wàn)分之一電子天平；CARBOLITE馬弗爐；BINDER恒溫干燥箱；ZEISS Scope.A1顯微鏡；CAMAG TLC VISUALIZER薄層成像儀；Eppendorf 5417R離心機(jī)；ABI 9700 PCR儀；DYY-8C電泳儀(北京六一儀器廠)；DK-24水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；ABI3730XL測(cè)序儀。

1.2 材料 BGI2xSuper PCR Mix(with dye)(北京六合華大基因科技有限公司)；BGI D2000 Plus DNA Ladder(北京六合華大基因科技有限公司)；細(xì)菌基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司)；磁珠法細(xì)菌和真菌基因組提取試劑盒(武漢納磁生物科技有限公司)；碩美PCR產(chǎn)物磁珠法純化試劑盒。丙三醇(批號(hào)：20220201)；三氯乙醛，水合物(批號(hào)：C11916119)、瓊脂糖試劑均為分析純；水為純化水。丙三醇、購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠，三氯乙醛，水合物購(gòu)自Merck公司，瓊脂糖購(gòu)于廈門(mén)太陽(yáng)馬生物工程有限公司。

牛樟芝藥材樣品15批，經(jīng)廣東省藥品檢驗(yàn)所李華主任中藥師鑒定，均為牛樟芝Antrodiacinnamomea的干燥品。樣品信息見(jiàn)表7。

2 方法與結(jié)果

2.1 外觀性狀 按樣品實(shí)際情況進(jìn)行描述，本品性狀如下：本品外形為不規(guī)則板狀，外徑5～10 cm不等，厚度3～10 mm，表面具不規(guī)則隆起，正面淡黃褐色至紅褐色，隆起處色深，背面淺米黃色至棕褐色。具牛樟芝特有濃郁香味。如圖1(為20210204批次樣品)。

圖1 牛樟芝藥材圖

2.2 顯微鑒別 本品粉末淺黃色、黃色、淺棕色至棕褐色；菌絲散在或粘結(jié)成團(tuán)，細(xì)長(zhǎng)，透明，直徑1.8～3.6 μm。牛樟芝粉末顯微特征如圖2、圖3所示。

圖2 牛樟芝粉末圖

圖3 牛樟芝粉末顯微特征圖(顯微攝影放大倍數(shù)：10×40)

2.3 基因序列鑒定 牛樟芝基因序列的鑒定按照中國(guó)科學(xué)院微生物研究所鑒定方法，根據(jù)NCBI中已確認(rèn)牛樟芝菌的線粒體基因組，通過(guò)BLAST比對(duì)結(jié)合PCR方法確認(rèn)種屬。要求相似度達(dá)到99%。

2.3.1 基因組DNA提取 取2 mL離心管，加入200 μL預(yù)處理液和三顆玻璃珠，然后加入適量菌樣品，放入研磨儀中研磨至充分。加入20 μL Proteinase K溶液，混勻，37 ℃放置30～60 min。加入200 μL裂解液，充分顛倒混勻，70 ℃放置10 min。加200 μL無(wú)水乙醇，充分顛倒混勻，短離心以去除管蓋內(nèi)壁液滴。過(guò)吸附柱，洗滌液洗1次，漂洗液洗2次。吸附柱室溫放置5～10 min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。將吸附轉(zhuǎn)入一個(gè)新離心管，向吸附膜中間位置懸空滴加50～100 μL ddH2O，室溫放置5～10 min，12000 rpm離心 2 min，將溶液收集到離心管中。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分裝樣品板、磁珠板、洗滌板、洗脫板，并放置提取儀對(duì)應(yīng)工位，運(yùn)行細(xì)菌提取程序至結(jié)束。詳見(jiàn)表1。

表1 引物信息表(16S/18S擴(kuò)增)

表2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和條件

2.3.2 PCR產(chǎn)物檢測(cè)及純化 3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，觀察條帶性狀。PCR產(chǎn)物純化按照磁珠純化標(biāo)準(zhǔn)操作流程操作，利用磁珠能夠吸附或者釋放帶電荷物質(zhì)的原理，在高鹽低pH溶液吸附DNA，在低鹽高pH溶液釋放DNA，從而達(dá)到分離提純DNA產(chǎn)物的目的。

將純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。將純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)基因序列為：

CTGCGGAAGGATCATTATTGTATTTGAAAGGG

GTTGTAGCTGACCTCCTCTTGAAAAGGG 60

GGGAGGTATGTGCACACCTCTGTTCATTCATAT

TCTCTCACACCTGTGCATGCTTTGTAG 120

GTTGGTTTTGAATGGTTGTCTTCTCTGATGGAG

ACAGCTGTTTTGACCTTCCTATGTTTT 180

TTAAATTGACTCCGTATCAGTTACAGAATGTAT

GTTGCGTGTAACGCATATTGTATAACT 240

TTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGAT

GAAGAACACGGCGAAATGTGATAAGTA 300

ATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATTGAA

TCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGT 360

ATTCTGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGG

AATTATCAACCCTTTTGACTTTTTGTT 420

GAATGGGCTTGGATTTGGAGGGTTAAATTGCT

GGCTCttttttttGATTCAGCTCCTCTT 480

GAATGCATTAGCTTGAACCCTTGTGGATTGACC

TTATCGGTGTGATAGTCATCTATGCCG 540

TGGTTGTCTGAGGTGGGATCGGCTTCTAATGGT

GCAAGTCCCTTCAGGGGGATGATTTTC 600

TAATGACCTTCTGACCTCAAATCAGGTAGGAC

TACCC 637

2.3.3 結(jié)果 經(jīng)檢驗(yàn)三批樣品根據(jù)比對(duì)結(jié)果，輸入序列與參考序列相似度均為99%，與標(biāo)準(zhǔn)相符，均符合規(guī)定。瓊脂糖凝膠電泳圖如圖4，電泳孔位對(duì)應(yīng)樣品和引物見(jiàn)表3，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表4～6。

表3 電泳孔位對(duì)應(yīng)樣品和引物

表4 20210204比對(duì)結(jié)果

表5 20210301比對(duì)結(jié)果

表6 20210302比對(duì)結(jié)果

注：M從上到下依次為5000、3000、2000、1000、750、500、250、100 bp

2.4 水分 按水分測(cè)定法(中國(guó)藥典2020版四部通則0832 第二法)[4]測(cè)定。實(shí)測(cè)樣品15批，結(jié)果為10.9%～15.1%，平均值為13.0%。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 總灰分 按總灰分測(cè)定法(中國(guó)藥典2020版四部通則2302)[4]測(cè)定。實(shí)測(cè)樣品15批，結(jié)果為2.9%～3.4%，平均值為3.1%。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

2.6 黃曲霉毒素 按黃曲霉毒素測(cè)定法(《中國(guó)藥典》四部通則2351)[4]測(cè)定。實(shí)測(cè)樣品15批，結(jié)果為未檢出。牛樟芝黃曲霉毒素圖譜如圖5，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

圖5 牛樟芝黃曲霉毒素圖譜

2.7 浸出物 以水和乙醇為溶劑，按照浸出物項(xiàng)下冷浸法(中國(guó)藥典2020年版四部通則2201和《中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》2019年版 浸出物測(cè)定法)[4-5]測(cè)定樣品3的浸出物，測(cè)得浸出物含量為39.2%、20.6%；以水、稀乙醇、乙醇為溶劑，分別按水溶性浸出物和醇溶性浸出物項(xiàng)下熱浸法(中國(guó)藥典2020年版四部通則2201)[4]測(cè)定樣品3的浸出物，結(jié)果分別為36.4%、34.3%、25.1%，可得知以水為溶劑、冷浸法測(cè)定結(jié)果最高，故選定以水為溶劑的冷浸法，再測(cè)定15批樣品的浸出物含量，浸出物測(cè)定結(jié)果35.8%～43.5%，平均值為40.4%。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 牛樟芝樣品信息及其水分、總灰分、黃曲霉毒素和浸出物的測(cè)定結(jié)果

3 討論

根據(jù)測(cè)定結(jié)果，15批牛樟芝樣品，水分平均值為13.0%，參考中國(guó)藥典2020年版四部0212藥材和飲片檢定通則，以水分測(cè)定結(jié)果平均值的120%設(shè)限，暫定本品水分不得過(guò)15.6%。以總灰分測(cè)定結(jié)果平均值的120%設(shè)限，暫定本品總灰分不得過(guò)3.7%。由于牛樟芝使用培養(yǎng)基培育，酸不溶性灰分做出數(shù)據(jù)較低，建議酸不溶性灰分暫不收載于標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)。15批樣品的浸出物含量平均值為40.4%，以平均值80%設(shè)限，暫定本品照水溶性浸出物測(cè)定法(中國(guó)藥典2020年版四部通則2201)[4]項(xiàng)下的冷浸法測(cè)定，用水作溶劑，不得少于32.3%。

牛樟芝顯微鑒別中發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶，可能由于牛樟芝在栽培的過(guò)程中整個(gè)傘面覆蓋于培養(yǎng)基上所造成，菌絲顯微特征較多。

野生牛樟芝在歸經(jīng)的屬性依臺(tái)灣民間用藥的習(xí)性以治療肝臟相關(guān)疾病為主，加上近十多年來(lái)于腫瘤治療的論證，牛樟芝三萜類(lèi)化合物在抗腫瘤活性調(diào)節(jié)中扮演著重要角色，其具有抑制肝癌細(xì)胞的增殖、毒殺老鼠血癌細(xì)胞活性、抗血清素活性、活化神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)能力等功能[6]。牛樟芝作為現(xiàn)在較熱門(mén)的食用性中藥材，功效還需繼續(xù)深入地研究。

綜上，研究對(duì)性狀、顯微鑒別、基因序列鑒定、水分、總灰分、黃曲霉毒素和浸出物等進(jìn)行檢驗(yàn)，建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，能更好地控制牛樟芝藥材的質(zhì)量，對(duì)牛樟芝更深入地研究打下夯實(shí)的基礎(chǔ)。