奇白消軟膏的定性鑒別與定量檢測

梁林輝 章 斌* 姚永秀 彭 東 劉德軍 趙 君

1.雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)院，四川 雅安 625000；2.雅安市食品藥品應(yīng)用開發(fā)工程技術(shù)研究中心，四川 雅安 625000；3.雅安蒲源生物技術(shù)有限公司，四川 雅安 625000；4.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 成都 610000

奇白消軟膏是由黃連、人工牛黃、冰片、琥珀、朱砂粉等6味中藥組成，輔以凡士林適量，制成的軟膏劑，具有解毒燥濕，殺蟲止癢功效。其中，君藥黃連清熱燥濕，瀉火解毒；人工牛黃清熱解毒；佐以冰片、琥珀、朱砂，清熱止痛、散瘀止血、安神解毒[1]。臨床常用于外陰白斑病，癥見白斑帶下、陰癢、皸裂，潰瘍、增生或萎縮等[2]。同時，奇白消軟膏在治療嬰兒濕疹方面療效顯著[3]。奇白消軟膏臨床使用多年，但未見有其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。為加強(qiáng)制劑的質(zhì)量控制，保證用藥安全、有效，本文研究該制劑薄層鑒別和含量測定兩項(xiàng)主要質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目，為奇白消軟膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Essentia LC-16高效液相色譜儀(日本島津)，AUW120D分析天平(日本島津)，Symmetry-C18色譜柱(美國沃特世)，Shim-pack VP-ODS色譜柱 (日本島津)。

1.2 藥品與試劑 奇白消軟膏(批號：20210616-1、20210616-2，四川家傳方中醫(yī)藥科技有限公司)；鹽酸小檗堿對照品(批號：110713-20100，含量：86%，中國食品藥品檢定研究院)；黃連對照藥材(批號：DZYC-H-004，成都瑞芬思生物科技有限公司)；牛膽粉(批號：KZTL-5E46，中國食品藥品檢定研究院)；色譜純甲醇(批號：LOT 210841，賽默飛)、色譜純乙腈(批號：210774，賽默飛)；純化水為市售純凈水；其他試劑(分析純)均為市售常規(guī)試劑。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 黃連的薄層鑒別 取奇白消軟膏3.0 g，加石油醚30 mL攪拌均勻，3000 r/min離心5 min，棄去上清夜，沉淀加25 mL甲醇超聲處理30 min，3000 r/min離心5 min，上清液為供試品溶液；取除黃連藥材外其他5味藥材，按處方比例混合并與凡士林混合均勻，參照供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。取黃連對照藥材0.25 g，加25 mL甲醇超聲處理30 min，3000 r/min離心5 min，上清液作為對照藥材溶液。取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成0.5 mg/mL的溶液作為對照品溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性對照溶液、對照藥材溶液及對照品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-乙醇-冰乙酸-水(4∶1∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，365 nm下檢視。供試品和對照藥材色譜在相應(yīng)的位置上顯三個相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾(如圖1a)。

a b

按上述方法，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)為展開劑，把硅膠板置于濃氨飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，365 nm下檢視。供試品和對照藥材色譜在相應(yīng)的位置上顯五個相同顏色的斑點(diǎn)，供陰性對照無干擾(如圖1b)。

2.1.2 人工牛黃的薄層鑒別 取奇白消軟膏 3.0 g，加石油醚30 mL攪拌均勻，3000 r/min離心5 min，棄去上清夜，沉淀加25 mL甲醇超聲處理30 min，3000 r/min離心5 min，上清液為供試品溶液；取除人工牛黃外其他5味藥材，按處方比例混合并與凡士林混合均勻，參照供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。取牛膽粉對照品，加甲醇制成1.5 mg/mL的溶液作為對照品溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性對照溶液及對照品溶液各8 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-醋酸-甲醇(20∶25∶2∶3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10磷鉬酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品和對照品色譜在相應(yīng)的位置上顯相同的藍(lán)色斑點(diǎn)，陰性對照無干擾(如圖2)。

1 2 3 4

2.2 含量測定

2.2.1 色譜方法適用性考察

2.2.1.1 色譜條件 處方中黃連為君藥，故選擇黃連的有效成分鹽酸小檗堿作為奇白消軟膏含量測定指標(biāo)。色譜柱：Shim-pack VP-ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長為345 nm；流動相為乙腈：0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0)(30∶70)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計算應(yīng)不低于5000。結(jié)果表明，樣品中鹽酸小檗堿峰分離好，峰形對稱，并且陰性無干擾，該法專屬性良好(如圖3)。

圖3 齊白消軟膏HPLC色譜圖

2.2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品，置100 mL棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。

2.2.1.3 線性關(guān)系考察 精密量取鹽酸小檗堿對照品溶液適量，置10 mL容量瓶中，加甲醇搖勻，定容，制成質(zhì)量濃度分別為1.5 μg/mL、3 μg/mL、9 μg/mL、15 μg/mL、25 μg/mL、40 μg/mL的對照品溶液。按“2.2.1.1”項(xiàng)下色譜條件檢測，以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4；鹽酸小檗堿的回歸方程、線性范圍見表1。結(jié)果表明鹽酸小檗堿的線性關(guān)系良好。

表1 線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)

表2 精密度試驗(yàn) (n=6)

圖4 鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2.1.4 精密度試驗(yàn) 參照“2.2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，選取“2.2.1.3”項(xiàng)下濃度為25 μg/mL鹽酸小檗堿對照品，連續(xù)進(jìn)樣6次，鹽酸小檗堿的峰面積RSD為 0.41%，儀器精密度良好。

2.2.2 樣品溶液的制備方法考察

2.2.2.1 制備方法試驗(yàn) 取齊白消軟膏(批號：20210616-1)12份，每份約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別以50%甲醇-鹽酸(100∶1)、75%甲醇-鹽酸(100∶1)、甲醇-鹽酸(100∶1)、50%乙醇-鹽酸(100∶1)、70%乙醇-鹽酸(100∶1)、95%乙醇-鹽酸(100∶1)混合溶液各50 mL為提取溶劑，平行1份，稱定重量，超聲處理30 min，取出，冷卻至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。按“2.2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定含量，結(jié)果見表3。由表3可知，95%乙醇對指標(biāo)成分的提取含量較高。但考慮到齊白消軟膏中凡士林對提取效果的影響，故進(jìn)行追加實(shí)驗(yàn)，先除去凡士林，再考察甲醇和95%乙醇的提取效果。取本品約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加 20 mL 石油醚(60～90)，攪拌振搖，濾過，殘渣精密加入甲醇-鹽酸(100∶1)、95%乙醇-鹽酸(100∶1)混合溶液50 mL，平行1份，稱定重量。同法制成供試品溶液。結(jié)果表明，去除凡士林后，鹽酸小檗堿含量明顯提高，優(yōu)選以甲醇-鹽酸(100∶1)溶劑來制備樣品。

表3 不同溶劑的提取結(jié)果

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加20 mL石油醚(60～90)，攪拌振搖，濾過，殘渣精密加入甲醇-鹽酸(100∶1)混合溶液50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇-鹽酸(100∶1)補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.3 陰性對照溶液的制備 取奇白消軟膏(缺黃連)陰性對照，按照“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備得缺黃連的陰性對照溶液。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品(批號：20210616-1)0.5 g，精密稱定，共6份，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備；按“2.2.1.1”色譜條件下進(jìn)樣，測定峰面積，計算鹽酸小檗堿的含量。結(jié)果見表4，鹽酸小檗堿含量的RSD為1.80%，表明該方法的重現(xiàn)性較好。

表4 重復(fù)性試驗(yàn) (n=6)

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下1號供試品溶液，于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h進(jìn)樣，記錄鹽酸小檗堿峰面積，計算RSD值。由表5可知，鹽酸小檗堿峰面積的RSD為0.38%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品(批號：20210616-2)0.5 g，精密稱定，共6份，計算得鹽酸小檗堿含量為(3.1629 mg/g)，分別精密加入鹽酸小檗堿(0.2741 mg/mL)的對照品溶液5 mL，定容，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣，測定峰面積，計算回收率。由表6可知，鹽酸小檗堿平均加樣回收率為99.93%，RSD值為0.95%，表明該方法的準(zhǔn)確度較好。

表6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.2.6 樣品含量測定 取黃連藥材、批次奇白消軟膏(批號：20210616-1、20210616-2)樣品各1份，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并取“2.2.1.2”項(xiàng)下對照品溶液，按“2.2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計算指標(biāo)成分的含量，結(jié)果見表7。處方中，黃連80 g，總量1000 g，轉(zhuǎn)移率為63.51%，計算公式如下：

表7 樣品含量測定

3 討論

奇白消軟膏是以大量凡士林為輔料制成的稠膏劑，對薄層鑒別及含量測定帶來一定難度，本實(shí)驗(yàn)首先考慮的是去除凡士林而不影響檢測結(jié)果。

冰片作為一種佐劑，在燒傷、止痛去癢等皮膚疾病中應(yīng)用廣泛[4]，屬單萜化合物，在乙醚、氯仿、石油醚等親脂性溶劑中極易溶解，與凡士林溶解性相似。因此，在樣品前處理的過程中易把冰片一并去除，故未對奇白消軟膏中冰片進(jìn)行薄層鑒別研究。

薄層鑒別中，本試驗(yàn)采用不同展開劑加以篩選優(yōu)化。在黃連的薄層鑒別中，本文比較了2020版藥典展開系統(tǒng)Ⅰ：環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)、展開系統(tǒng)Ⅱ：苯-乙酸乙酯-異濃丙醇-甲醇-濃氨(12∶6∶3∶3∶1)[5]和自制的展開系統(tǒng)Ⅲ：正丁醇-乙醇-冰乙酸-水(4∶1∶2∶1)三種不同展開劑對色譜情況的影響，研究發(fā)現(xiàn)展開系統(tǒng)Ⅰ和Ⅲ分離良好，斑點(diǎn)分度更大，陰性無干擾，均可作為齊白消軟膏中黃連的薄層鑒別展開系統(tǒng)。

2020版中國藥典，人工牛黃中牛膽粉的鑒別使用的展開系統(tǒng)為甲苯-冰醋酸-水(7.5∶10∶0.3)，趙薩茹拉[6]在蒙藥方劑古日古木-13中的西紅花和人工牛黃的薄層色譜定性鑒別研究中，鑒別人工牛黃采用相同的展開系統(tǒng)。本試驗(yàn)嘗試比較了甲苯-冰醋酸-水(7.5∶10∶0.3)、正己烷-乙酸乙酯-醋酸-甲醇(20∶25∶2∶3)和石油醚-乙酸乙酯-甲酸(2∶10∶0.2)三種不同展開系統(tǒng)對色譜情況的影響，發(fā)現(xiàn)三種展開系統(tǒng)均可分離，在展開系統(tǒng)甲苯-冰醋酸-水(7.5∶10∶0.3)為展開劑中展開，樣品斑點(diǎn)和對照品斑點(diǎn)不在同一條直線上，原因可能是黃連的干擾。正己烷-乙酸乙酯-醋酸-甲醇(20∶25∶2∶3)中展開，斑點(diǎn)分離的好、清晰，比移值合適，優(yōu)選該系統(tǒng)作為齊白消軟膏中人工牛黃的薄層鑒別展開系統(tǒng)。

黃連中鹽酸小檗堿含量測定采用藥典方法并適當(dāng)優(yōu)化，檢測波長為345 nm；調(diào)整流動相為乙腈：0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0)比例為30∶70。結(jié)果表明，樣品中各峰分離完全，鹽酸小檗堿峰形對稱，陰性無干擾，該法專屬性良好。

綜上所述，本研究所建立的方法簡便易行、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為奇白消軟膏的質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了科學(xué)依據(jù)，為進(jìn)一步制劑開發(fā)和臨床應(yīng)用奠定了藥學(xué)基礎(chǔ)。