黃芪、木香微型飲片切制工藝優(yōu)選

林桂梅 來有雪 鞠成國(guó) 侯 斌

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥炮制技術(shù)傳承基地(遼寧)，遼寧 大連 116600；3.大連市第六人民醫(yī)院，遼寧 大連 116600

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch)Bge.的干燥根[1]。木香為菊科植物木香AucklandialappaDecne.的干燥根[1]。黃芪、木香雖均為根入藥，但性狀上有所區(qū)別，黃芪為長(zhǎng)30～90 cm，直徑1～3.5 cm的根，木香則為長(zhǎng)5～10 cm，但直徑為0.5～5cm的根。臨床上，黃芪、木香均需要切成厚片才能入藥，可以說中藥飲片是中藥最基本的入藥形式[2]。藥典對(duì)厚片的切制厚度規(guī)定為2～4 mm，但飲片廠生產(chǎn)中對(duì)其切制規(guī)格不易掌控，并且各地飲片切制方法不一，導(dǎo)致臨床上黃芪、木香切制質(zhì)量差異較大，這些極大地制約了黃芪和木香飲片的臨床用藥。為了制出質(zhì)優(yōu)、型精的飲片，課題組提出微型飲片概念[3-6]。微型飲片較常規(guī)飲片粒徑細(xì)，比細(xì)粉粗，依然可以保持中藥材固有的藥效學(xué)基礎(chǔ)。以此為基礎(chǔ)，選取黃芪、木香藥材，以飲片粒徑、片厚、潤(rùn)制時(shí)間和干燥方式為因素，以飲片的流動(dòng)性、浸出物含量、指標(biāo)性成分含量等為指標(biāo)，對(duì)黃芪、木香微型飲片的切制工藝進(jìn)行優(yōu)化，為微型飲片的研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 日本島津LC-20AT液相色譜儀(SPD-M20A 檢測(cè)器，CAD檢測(cè)器，LC-20AB 泵，CTO-20A柱溫箱，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，CBM-20A數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換模器)；島津 LC-Solution色譜數(shù)據(jù)工作站；METTLER AE240型十萬分之一分析天平(瑞士METTLER)；FA1004B電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；YP5102型電子天平(上海光正醫(yī)療有限公司)。DHF-200手提式高速萬能打粉機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；HITECH純水儀(上海和泰儀器有限公司)。

A.對(duì)照品；B.樣品；1.黃芪甲苷

A.對(duì)照品；B.樣品；1.毛蕊異黃酮葡萄糖苷

A.對(duì)照品；B.樣品；1.木香烴內(nèi)酯；2.去氫木香內(nèi)酯

1.2 試藥 黃芪藥材購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定為蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根；木香藥材購(gòu)自云南，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定為菊科植物木香AucklandialappaDecne.的干燥根。黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品(成都德思特生物技術(shù)有限公司，批號(hào)84687-43-4、20633-67-4)、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品(上海永恒生物科技有限公司，批號(hào)553-21-9、20140421)，甲醇、乙腈(均為色譜純)，超純水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 黃芪甲苷、毛蕊異黃酮：精密稱取黃芪甲苷、毛蕊異黃酮對(duì)照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含黃芪甲苷0.505 mg、毛蕊異黃酮0.143 mg的溶液，即得。

木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯：精密稱取木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品適量，加甲醇制成每 1 mL 含木香烴內(nèi)酯0.208 mg、去氫木香內(nèi)酯0.372 mg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備[1]黃芪甲苷：取樣品中粉約4 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)铀?0 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀? mL使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂(內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為12 cm)，以水50 mL洗滌，棄去水液，再用40%乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯：毛蕊異黃酮葡萄糖苷：取本品粉末(過四號(hào)篩)約1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流4 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

取樣品粉末(過四號(hào)篩)約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，放置過夜，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 測(cè)定條件[1]黃芪甲苷色譜柱：Diamonsil C18(5 μm，200 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相：乙腈-水(32∶8)；流速：1 mL/min；電霧式檢測(cè)器檢測(cè)；進(jìn)樣量：10 μL。HPLC圖如圖1所示。

毛蕊異黃酮葡萄糖苷色譜柱：Diamonsil C18(5 μm，200 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.2%甲酸水溶液(B)梯度洗脫；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；進(jìn)樣量：10 μL。梯度洗脫條件見表1，HPLC圖如圖2所示。

表1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷梯度洗脫條件

木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯[7]色譜柱：Diamonsil C18(5 μm，200 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相：甲醇-水(65∶35)；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：225 nm；進(jìn)樣量：10 μL。HPLC圖如圖3所示。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 線性范圍考察 精密吸取濃度為0.5050 mg/mL的黃芪甲苷對(duì)照品溶液1 μL、2 μL、4 μL、8 μL、10 μL、15 μL；精密吸取濃度為0.0480 mg/mL的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液1 μL、2 μL、4 μL、8 μL、10 μL、15 μL；精密吸取濃度為0.208 mg/mL的木香烴內(nèi)酯對(duì)照品溶液1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL；精密吸取濃度為0.372 mg/mL的去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品溶液1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL，注入高效液相色譜儀中，測(cè)定峰面積。對(duì)照品進(jìn)樣量(Y)為橫坐標(biāo)，峰面積(X)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程見表2。

表2 線性關(guān)系結(jié)果

2.1.4.2 精密度試驗(yàn) 黃芪甲苷：精密吸取同一供試品溶液10 μL，按2.1.3項(xiàng)下操作，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，測(cè)定供試品中黃芪甲苷峰面積的RSD為2.0%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

毛蕊異黃酮葡萄糖苷：精密吸取同一供試品溶液10 μL，按2.1.3項(xiàng)下操作，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，測(cè)定供試品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD為0.9%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯：精密吸取同一供試品溶液10 μL，按2.1.3項(xiàng)下操作，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，測(cè)定供試品中木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯峰面積的RSD分別為2.0%、1.9%、結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 黃芪甲苷：精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h進(jìn)樣分析，按2.1.3項(xiàng)下操作，測(cè)定色譜峰面積的RSD分別為2.0%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

毛蕊異黃酮葡萄糖苷：精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于0 h，1 h，2 h，4 h，8 h，24 h進(jìn)樣分析，按2.1.3項(xiàng)下操作，測(cè)定色譜峰面積的RSD分別為2.0%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯：精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h進(jìn)樣分析，按2.1.3項(xiàng)下操作，木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯含量，測(cè)定色譜峰面積的RSD分別為1.7%、1.6%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 黃芪甲苷：取同一樣品6份，按2.1.2及2.1.3項(xiàng)下操作，分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定各樣品中黃芪甲苷的平均含量為0.041%，RSD為1.9%。

毛蕊異黃酮葡萄糖苷取同一樣品6份，按2.1.2及2.1.3項(xiàng)下操作，分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定各樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均含量為0.031%，RSD為1.7%。

木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯：取同一樣品6份，按2.1.2及2.1.3項(xiàng)下操作，分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定各樣品中木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的平均含量分別為2.32%、1.96%，RSD分別為1.8%、1.7%。

2.1.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 黃芪甲苷：取已知含量黃芪樣品6份，每份0.5 g，精密稱定，分別加入0.157 g/L的黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)液10 mL，按照2.1.2黃芪項(xiàng)下操作，配制成6份加樣的供試品溶液，在上述色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率，結(jié)果黃芪甲苷的加樣回收率為99.19%，RSD為2.4%。

毛蕊異黃酮葡萄糖苷：取已知含量的黃芪樣品6份，每份0.1 g，精密稱定，分別加入1.41 g/L的毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)液2 mL，按照2.1.2黃芪項(xiàng)下操作，配制成6份加樣的供試品溶液，在上述色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷的加樣回收率為98.18%，RSD為1.7%。

木香烴內(nèi)酯：取已知含量的木香樣品6份，每份0.1 g，精密稱定，分別加入0.102 g/L的木香烴內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)液2 mL，按照2.1.2木香項(xiàng)下操作，配制成6份加樣的供試品溶液，在上述色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率，結(jié)果木香烴內(nèi)酯的加樣回收率為98.32%，RSD為1.4%。

去氫木香內(nèi)酯：取已知含量的木香樣品6份，每份0.1 g，精密稱定，分別加入1.261 g/L的去氫木香內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)液2 mL，按照2.1.2木香項(xiàng)下操作，配制成6份加樣的供試品溶液，在上述色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率，結(jié)果去氫木香內(nèi)酯的加樣回收率為99.12%，RSD為1.7%。

2.2 浸出物的含量測(cè)定[1]黃芪：取供試品4g，精密稱定，置250 mL錐形瓶中，精密加水100 mL，密塞，冷浸，前6 h內(nèi)時(shí)時(shí)振搖，再靜置18 h，用干燥濾器迅速濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，稱定重量。以干燥品計(jì)算水溶性浸出物含量。

木香：取供試品2 g，精密稱定，置250 mL錐形瓶中，精密加70%乙醇100 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿，在水浴上蒸干后，105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，以干燥品計(jì)算醇溶性浸出物含量。

2.3 休止角的測(cè)定[8-10]傾斜法，于矩形盒內(nèi)裝滿樣品飲片，松實(shí)程度適中，將盒逐漸傾斜至粉體開始流出為止，盒子傾斜的角度即為休止角。設(shè)傾斜角的高為H，傾斜角的底邊為L(zhǎng)。按照下面公式計(jì)算休止角：tanθ=H/L，算出θ值即為休止角。

3 黃芪、木香微型飲片切制工藝優(yōu)選[11-13]

3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選取飲片粒徑(A)、片厚(B)、潤(rùn)制時(shí)間(C)、干燥方式(D)四個(gè)因素，每個(gè)因素分別設(shè)3個(gè)水平，不考慮交互作用，選用L9(3)4正交表安排實(shí)驗(yàn)，黃芪、木香微型飲片切制工藝因素水平安排分別見表2、表3，按2.1、2.2及2.3項(xiàng)下方法分別測(cè)定黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯含量，樣品浸出物含量及休止角。按照綜合加權(quán)評(píng)分法進(jìn)行綜合評(píng)分與分析，黃芪微型飲片切制工藝中選擇黃芪甲苷權(quán)重系數(shù)為30，毛蕊異黃酮葡萄糖苷權(quán)重系數(shù)為30，醇溶性浸出物權(quán)重系數(shù)為30，休止角權(quán)重系數(shù)為10，綜合評(píng)分=30×黃芪甲苷/黃芪甲苷最大值+30×毛蕊異黃酮葡萄糖苷/毛蕊異黃酮葡萄糖苷最大值+30×浸出物/浸出物最大值+10×休止角最小值/休止角；木香微型飲片切制工藝中選擇木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯含量總和權(quán)重系數(shù)為40，醇溶性浸出物權(quán)重系數(shù)為40，休止角權(quán)重系數(shù)為20，綜合評(píng)分=40×木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯含量總和/木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯含量總和最大值+40×浸出物/浸出物最大值+20×休止角/休止角最大值。

表3 因素水平表(黃芪)

3.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)方法按正交表安排進(jìn)行試驗(yàn)，正交試驗(yàn)測(cè)定數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果，黃芪分別見表4、表5，枳殼分別見表6、表7。

表4 因素水平表(木香)

表5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(黃芪)

表6 方差分析表(黃芪)

表7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(木香)

表8 方差分析表(木香)

3.3 綜合分析 在黃芪微型飲片切制工藝中，因素B對(duì)結(jié)果有顯著影響，而因素A、C、D對(duì)結(jié)果無顯著影響。極差分析認(rèn)為各因素的主次順序是B>C>A>D，由此確定最佳的工藝條件為A3B3C1D2。在木香微型飲片切制工藝中，極差分析認(rèn)為各因素的主次順序是A>D>B>C，由此確定最佳的工藝條件為A3B3C3D2。

4 討論

飲片的軟化方式極大地影響飲片的質(zhì)量，一直有“三分刀功七分潤(rùn)”的說法。大多數(shù)植物藥均需要軟化后切制，本實(shí)驗(yàn)在正式實(shí)驗(yàn)之前進(jìn)行了泡潤(rùn)軟化、蒸制軟化、減壓軟化、烘箱烘制軟化等多種軟化方法的預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終確定泡潤(rùn)軟化的方法。實(shí)驗(yàn)中考察微型飲片的流動(dòng)性選取休止角作為一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)，也是為下一步尋找適合微型飲片加工設(shè)備，初步建立微型飲片切制工業(yè)生產(chǎn)線做準(zhǔn)備。

微型飲片與傳統(tǒng)飲片相比，大大增加飲片與溶媒接觸面積，可提高有效成分煎出率。同時(shí)微型飲片還可避免藥材細(xì)粉在煎煮過程中出現(xiàn)粘鍋、煳化現(xiàn)象。結(jié)合木香自身的形狀和硬度，并且根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取木香飲片的切制粒徑水平進(jìn)行考察。通過前期的煎膏率實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，木香微型飲片煎出的有效成分的含量均高于傳統(tǒng)飲片，有的甚至高出傳統(tǒng)飲片的三倍甚至更多。參考相關(guān)文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，有理由認(rèn)為由于飲片粒徑變小，相同質(zhì)量的飲片與提取溶劑的接觸面積增大，所以有效成分的溶出更多。

實(shí)驗(yàn)通過對(duì)木香微型飲片大小水平的考察發(fā)現(xiàn)，飲片在一定粒徑范圍內(nèi)，浸出物含量及有效成分會(huì)隨著粒徑的減小而增加。有研究[14-18]發(fā)現(xiàn)如果飲片過小，煎煮過程中易出現(xiàn)糊鍋及不易過濾的情況。微型飲片在外形上較傳統(tǒng)飲片粒徑小，比細(xì)粉粗。這可以保證微型飲片仍然保有傳統(tǒng)飲片的藥效前提下，盡量提高飲片利用率。

黃芪作為臨床常用大宗中藥材之一，其藥用歷史已有2000年之久，但隨著日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求，黃芪野生資源幾近枯竭，栽培品種因?yàn)樯L(zhǎng)環(huán)境等諸多限制，難以滿足市場(chǎng)需求[19]。那么在有限的黃芪藥材資源前提下，如何最大限度提高飲片利用率，成為目前亟需解決的問題。微型飲片以飲片的形制變革為外在形式，有效成分的提取更完全，煎出率更高為內(nèi)在優(yōu)勢(shì)，為提高黃芪飲片的利用率開辟了一條新的道路。

5 結(jié)論

通過正交設(shè)計(jì)，優(yōu)選黃芪、木香微型飲片切制條件為潤(rùn)制4 h，切制粒徑為7～8 mm，厚度為4 mm，采用陰干方法干燥。由黃芪、木香微型飲片切制工藝結(jié)果可見，微型飲片化大為小，增加了飲片的流動(dòng)性，并且在保留藥材原有的藥效與性狀同時(shí)，更能提高藥材中有效成分的煎出率，這些為下一步實(shí)現(xiàn)智能調(diào)劑和智能煎煮提供參考。