水仙環(huán)素通過調控PLK1/AKT 信號通路誘導三陰性乳腺癌細胞周期阻滯和凋亡

郭秋生 湯婉芬 周師師 鄭志堅 呂仙梅

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是全球女性癌癥相關死亡的主要原因[1]。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC） 約占全部乳腺癌的15%～20%，侵襲和轉移能力強，復發(fā)率高，預后差[2]。水仙環(huán)素（Narciclasine，Nas）是一種在水仙花和其他開花植物中發(fā)現(xiàn)的天然化合物，具有抗腫瘤和抗炎活性[3]。Nas 的抗腫瘤活性與調節(jié)多個信號通路有關[4]。然而，Nas 抑制TNBC 的機制仍有待深入研究。PLK1（Polo-like kinase 1）是PLK 家族的一種蛋白，在細胞有絲分裂調節(jié)、胞質分裂誘導和DNA 損傷的調節(jié)中發(fā)揮重要作用，是DNA 復制過程中維持基因組穩(wěn)定性的一個重要因子[5]。AKT（又名protein kinase B，PKB）蛋白參與調節(jié)骨骼肌細胞的凋亡、增殖和代謝[6]。PLK1 是AKT 的上游激酶[7]，抑制PLK1/AKT信號通路可抑制腫瘤的生長[8]。本研究擬探索Nas 通過PLK1/AKT 信號通路誘導TNBC 細胞凋亡及細胞周期阻滯的機制，現(xiàn)報道如下。

1 實驗材料

1.1 細胞株 人TNBC 細胞株MDA-MB-231 購自上海中科院細胞庫，經STR（Specialized Technology Resources）鑒定無誤（目錄號：SCSP-5043），使用含10%胎牛血清的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基，置于溫度為37 ℃、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器 RPMI-1640 細胞培養(yǎng)基（Gibco，批號8122270）、胎牛血清（BI，批號2120140）、細胞增殖-毒性檢測試劑盒（CCK-8，Biosharp，批號K101816133EF5E）、雙染細胞凋亡檢測試劑盒（Biosharp，批號A11243）、細胞周期檢測試劑盒（Biosharp，批號A10431）；cle-Caspase-3（abcam，批號GR3220493-3）、PARP（cell singling，批號9542S）、cle -PARP （proteintech， 批 號 GB111503）、PLK1（abcam，批號GR3361528-4）、PI3K（affinity，批號AF6241）、p -PI3K （affinity， 批 號 AF3242）、AKT（abcam，批號GR240003-99）、p-AKT（huabio，批號ET-1607-73）、CDK1（servicebio，批號GB11398-100）、Cyclin B（epitmics，批號AF6168）、Cyclin A（servicebio，批號FNab02094）、p-21（cell singling，批號2946S）、p-27（cell singling，批號GB112176）、p-62（proteintech，批號18420-1-AP）、LC3（proteintech，批 號14600 -1 -lg）、γ -H2AX （servicebio， 批 號GB111841）、GAPDH（proteintech，批號60004-1-lg）。流式細胞儀（BD，F(xiàn)ACSVia）、全自動凝膠圖像分析系統(tǒng)（BIO-RAD，ChemiDocTM XRS+）為本實驗室提供。

2 實驗方法

2.1 CCK-8 檢測細胞活力 以3000 細胞/孔的密度將MDA-MB-231 細胞接種在96 孔板中，待細胞貼壁后，按照0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、6.40 μmol/L 的濃度梯度依次加入Nas，在藥物處理的第24 h、48 h、72 h 加入100 μL 的CCK-8 工作液，每組設置3 個復孔，37 ℃避光孵育2 h，使用酶標儀檢測各孔光密度（OD）值，檢測波長設置為450 nm。運算公式如下：存活率=[1-（對照組OD 值-實驗組OD 值）/（對照組OD 值-空白組OD 值）]×100%，抑制率=100%-存活率。

2.2 實驗分組 根據上述CCK-8 檢測結果，按照如下Nas 濃度進行實驗：Control 組予完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；低劑量（抑制率約25%）、中劑量（抑制率約35%）、高劑量（抑制率約50%）組分別用含Nas 0.5、1.0、2.0μmol/L的含藥培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

2.3 克隆形成實驗 將適當密度的MDA-MB-231細胞接種在6 孔板中，待細胞貼壁后，分別用含Nas 0.5、1.0、2.0 μmol/L 的含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，消化計數后再以500 細胞/孔的濃度接種在6 孔板中，RPMI-1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2 周，棄上清，通用型組織固定液固定，結晶紫染色后拍照記錄。

2.4 Transwell 實驗 將適當密度的MDA-MB-231細胞接種在6 孔板中，待細胞貼壁后，分別用含Nas 0.5、1.0、2.0 μmol/L 的含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，消化計數后按照1×105細胞/mL 的密度用無血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基配制細胞懸液，每個小室上層接種200μL，而下室加入RPMI-1640 完全培養(yǎng)基600 μL，置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，取出小室，用通用型組織固定液固定小室底部細胞20 min，再用結晶紫溶液染色20 min，將小室置于通風櫥風干2 h，用顯微鏡觀察并拍照記錄。

2.5 流式細胞分析儀檢測細胞株的凋亡率 以5×105細胞/孔的密度將MDA-MB-231 細胞均勻接種于6 孔板中，待細胞貼壁后，分別用含Nas 0.5、1.0、2.0 μmol/L 的含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h 及72 h，用1 mL預冷的PBS 緩沖液輕輕吹打重懸細胞并計數，4 ℃、1500 r/min 離心5 min，吸除上清，重復上述操作2遍，按照試劑商說明書要求處理細胞后上機檢測。Annexin V-FITC 鏡下呈現(xiàn)綠色熒光，PI 為呈現(xiàn)紅色熒光。

2.6 流式細胞分析儀檢測細胞株的細胞周期 以5×105細胞/孔的密度將MDA-MB-231 細胞均勻接種于6 孔板中，待細胞貼壁后，分別用含Nas 0.5、1.0、2.0 μmol/L 的含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，用1 mL 4 ℃條件下預冷的PBS 緩沖液沖洗，按照試劑商說明書要求處理細胞后上機檢測。

2.7 Western blot 實驗檢測相關蛋白質的表達 以5×105細胞/孔的密度將MDA-MB-231 細胞均勻接種于6 孔板中，待細胞貼壁后，分別用含Nas 0.5、1.0、2.0 μmol/L 的含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，用1 mL 4 ℃條件下預冷的PBS 緩沖液沖洗，使用RIPA 裂解液提取各細胞的總蛋白，BCA 法檢測各蛋白濃度，調整為濃度一致的總蛋白溶液后分別加入5×loading buffer 溶液，100 ℃金屬浴10 min 完成變性。使用預制的SDS-PAGE 凝膠完成電泳，濕轉法轉移至PVDF 膜上后用TBST 漂洗，室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h，再次漂洗后加入一抗孵育過夜。次日再次漂洗后加入二抗室溫孵育2 h，使用全自動凝膠圖像分析系統(tǒng)顯影。

2.8 統(tǒng)計學方法 應用Graphpad Prism 8.0 軟件分析實驗數據并作圖，各項檢測結果呈正態(tài)分布，均以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA），兩組之間的比較采用Bonferroni 校正的t 檢驗，P＜0.05認為差別具有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 Nas 對MDA-MB-231 細胞增殖的影響 使用CCK-8 方法檢測Nas 對MDA-MB-231 細胞的抑制率，可知Nas 對MDA-MB-231 細胞具有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)出了一定程度的時間-劑量依賴性，見表1。

表1 Nas 對MDA-MB-231 細胞增殖的抑制作用

3.2 Nas 對MDA-MB-231 細胞克隆形成的影響通過克隆形成實驗檢測Nas 對MDA-MB-231 細胞克隆形成能力的影響，與Control 組比較，低劑量組的細胞克隆數量出現(xiàn)了15.99%的抑制；中劑量組細胞克隆抑制率為24.76%；而高劑量組的細胞克隆抑制率達到了54.17%（見圖1）；Nas 可明顯抑制MDAMB-231 細胞的克隆形成能力。

圖1 Nas 對MDA-MB-231 細胞克隆形成能力的影響

3.3 Nas 對MDA-MB-231 細胞侵襲能力的影響通過Transwell 實驗檢測Nas 對MDA-MB-231 細胞侵襲的影響，與Control 組比較，低劑量組的細胞侵襲數量出現(xiàn)了0.68%的抑制；中劑量組的侵襲抑制率為23.20%；而高劑量組的細胞侵襲抑制率達到了45.27%（見圖2）；Nas 可明顯抑制MDA-MB-231 細胞的侵襲能力。

圖2 Nas 對MDA-MB-231 細胞侵襲能力的影響

3.4 Nas 對MDA-MB-231 細胞凋亡的影響 使用流式細胞儀分析Nas 對MDA-MB-231 細胞凋亡的影響，Nas 處理48 h 時，Control 組的凋亡率為3.57%；低劑量組的細胞凋亡率為7.62%；中劑量組的細胞凋亡率為9.94%；而高劑量組的細胞凋亡率為17.65%（見圖3A）；Nas 處理72 h 時，Control 組的凋亡率為4.27%；低劑量組的細胞凋亡率為8.73%；中劑量組的細胞凋亡率為14.73%；而高劑量組的細胞凋亡率為34.57%（見圖3B）；Nas 可明顯誘導MDAMB-231 細胞的凋亡。

圖3 Nas 對MDA-MB-231 細胞凋亡的影響

3.5 流式細胞儀檢測Nas 對MDA-MB-231 細胞周期的影響 使用流式細胞儀分析Nas 對MDA-MB-231 細胞凋亡的影響，Control 組的G1、G2、S 期分別為62.89%、4.98%、32.13%；低劑量組的G1、G2、S 期分別為61.00%、8.74%、30.26%；中劑量組的G1、G2、S 期分別為77.19%、11.98%、10.83%；而高劑量組的G1、G2、S 期分別為56.53%、20.72%、22.75%（見圖4）；Nas 可將MDA-MB-231 細胞的細胞周期阻滯在G2 期。

圖4 Nas 對MDA-MB-231 細胞周期的影響

3.6 Nas 對MDA-MB-231 細胞相關蛋白質表達的影響 MDA-MB-231 細胞分別經不同濃度的Nas處理48 h，Western blot 實驗檢測cle-Caspase-3、PARP、cle-PARP、PLK1、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、CDK1、Cyclin B、Cyclin A、p-21、p-27、p-62、LC3-II/I、γ-H2AX 等蛋白質表達的影響。與Control 組比較，Nas 可以顯著促進cle-Caspase-3、cle-PARP、p-21、p-27 及γ-H2AX 等蛋白質的表達，顯著抑制PLK1、p-PI3K、p-AKT、CDK1、Cyclin B 等蛋白質的表達水平（P＜0.05），而對p-62、LC3-Ⅱ/Ⅰ等蛋白質的表達水平影響不明顯（見圖5）。

圖5 Nas 對MDA-MB-231 細胞相關蛋白質表達的影響

4 討 論

2020 年，乳腺癌已成為發(fā)病率最高的惡性腫瘤[9]。根據雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，Her-2）表達情況，乳腺癌可分為四種不同的亞型。TNBC 約占全部乳腺癌的10%～15%，具有ER、PR、Her-2 表達缺失的特點[10]。流行病學資料顯示，TNBC 多發(fā)生在40 以下的絕經前年輕女性，與其他亞型乳腺癌相比，TNBC 患者的生存時間較短，確診后前5 年內的死亡率為40%[11]。TNBC 有高度侵襲性，大約46%的TNBC 患者會有遠處轉移。由于其特殊的分子表型，TNBC 對內分泌治療或分子靶向治療不敏感，化療是TNBC 患者的主要治療手段，因化療藥物有較強的毒副反應，且臨床反應有限，故臨床應用收到一定的限制[12]。因此，開發(fā)新的藥物和治療方法對TNBC 至關重要。

Nas 是一種在水仙花和其他開花植物中發(fā)現(xiàn)的天然化合物，屬于石蒜科，具有抗腫瘤和抗炎活性[3，13]。Nas 在體外對多種腫瘤細胞具有抑制增殖和促凋亡的作用，在體內可縮小腫瘤體積或抑制腫瘤生長。它抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡及自噬、抑制腫瘤血管生成、抑制腫瘤轉移[14-15]。Nas 影響多個分子和信號通路，如Caspases 家族蛋白、VEGFR2 蛋白、FAK 信號通路、AKT/mTOR 信號通路、Akt/IKK/NF-κB 和JNK信號通路等[16-19]。

PLK1 屬Polo 樣激酶家族，是一類在真核細胞中廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸激酶，可通過其激酶活性影響多種底物，進而調節(jié)細胞有絲分裂、胞質分裂、DNA 損傷應答及發(fā)育等過程[5]。PLK1 在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及神經母細胞瘤等[20]，其表達水平與細胞高增殖率、高轉移潛能及預后差相關[21-22]。TNBC 中PLK1 呈高表達，并且PLK1 水平升高與腫瘤淋巴結轉移、臨床分期晚及預后不良相關，是TNBC 不良預后的標志之一[23]。先前研究已經證明，抑制PLK1 的表達會導致G2/M 期阻滯、有絲分裂紡錘體缺陷和有絲分裂受阻，從而使細胞對凋亡信號敏感[24]。在體外實驗中也證實抑制PLK1 后，乳腺癌細胞的克隆形成能力、遷移能力及侵襲能力等均受到抑制[25]。

PLK1 是AKT 的上游激酶，研究顯示，PLK1 與PI3K/AKT、MAPK、Notch 等信號通路共同調節(jié)DNA損傷、轉錄、細胞周期、細胞凋亡等，導致惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[26-27]。AKT 是一種調節(jié)細胞存活、增殖、生長、凋亡和糖原代謝的絲氨酸/蘇氨酸激酶，可通過Thr308 或Ser473 位點活化并磷酸化GSK3β、Bcl-2等相關死亡啟動子[28]。p-AKT 通過干擾mTOR 的正常調控機制，進而參與細胞凋亡、增殖和細胞運動。過表達p-AKT 被認為是惡性腫瘤治療的靶點[29]。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Nas 可通過促進cle-Caspase-3、cle-PARP、p-21、p-27 蛋白的表達，抑制PLK1、p-PI3K、p-AKT、CDK1、Cyclin B 等蛋白的表達水平，使細胞周期阻滯于G2 期，進而抑制TNBC細胞的增殖、克隆形成、侵襲能力，促進其凋亡。從而說明，Nas 可通過PLK1/AKT 信號通路誘導MDAMB-231 細胞周期阻滯和凋亡。p-62、LC3-II/I 的表達水平未出現(xiàn)明顯變化，說明Nas 并未誘導MDAMB-231 細胞產生自噬。γ-H2AX 的表達水平在Nas低劑量、中劑量組中未出現(xiàn)顯著變化，而在Nas 高劑量組中出現(xiàn)升高，說明高劑量的Nas 可導致MDAMB-231 細胞出現(xiàn)DNA 損傷，從而進一步發(fā)揮抗腫瘤作用。在課題組的后續(xù)研究中，我們擬通過Rescue實驗，即過表達PLK1，然后再觀測Nas 對TNBC 細胞相關表型，如細胞凋亡和細胞周期，及相關蛋白質表達的影響，進一步驗證Nas 通過PLK1/AKT 信號通路促進TNBC 細胞凋亡及細胞周期阻滯的作用機制，為中醫(yī)藥治療惡性腫瘤提供更多的理論依據。