溫肺降濁方對(duì)血管性癡呆模型大鼠ERK1/2信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

宋晨曦,張 鼎,胡芷涵,姜明賀,李方存,胡躍強(qiáng)

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530001;2.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203;3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530023)

血管性癡呆(Vascular dementia,VaD)是癡呆的常見類型之一,是由缺血性或出血性腦血管疾病引起低血流灌注導(dǎo)致的一種癡呆類型[1]。其臨床表現(xiàn)以認(rèn)知障礙為主,伴隨運(yùn)動(dòng)異常、行為癥狀以及自主神經(jīng)功能障礙等[2-4]。VaD的形成因素較為復(fù)雜,病因病機(jī)尚未可知[5]。多數(shù)學(xué)者指出,炎癥因子、神經(jīng)遞質(zhì)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞自噬等共同發(fā)揮作用導(dǎo)致了VaD的發(fā)生[6-9]。

《素問·宣明五氣》曰：“心藏神,肺藏魄,肝藏魂,脾藏意,腎藏志。是謂五臟所藏?！蔽迮K中任何一臟的功能失調(diào),都會(huì)引起癡呆的發(fā)生。故歷代醫(yī)家基于藏象學(xué)說的系統(tǒng)理論,運(yùn)用中醫(yī)學(xué)整體觀念和辨證論治的基本特點(diǎn),從不同角度以不同方藥來論治癡呆,為后世預(yù)防和治療癡呆積累了大量寶貴的臨床經(jīng)驗(yàn)。鑒于VaD病理機(jī)制的復(fù)雜性與其所致多個(gè)臟器同病、多種危險(xiǎn)因素并存的病理特點(diǎn)和中醫(yī)防病、治病的理論體系相符,故中醫(yī)在治療VaD上有著明顯的優(yōu)勢,而中藥因其具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的系統(tǒng)優(yōu)勢,對(duì)于VaD的預(yù)防和治療也有著重要的意義[10-11]。本研究基于ERK1/2信號(hào)通路,通過探討溫肺降濁方是否抑制Calpain、Bad蛋白表達(dá),上調(diào)Bcl-xl蛋白表達(dá)量,從而發(fā)揮治療血管性癡呆的藥效作用,以期為中醫(yī)藥預(yù)防和治療VaD提供新的思路和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康級(jí)成年雄性SD大鼠(n=30)購自于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(湘)2019-0004,飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房,所有動(dòng)物常規(guī)護(hù)理,自由飲食,室溫保持在(23.0±3.0)℃,濕度保持在(45.0±10.0)%,間隔3 d測量大鼠體重并記錄。本研究經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn);倫理批號(hào)DW20230425-105。

1.1.2 藥物與試劑：溫肺降濁方由制附子20 g(先煎),黨參15 g,干姜、田七、酒大黃各10 g,炙甘草6 g組成。所有藥物購買于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診中藥房,本方分2 次煎煮,取汁200 ml,加熱濃縮至含有原藥材1.5 g/ml。蘇木色精,Solarbio,批號(hào) H8070;伊紅Y(水溶),Solarbio,批號(hào) E8090;無水乙醇、二甲苯,國藥集團(tuán),批號(hào)10009218、10023418;中性樹膠,國藥集團(tuán),批號(hào)10004160;彩虹180廣譜蛋白Marker(11-180 KD),Solarbio,批號(hào)PR1910;ERK1/2抗體、Calpain抗體、Bad抗體、Bcl-xl抗體,英國Abcam,批號(hào)分別為ab184699、ab108400、ab32445、ab32370。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：全波長酶標(biāo)儀系統(tǒng),美國賽默飛世爾科技;正置顯微鏡,奧林巴斯BX53型生物顯微鏡等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型建立：適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠2周,體重(250±30) g。大鼠通過永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞(2 VO)建立VaD大鼠模型。具體方法[12]：用40 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)麻醉大鼠,經(jīng)頸部正中切口暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈,輕輕分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng),用6-0 號(hào)絲線結(jié)扎雙側(cè)血管。假手術(shù)組只暴露動(dòng)脈不進(jìn)行結(jié)扎。整個(gè)手術(shù)過程操作輕柔,減少觸碰迷走神經(jīng),術(shù)后用加熱毯維持大鼠體溫。

1.2.2 分組與給藥：隨機(jī)分為五組,假手術(shù)組、模型組、溫肺降濁方低、中、高劑量組(n=3)。模型組和假手術(shù)組予以等體積蒸餾水灌胃,溫肺降濁方低、中、高劑量組分別以1.5 g/kg藥物濃度,灌胃1.5、3、6 ml,持續(xù)8周。末次給藥后,各組大鼠禁食禁水24 h,1%戊巴比妥鈉腹腔過量麻醉。各組分別取3只進(jìn)行心臟灌注包埋,其余3只立刻斷頭取腦剝離海馬組織,放入凍存管,-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測大鼠行為學(xué)：正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行為期2 d的大鼠游泳尋找逃生平臺(tái)訓(xùn)練,依次從第1～4 象限指定點(diǎn)面向池壁放入水迷宮中,于60 s內(nèi)成功停留站臺(tái),即完成實(shí)驗(yàn);若60 s未成功找到站臺(tái),人工引導(dǎo)停留10 s,第1～2天為訓(xùn)練實(shí)驗(yàn),后3 d記錄逃避潛伏期數(shù)據(jù),以均數(shù)來評(píng)估大鼠空間記憶能力。

1.2.4 HE染色觀察大鼠海馬組織形態(tài)：各組大鼠干預(yù)完成后,取材,固定,脫水后常規(guī)蠟塊包埋,取出包埋好的組織蠟塊,冰凍切片機(jī)切片4 μm左右。進(jìn)行HE染色后脫水、透明、中性樹膠封片,顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.5 免疫組化法檢測大鼠海馬組織中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular-signal regulated kinase,ERK)1/2、Bcl-xl、Bad蛋白表達(dá)：組織切片,梯度酒精脫水、透明,抗原修復(fù),室溫山羊血清封閉30 min,繼續(xù)加入ERK1/2(1∶100)、Bcl-xl(1∶100)、Bad(1∶100)孵育,4 ℃濕盒避光孵育過夜。分別滴加熒光標(biāo)記物,濕盒繼續(xù)室溫孵育1 h,滴加DAPI避光核染,抗熒光淬滅劑封片,倒置熒光顯微鏡采集圖片、數(shù)據(jù)分析。

1.2.6 RT-qPCR法檢測大鼠海馬組織中ERK1/2、Calpain、Bad、Bcl-xl mRNA表達(dá)量：總RNA嚴(yán)格按照Trizol試劑盒試劑的說明提取,微量分光光度計(jì)測定OD值,計(jì)算RNA的純度和濃度。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,反應(yīng)條件：42 ℃、2 min,50 ℃、15 min,85 ℃、5 s,4 ℃、10 min,1 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增程序分為兩步：95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火延伸45 s。以GAPDH為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計(jì)算最終mRNA的相對(duì)表達(dá)量。PCR引物由南寧捷尼斯生物有限公司合成,引物序列見表1。

表1 各基因PCR相關(guān)引物序列

1.2.7 Western blot檢測大鼠海馬組織中ERK1/2、Calpain、Bad、Bcl-xl蛋白表達(dá)：從-80 ℃冰箱取出腦組織,剪出一部分組織放入裝有鋼珠的1.5 ml的EP管中,自動(dòng)制冷勻漿機(jī)勻漿,加RIPA裂解液,加入PMSF蛋白酶抑制劑,BCA蛋白檢測試劑盒進(jìn)行定量分析。根據(jù)分子量制備相應(yīng)分離膠,通過電泳、轉(zhuǎn)膜、5%BSA封閉,TBST洗膜,一抗稀釋比例：ERK1/2(1∶2000)、Calpain(1∶2000)、Bad(1∶2000)、Bcl-xl(1∶2000)孵育,4 ℃過夜;TBST洗膜3次,每次10 min,稀釋二抗比例為(1∶5000),將PVDF膜放置于二抗中,37 ℃搖床孵育1.5 h,TBST洗膜,超敏ECL顯色后曝光,以GAPDH為內(nèi)參,計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠認(rèn)知水平的比較 見表2。術(shù)后4周,模型組和各干預(yù)組大鼠之間逃避潛伏期較假手術(shù)組明顯延長(P<0.05),而穿越平臺(tái)次數(shù)較假手術(shù)組明顯縮短,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),模型組和各干預(yù)組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后8周,模型組和各干預(yù)組大鼠逃避潛伏期較假手術(shù)組明顯延長(P<0.05),穿越平臺(tái)次數(shù)較假手術(shù)組明顯縮短(P<0.05);和模型組比較,溫肺降濁方低劑量組、溫肺降濁方中劑量組逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),溫肺降濁方高劑量組逃避潛伏期明顯縮短,穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠Morris水迷宮測試認(rèn)知能力比較

2.2 各組大鼠海馬組織病理學(xué)變化情況 假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞排列緊湊,形態(tài)規(guī)整,數(shù)量較多;模型組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞排列散亂,形態(tài)極其不規(guī)則,細(xì)胞間質(zhì)染色稀疏,出現(xiàn)部分水腫和細(xì)胞核縮小;各劑量中藥組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量增加,以溫肺降濁方高劑量組改善最為明顯(圖1)。

A：假手術(shù)組;B：模型組;C：溫肺降濁方低劑量組;D：溫肺降濁方中劑量組;E：溫肺降濁方高劑量組

2.3 各組大鼠海馬組織中ERK1/2、Bcl-xl、Bad的陽性蛋白表達(dá)情況比較 見表3(圖2)。與假手術(shù)組相比,模型組大鼠海馬組織ERK1/2、Bad陽性蛋白表達(dá)量升高(P<0.05),Bcl-xl蛋白表達(dá)量下降(P<0.05);和模型組相比,溫肺降濁方中劑量組、溫肺降濁方高劑量組ERK1/2、Bad陽性蛋白表達(dá)量下降(P<0.05),Bcl-xl蛋白表達(dá)量升高(P<0.05),其中以溫肺降濁方高劑量組差異最為顯著。

A：假手術(shù)組;B：模型組;C：溫肺降濁方低劑量組;D：溫肺降濁方中劑量組;E：溫肺降濁方高劑量組

表3 各組大鼠海馬組織中ERK1/2、Bcl-xl、Bad陽性蛋白表達(dá)比較

2.4 各組大鼠海馬組織中ERK1/2、Calpain、Bad和Bcl-xl mRNA表達(dá)比較 見表4。與假手術(shù)組相比,模型組大鼠海馬組織中mRNA的相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)不同程度的上調(diào)或下調(diào),其中,ERK1/2、Calpain、Bad表達(dá)上升(P<0.05);Bcl-xl表達(dá)下降(P<0.05)。使用溫肺降濁方各劑量組進(jìn)行干預(yù)后,ERK1/2、Calpain、Bad表達(dá)下降(P<0.05);Bcl-xl表達(dá)上升(P<0.05)。

表4 各組大鼠海馬組織中各項(xiàng)指標(biāo)mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.5 各組大鼠海馬組織中ERK1/2、Calpain、Bad和Bcl-xl蛋白表達(dá)情況 見表5(圖3)。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠海馬組織中ERK1/2、Calpain和Bad蛋白表達(dá)升高,Bcl-xl蛋白的表達(dá)量降低(P<0.05);與模型組比較,各劑量中藥組大鼠海馬組織中ERK1/2、Calpain和Bad蛋白表達(dá)降低,Bcl-xl蛋白的表達(dá)量升高(P<0.05)。

圖3 各組大鼠海馬組織中蛋白相對(duì)表達(dá)量印跡圖

表5 各組大鼠海馬組織中蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

血管性癡呆在中醫(yī)學(xué)歸屬于“癡呆”“呆病”等范疇,其發(fā)病機(jī)制為痰、虛、瘀等諸多因素相互影響,病位在腦髓,但以腎虛為本[13],治療原則以補(bǔ)虛瀉實(shí)為主[14]。肺與血管性癡呆的聯(lián)系主要與肺主氣、司呼吸的生理功能有關(guān)[15]。若肺宣發(fā)、肅降功能失常,則清氣不能宣發(fā)以滋養(yǎng)腦竅,濁氣不能肅降而上擾清竅,可導(dǎo)致癡呆的發(fā)生[16]。本研究團(tuán)隊(duì)基于大量的前期研究基礎(chǔ)提出,以“肺臟辨治癡呆”的主要思想,認(rèn)為肺金失養(yǎng)是構(gòu)成VaD發(fā)病過程中的關(guān)鍵因素?！鹅`樞》中記載：“肺氣衰,魄離,故言善誤”[17]。這也提示我們肺氣虛衰可能是VaD疾病早期的病因之一,故治療上須以宣通肺金之功,增強(qiáng)溫煦溫化之效為主。因此,溫肺降濁方是治療VaD的關(guān)鍵臨床驗(yàn)方。方中制附子和黨參共用,溫陽行氣,補(bǔ)益上、中二焦;干姜資助肺精,可助附子溫陽;田七活血化瘀,運(yùn)化周身血脈;大黃蕩腸降濁,除陳生新;炙甘草調(diào)和諸藥,緩急補(bǔ)中。諸藥合用,溫補(bǔ)同施,走瀉并用,升降平衡。前期基礎(chǔ)研究提示,本方可以上調(diào)或下調(diào)線粒體相關(guān)蛋白的表達(dá),減少神經(jīng)元凋亡,改善海馬區(qū)突觸損傷,從而提升大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

ERK是MAPK家族中的亞家族,是MEK的唯一下游底物[18],由ERK1激酶和ERK2激酶組成[19],可以被多種因素激活,參與到細(xì)胞凋亡和增殖等過程中來[20]。ERK1/2通路可通過增強(qiáng)Bad表達(dá)、活化Calpain介導(dǎo)等方式啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)源性的凋亡途徑。Calpain被活化后能產(chǎn)生較強(qiáng)的破壞作用,可以裂解Bcl-xl,使其與Bad結(jié)合的功能喪失,導(dǎo)致游離的Bad增多,進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡[21]。同時(shí),Bad又是Bcl-2家族中的重要成員,通過形成線粒體外膜通透性(MOMP)復(fù)合物來啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[22]。此外,鈣依賴性半胱氨酸中性蛋白酶Calpain,具有強(qiáng)烈的破壞作用,其活化后可裂解細(xì)胞結(jié)構(gòu),破壞溶酶體膜、導(dǎo)致細(xì)胞溶解壞死,也可裂解Bcl-xl、使其喪失與Bad結(jié)合的能力,導(dǎo)致游離Bad增多、Caspases蛋白活化,進(jìn)而引起細(xì)胞發(fā)生凋亡[23-25]。

本次研究顯示,成模后大鼠海馬組織ERK1/2、Calpain、Bad蛋白表達(dá)升高,Bcl-xl表達(dá)下調(diào);而經(jīng)過溫肺降濁方干預(yù)后ERK1/2、Calpain、Bad蛋白表達(dá)降低,Bcl-xl表達(dá)上升。此外,溫肺降濁方高劑量組的表達(dá)更加顯著。綜上所述,溫肺降濁方可能是通過促進(jìn)VaD大鼠腦組織ERK1/2通路激活,從而抑制ERK1/2、Calpain、Bad蛋白的表達(dá),上調(diào)Bcl-xl蛋白,進(jìn)一步改善VaD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。