溫肺化纖湯干預(yù)肺纖維化大鼠肺組織中Nrf2含量研究

李少峰，魏興洪，高 潔，蘭智慧，張元兵

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006；2.贛州市南康區(qū)第二人民醫(yī)院，江西 贛州 341411；3.南昌市洪都中醫(yī)院，江西 南昌330006)

肺纖維化(Pulmonary fibrosis，PF)是指因各種原因引發(fā)的彌漫性肺部炎性疾患，病變多累及肺間質(zhì)、肺泡上皮細胞及肺血管，在我國發(fā)病率呈逐漸上升態(tài)勢。肺纖維化是一個進行性、破壞性、基本不可逆的疾病，目前的治療手段效果甚微，確診后平均存活期為2～5年[1-2]。因此，明確肺纖維化發(fā)病機制迫在眉睫，近年來國內(nèi)外專家提出氧化/抗氧化失衡引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)是其發(fā)病重要機制之一[3]，Nrf2/ARE信號通路可調(diào)控抗氧化蛋白及Ⅱ相解毒酶的表達，通過抗氧化而發(fā)揮對機體的保護作用，其作為體內(nèi)重要抗氧化調(diào)節(jié)通路，已成為多學(xué)科研究熱點。

溫肺化纖湯是江西省名中醫(yī)劉良徛教授治療PF臨床經(jīng)驗方，該方傳承于國醫(yī)大師洪廣祥教授“治肺不遠溫”學(xué)術(shù)思想，團隊經(jīng)過多年臨床驗證，臨床療效確切，已獲得國家發(fā)明專利(專利號：ZL201210365678.0)，并由我們牽頭制定《肺痿診療專家共識意見(江西省)》[4]。溫肺化纖湯方由《外科證治全生集》的陽和湯化裁而來，具有溫陽化痰、活血化瘀的作用，前期藥理實驗表明，溫肺化纖湯具有一定的體外抗氧化活性[4-9]，但具體機制不明確，本研究從抗氧化應(yīng)激角度探討溫肺化纖湯的作用機制，闡明其作用靶點，為防治肺纖維化提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD雄性大鼠，SPF級，體重180 g。

1.2 藥物

溫肺化纖湯組成：熟地20 g，肉桂4 g，鹿角霜15 g，麻黃10 g，白芥子10 g，炮姜10 g，桃仁10 g，土鱉蟲10 g，紅花10 g，川芎10 g，地龍10 g。按藥物劑量比例制成溫肺化纖湯投料處方，通過醇提取、揮發(fā)油提取及水提取等工藝流程，萃取、提純藥物成分，濃縮、干燥后制成溫肺化纖湯顆粒劑。該藥由廣東一方制藥有限公司制備和提供。

1.3 試劑及儀器

硫酸博來霉素(MB1039)。胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)比色法測試盒，總超氧化物歧化酶(SOD)比色法測試盒，過氧化氫酶(CAT)比色法測試盒。RNAiso Plus(TaKaRa，9109)、GAPDH、NRF2引物均由福州尚亞生物科技有限公司合成，RIPA強裂解液(凱基，KGP702)，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)(碧云天，P0015L)，封閉液(碧云天，P0023B)，普通PCR儀、蛋白垂直電泳儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、小型垂直電泳槽、酶標儀(美國BIO-BAD公司)，熒光定量PCR儀(美國ABI，7300)。

1.4 分組給藥

適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠1周后，用隨機數(shù)字表法分成模型組和正常組，溫肺化纖湯低、中、高劑量組，每組3只。參考文獻[7]造模方法，建造肺纖維化大鼠模型，即正常組大鼠予以基礎(chǔ)飼料，同時，各組灌服相應(yīng)劑量的溫肺化纖湯顆?；蝻嬘盟?，治療4周。參考文獻[7]相關(guān)資料的干預(yù)劑量，溫肺化纖湯高劑量組為5倍臨床劑量，0.9 g藥物顆粒，溫肺化纖湯中劑量組為3倍臨床劑量，0.54 g藥物顆粒，溫肺化纖湯低劑量組為臨床等效劑量，0.18 g藥物顆粒，建模后第2日起進行3次灌胃，每次3 mL溫肺化纖湯灌胃。

1.5 標本采集

造模28天后進行取材，麻醉大鼠后取肺臟組織。樣品分成4份。一份左肺，用4%多聚甲醛固定液固定，常溫保存；右肺分成3份，保存于-80 ℃冰箱。

1.6 病理學(xué)觀察

挑選3塊新鮮肺組織樣本，每塊大小約1 cm×1 cm×1 cm，將肺組織樣本用固定液固定在冰凍切片機上，時長為15 min，切為10 μm左右厚度的切片，用光鏡觀察常規(guī)油紅HE染色后的脂滴分布狀況。

1.7 Nrf2mRNA

應(yīng)用實時熒光定量PCR的方法測定，總RNA提取試劑盒提取肺組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，全自動熒光定量PCR儀增大并測定熒光。Nrf2引物序列：上游F：CCTCTGCTGCCATTAGTCAGT，下游：R：CTTCAGTGTGCTTCTGGTTGA，GAPDH引物序列：上游：F：GACTCCACTCACGGCAAAT，下游：R：GACTCCACGACATACTCAGCA，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性1 min后95 ℃變性20 s，而后56 ℃退火30 s，再72 ℃延伸30 s，最后循環(huán)40次。用比較Ct的方法測算mRNA相對表達倍數(shù)。

1.8 Western Blotting法測定Nrf2蛋白表達

將100 mg左右的肺組織放入含1 mmoL·L-1·kg-1PMSF的500 μL RIPA裂解液，研磨組織，充分裂解，配平后于4 ℃，12 000 r·minkg-1離心20 min，取上清液低溫待用，并測定蛋白含量。樣本通過SDS-PAGE電泳后分離出蛋白，轉(zhuǎn)移PVDF膜上，從電轉(zhuǎn)槽中取出膜，漂洗TBS，置于封閉液中室溫搖蕩2 h；轉(zhuǎn)膜，加一抗稀釋液4 ℃搖床，洗膜，加入二抗稀釋液，于4 ℃室溫下孵育1 h，洗滌后于暗室在X光片上顯影，ECL顯色劑按A∶B =1∶1的比例現(xiàn)配現(xiàn)用，注意避光，用化學(xué)發(fā)光儀顯影拍照。將顯影后的數(shù)據(jù)用image lab分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀察

正常組大鼠形體正常，精神狀態(tài)好，活動自如。模型組大鼠形體肥胖，精神倦怠，動作遲緩，體毛枯黃易脫落，進食、飲水量大，大便質(zhì)軟，墊料濕度大。溫肺化纖湯高、低劑量組大鼠的精神、形體、活動、毛發(fā)、飲水、進食、排泄物均更佳，以溫肺化纖湯高劑量組的改善情況最為明顯。

2.2 大鼠肺組織病理變化

正常組大鼠肺細胞核為藍色，細胞內(nèi)未有顯著的橘紅色脂滴，間隙清晰，肺竇正常。模型組大鼠細胞明顯腫大，出現(xiàn)彌漫性紅染脂滴，相鄰肺細胞內(nèi)脂滴融合，細胞核多被擠壓于一側(cè)。溫肺化纖湯高、低劑量組橘紅色脂滴少于模型組，其中以溫肺化纖湯高劑量組改善較顯著(見圖1)。

注：A.對照組；B.模型組；C.低劑量處理組；D.中劑量處理組；E.高劑量處理組。

2.3 大鼠肺組織Nrf2水平比較

通過Western Blotting法對肺纖維化大鼠肺組Nrf2表達水平進行檢測，進一步明確溫肺化纖湯增強抗氧化能力的機制。結(jié)果表明，與對照組比較，肺纖維化、中、高劑量溫肺化纖湯處理組胞核Nrf2表達水平增加(P<0.05)。與模型組相比，高劑量處理組溫肺化纖湯胞核Nrf2表達水平增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與低劑量溫肺化纖湯處理組比較，中、高劑量溫肺化纖湯處理組上述指標明顯改善(P<0.05)。中、高劑量溫肺化纖湯處理組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖2、圖3)。

3 討論

研究認為，氧化與抗氧化失衡同肺纖維化的發(fā)病息息相關(guān)，在該病的病理演變中起著十分重要的作用[3]。目前，中醫(yī)藥在PF領(lǐng)域主要通過調(diào)節(jié)細胞因子、抑制細胞外基質(zhì)合成、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激系統(tǒng)來防治，是一個多方位的過程[10]。江西省名中醫(yī)劉良徛教授認為PF是一個本虛標實之證，陽虛是本病的內(nèi)因，陽虛證候可出現(xiàn)在肺纖維化病情發(fā)生發(fā)展過程中，痰和瘀是本病的繼發(fā)因素，陽虛、痰濁、血瘀構(gòu)成了PF的3個主要環(huán)節(jié)[11-12]?；谌虦胤卫碚?，劉教授創(chuàng)制了具有溫陽散寒、化痰行瘀之功的溫肺化纖湯治療PF，療效較好。前期實驗結(jié)果顯示，溫肺化纖湯具有一定的抗氧化活性，可改善博來霉素致大鼠肺纖維化模型的肺組織損害，纖維組織增生減少[13-14]，纖維化評分降低，這些都提示抗氧化是溫肺化纖湯治療肺間質(zhì)纖維化的有效途徑。

注：1.對照組；2.模型組；3.低劑量處理組；4.中劑量處理組；5.高劑量處理組；采用實時熒光定量PCR(qRT- PCR)法測定肺組織Nrf2mRNA的表達，*為與模型組、對照組、低劑量組比較，P<0.05；**為與模型組、對照組、低劑量組比較，P<0.05。

Nrf2是調(diào)控氧化應(yīng)激最具代表的核轉(zhuǎn)錄因子。生理情況下，細胞質(zhì)中的Nrf2與Keap1偶聯(lián)后以失活狀態(tài)固定于胞質(zhì)內(nèi)，泛素化后由26 S蛋白酶體所降解，當遭受氧化劑刺激后，Keap1被氧化發(fā)生構(gòu)象改變，隨后與Nrf2解偶聯(lián)，Nrf2釋放后轉(zhuǎn)位入胞核內(nèi)，與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，誘導(dǎo)下游SOD、CAT、GSH等抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控細胞內(nèi)抗氧化酶表達[15]。

本研究主要檢測了肺組織中Nrf2的含量。與對照組比較，肺纖維化組、中、高劑量溫肺化纖湯處理組胞核Nrf2表達水平增加(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，即空白組大鼠肺組織中Nrf2含量最低，提示博萊霉素致大鼠肺纖維化模型造?；境晒?。與模型組相比，高劑量處理組溫肺化纖湯Nrf2表達水平增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明應(yīng)用高劑量后實驗大鼠肺組織中的Nrf2指標變化明顯。與低劑量溫肺化纖湯處理組比較，中、高劑量溫肺化纖湯處理組上述指標明顯改善(P<0.05)，說明中、高劑量是有效藥物濃度。然而，中、高劑量溫肺化纖湯處理組間比較差異不明顯(P>0.05)，換言之，應(yīng)用中、高劑量后實驗大鼠肺組織中的Nrf2指標變化不明顯。

圖3 GAPDH、Nrf2溶解曲線

綜上，溫肺化纖湯可能通過增加Nrf2蛋白，干預(yù)實驗性肺纖維化，但本實驗相對簡單，僅探討了在肺纖維化形成過程中Nrf2表達的作用，而具體的作用機制、是否有其他通路的作用等方面還需進一步深入研究。