海鮮菇美拉德肽的制備及其風(fēng)味特性研究

林欽淋，黃焰峰，方煥新，林波月，繆松，林灼華，鄧凱波*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002；2.中國(guó)?愛(ài)爾蘭國(guó)際合作食品物質(zhì)學(xué)與結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)研究中心，福建福州 350002；3.福建省特種淀粉品質(zhì)科學(xué)與加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350002；4.愛(ài)爾蘭農(nóng)業(yè)部Teagasc食品研究中心，愛(ài)爾蘭科克 119634；5.莊臣釀酒（福建）有限公司，福建福州 350500）

鈉鹽是飲食中不可缺少的調(diào)味品，但攝入過(guò)多會(huì)帶來(lái)諸多健康問(wèn)題[1]。目前采用其他金屬元素?zé)o機(jī)鹽取代鈉鹽的減鹽方式存在成本高、后苦味重等缺點(diǎn)，且較難被消費(fèi)者廣泛接受[2]。咸味肽作為呈咸味的肽段，能夠在一定程度上替代食鹽用于食物烹調(diào)中，且可以較好地被人體吸收利用，開(kāi)發(fā)與應(yīng)用前景廣闊[3]。

食用菌來(lái)源廣泛，營(yíng)養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特，其中海鮮菇含有豐富的呈味氨基酸，是制備咸味肽的良好潛在原料；食用菌作為新型食品調(diào)味料的相關(guān)研究和應(yīng)用，也是當(dāng)前食品加工領(lǐng)域熱點(diǎn)之一。研究表明，蛋白在酶解過(guò)程中會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生以疏水氨基酸為主的苦味肽，影響酶解液的風(fēng)味特性，限制其在食品中的應(yīng)用[4]。這種問(wèn)題在小麥[5]和大豆[6]等作物蛋白水解時(shí)均存在，其原因可能涉及蛋白酶作用過(guò)程中蛋白水解度不斷增大，苦味肽含量成倍數(shù)增長(zhǎng)，使產(chǎn)物苦味變重，因而限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。

美拉德反應(yīng)是一種加熱條件下氨基和羧基之間的非酶促褐變反應(yīng)，植物蛋白肽的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有增強(qiáng)咸味、鮮味并減少苦味的能力[7]，生成的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，通?？勺鳛橄涛逗拖涛对鰪?qiáng)劑。Abdelhedi等[8]等研究了超聲預(yù)處理對(duì)前鰭星鯊低分子量肽與蔗糖誘導(dǎo)的美拉德反應(yīng)演化的影響，結(jié)果表明美拉德反應(yīng)減少了產(chǎn)物的苦味，增強(qiáng)了所得偶聯(lián)物的抗氧化能力。Fu 等[9]通過(guò)美拉德反應(yīng)對(duì)雙酶切制備的豬肌肉和血漿蛋白水解物進(jìn)行肽糖基化，降低了酶解液的苦味。Zhang 等[10]也發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)有效降低了牛肉蛋白水解產(chǎn)物的苦味，這可能是由于糖基化肽的親電性增加。除了上述作用外，美拉德肽的形成以及美拉德反應(yīng)的修飾與天然蛋白水解物相比具有更顯著的咸味、鮮味。

此外，美拉德反應(yīng)還有助于改善蛋白肽的其他風(fēng)味特性。Yu 等[11]在對(duì)草魚(yú)皮膠原進(jìn)行酶解和超濾后開(kāi)展氨基葡萄糖誘導(dǎo)的美拉德反應(yīng)，結(jié)果表明，美拉德肽表現(xiàn)出明顯的咸味增強(qiáng)作用。Wei 等[12]發(fā)現(xiàn)由葵花蛋白水解物和木糖產(chǎn)生的美拉德多肽除呈現(xiàn)出較好的醇厚味、鮮味外，還呈現(xiàn)出肉的風(fēng)味。

因此，美拉德反應(yīng)也被認(rèn)為是增加肽咸鮮味的可行方法[13]，但其對(duì)食用菌蛋白酶解肽在風(fēng)味特性方面的研究目前還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究以海鮮菇蛋白肽為原料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化海鮮菇美拉德肽的最佳制備工藝，并通過(guò)褐變程度、產(chǎn)物分子量分布、感官評(píng)價(jià)、電子舌和超濾等指標(biāo)和評(píng)價(jià)手段，明確美拉德反應(yīng)對(duì)海鮮菇蛋白肽特征性風(fēng)味的影響，以期為擴(kuò)展可替代鈉鹽的新型食用菌調(diào)味領(lǐng)域的研究和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海鮮菇干品：福建神農(nóng)菇業(yè)有限公司；葡萄糖、D?木糖（均為食品級(jí)）：河南萬(wàn)邦化工科技有限公司；NaCl、谷氨酸鈉、蔗糖：市售；Sephadex G?10 葡聚糖凝膠：北京索萊寶科技有限公司；鹽酸奎寧（食品級(jí)）：陜西海益斯生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FDU?1200 型冷凍干燥機(jī)：東京理化公司；Avanti J?E 型多用途高效離心機(jī)：美國(guó)Beckman Coulter 公司；SHA?C 型數(shù)顯水浴恒溫振蕩器：常州國(guó)華電器有限公司；FA2104 型電子天平：天津方瑞儀器生產(chǎn)有限公司；EUTECH pH700 型pH 計(jì)：美國(guó)賽默飛世爾有限公司；SA402B 型電子舌：日本Insent 公司；DF?101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：上海力辰科技有限公司；Waters 600 高效液相色譜儀：美國(guó)Waters 公司；超濾離心管：山東博納生物科技集團(tuán)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海鮮菇蛋白肽酶解液的制備

海鮮菇蛋白質(zhì)提取依據(jù)張京濤[14]的方法并適當(dāng)修改。3 g 海鮮菇粉加入含150 mL 蒸餾水的燒杯中，充分?jǐn)嚢璨⒄{(diào)整pH 值至5.0，添加3%纖維素酶，磁力攪拌2 min 后置于55 ℃水浴鍋中酶解2 h。隨后80 ℃滅酶10 min，用1 mol/L NaOH 溶液調(diào)整pH 值至11.8，55 ℃堿提1.5 h。然后，浸提液以4 000 r/min 離心15 min，保留上清液。將沉淀復(fù)提一次后，匯集提取液，用0.1 mol/L HCl 溶液調(diào)pH 值至等電點(diǎn)（3.4），靜置1 h，4 000 r/min 離心10 min 得到蛋白質(zhì)沉淀，脫鹽，調(diào)節(jié)溶液至中性后，經(jīng)冷凍干燥獲得海鮮菇蛋白粉（蛋白質(zhì)含量為27.1%）。

海鮮菇蛋白酶解液制備參考余敏[15]的方法并經(jīng)適當(dāng)修改。取適量海鮮菇蛋白粉，控制料液比為1∶20（g/mL）制備成懸浮液，80 ℃熱處理20 min 后冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH 值為9.96。然后添加0.8%堿性蛋白酶于50.2 ℃酶解2.5 h，及調(diào)節(jié)pH 值為7 后添加0.77% 風(fēng)味蛋白酶于49.6 °C 酶解2 h。酶解結(jié)束后，水解液在100 ℃下加熱滅酶10 min，7 000 r/min 離心15 min，上清液即為海鮮菇蛋白肽酶解液。

1.3.2 海鮮菇美拉德肽制備工藝響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

海鮮菇美拉德肽制備參照張歷[16]的方法并適當(dāng)修改。將海鮮菇蛋白肽酶解液減壓濃縮至原體積的1/2，分別探討美拉德反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間（0.5～2.5 h）、反應(yīng)溫度（90～130 ℃）和葡萄糖與D?木糖質(zhì)量比（5∶0～0∶5，總添加量固定為2.5 g/100 mL 酶解液）3 個(gè)單因素對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的pH 值和感官評(píng)分的影響。然后，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官評(píng)分為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，其因素水平及編碼見(jiàn)表1。

表1 美拉德反應(yīng)制備海鮮菇蛋白肽工藝優(yōu)化的響應(yīng)面設(shè)計(jì)Table 1 Response surface design for optimization of the prepara?tion process of Maillard reacted peptides from Hypsizygus mar?moreus

1.3.3 褐變程度測(cè)定

將美拉德反應(yīng)液稀釋100 倍，以蒸餾水為參比，分別測(cè)定其在294 nm 和420 nm 波長(zhǎng)下的吸光值[17]，以美拉德反應(yīng)前的海鮮菇蛋白肽作對(duì)照。

1.3.4 多肽分子量分布測(cè)定

參照嚴(yán)方等[2]的方法并適當(dāng)修改：通過(guò)凝膠滲透色譜法（gel permeation chromatography，GPC）測(cè)定，高效液相色譜儀配2487 紫外檢測(cè)器和Empower 工作站，以及TSK gel 2000 SWXL 色譜柱（30 cm×7.8 mm×5μm）。設(shè)定柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，流速0.5 mL/min；流動(dòng)相：乙腈∶水∶三氟乙酸為40∶60∶0.1（體積比）。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用以下標(biāo)準(zhǔn)品分析繪制：細(xì)胞色素C（Mw12384）、抑肽酶（Mw6500）、桿菌肽（Mw1422）、四肽GGYR（Mw451）和三肽GGG（Mw189）。

1.3.5 海鮮菇美拉德肽感官評(píng)價(jià)

參照楊文君等[18]的方法并適當(dāng)修改。由20 名具有豐富感官評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)人員（22～30 歲）組成的感官評(píng)定小組，分別對(duì)海鮮菇蛋白肽和美拉德肽的咸味、鮮味、苦味、甜味和異味5 種風(fēng)味進(jìn)行描述性評(píng)價(jià)。各風(fēng)味的對(duì)照溶液分別為0.4%NaCl、0.3% 谷氨酸鈉、0.03% 鹽酸奎寧、1%蔗糖和美拉德反應(yīng)前的海鮮菇蛋白肽。采用7 分評(píng)價(jià)法，分值越高表明該項(xiàng)指標(biāo)效果越強(qiáng)，反之表明該指標(biāo)效果越弱，對(duì)照溶液均設(shè)定為4 分。根據(jù)各風(fēng)味在美拉德產(chǎn)物風(fēng)味中的重要性賦予權(quán)重計(jì)算總分，分別為咸味0.4、鮮味0.3、甜味-0.1、苦味-0.1 和異味-0.1。重復(fù)評(píng)定3 次，以平均值為樣品最終得分結(jié)果。每次品嘗后，用白面包清口、水漱口。

1.3.6 電子舌測(cè)定

將制備的海鮮菇蛋白肽和美拉德肽溶液分別置于電子舌專用測(cè)量杯中，采用C00、AE1、CA0、CT0、AAE、GL1、BT0 共7 個(gè)傳感器（見(jiàn)表2），傳感器經(jīng)活化和校正后，進(jìn)行常溫下檢測(cè)。每個(gè)樣品檢測(cè)時(shí)間為30 s，兩個(gè)樣品之間電子舌清潔時(shí)間為5 min。所有的樣品均測(cè)試3 次取平均值。

表2 傳感器與味覺(jué)值的匹配信息Table 2 Matching information between sensors and taste values

1.3.7 超濾分離

結(jié)合分子量分布結(jié)論，選取海鮮菇美拉德反應(yīng)的主要活性肽段為研究對(duì)象，并參考李曉明[19]的方法并做適當(dāng)修改：先用0.45 μm 有機(jī)濾膜對(duì)樣品溶液預(yù)過(guò)濾，然后采用截留分子質(zhì)量為500 Da 的超濾離心管收集＜500 Da 和500～2 000 Da 組分，濾液冷凍干燥后進(jìn)行各超濾組分的感官評(píng)價(jià)。

1.3.8 超濾組分咸味閾值、增咸閾值測(cè)定及風(fēng)味描述

采用與之前相同的感官評(píng)價(jià)小組，參考李曉明[19]的試驗(yàn)方法并做適當(dāng)修改：采用三角試驗(yàn)法[20]，將各超濾組分配制為5 mg/mL 起始溶液，然后以體積比1∶1梯度稀釋并一次性提供給感官評(píng)價(jià)員，評(píng)價(jià)員按照按濃度由高到低的順序依次評(píng)價(jià)，直至無(wú)法識(shí)別出溶液咸味為止，將倒數(shù)第2 個(gè)溶液的質(zhì)量濃度值記為各組分的咸味閾值。同時(shí)，將濃度逐漸增大的各超濾組分分別加入到1 mg/mL NaCl 溶液中混勻并一次性提供給感官評(píng)價(jià)員，評(píng)價(jià)員按照濃度由低到高的順序依次評(píng)價(jià)，以可感知咸味值增加的組分的質(zhì)量濃度作為肽液的增咸閾值。此外，每個(gè)評(píng)價(jià)人員要描述各組分的肽溶液在NaCl 水溶液中的感官特性。

感官特性評(píng)價(jià)[21]：分別用超純水和1 mg/mL NaCl溶液將各超濾組分配制成終濃度為5 mg/mL 的溶液，并一次性提供給感官評(píng)價(jià)員，評(píng)價(jià)員分別對(duì)樣品的咸味、鮮味、苦味、甜味和異味5 種風(fēng)味進(jìn)行描述性評(píng)價(jià)，以區(qū)分各組分之間的風(fēng)味差異。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 和Origin 2022 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖，Design?Expert 軟件中的Box?Behnken 進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。利用單因素方差分析進(jìn)行差異性比較，p＜0.05 表示顯著差異，p＜0.01 表示極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 還原糖添加比例的選擇

糖的種類是影響美拉德反應(yīng)極其重要的因素[16]。葡萄糖與D?木糖添加比例對(duì)海鮮菇美拉德肽pH 值和感官評(píng)分的影響如圖1所示。

圖1 葡萄糖與D?木糖質(zhì)量比添加比例對(duì)海鮮菇美拉德肽pH 值和感官評(píng)分的影響Fig.1 Effects of mass ratio of glucose to D?xylose on pH and sen?sory score of Maillard reacted peptides from H.marmoreus

由圖1 可知，隨著D?木糖比例增大，pH 值呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)，這是因?yàn)槿┨呛屯窃诿览路磻?yīng)中的代謝途徑不同。醛糖主要經(jīng)Amadori 重排形成Amadori 重排產(chǎn)物；而酮糖則主要經(jīng)Heyns 重排形成Heyns 重排產(chǎn)物。一般醛糖在美拉德反應(yīng)中的反應(yīng)速率大于酮糖[22]。因此在葡萄糖（醛醣）與D?木糖（酮糖）質(zhì)量比為4∶1 時(shí)可能達(dá)到了平衡，此時(shí)pH 值最低，為6.41，此后隨著葡萄糖比例繼續(xù)降低，反應(yīng)速率逐漸減慢。

僅添加葡萄糖時(shí)（葡萄糖∶D?木糖質(zhì)量比為5∶0）感官評(píng)分較低，此時(shí)美拉德肽溶液呈現(xiàn)出明顯的異味，咸味不突出，這可能是因?yàn)槠咸烟潜旧硖鸲容^低，對(duì)產(chǎn)物的咸味影響很小[22]。在葡萄糖∶D?木糖質(zhì)量比為4∶1時(shí)感官評(píng)分達(dá)到最高，此時(shí)的美拉德肽溶液咸鮮味較為突出，異味較淡，無(wú)苦味。而當(dāng)D?木糖比例逐漸升高，焦糖化反應(yīng)加劇，產(chǎn)物顏色向黑褐色轉(zhuǎn)變，并產(chǎn)生焦糊味，呈現(xiàn)出過(guò)甜、苦澀的風(fēng)味，使得咸味不突出，整體風(fēng)味被破壞。因此選擇葡萄糖∶D?木糖質(zhì)量比為5∶0、4∶1 和3∶2 進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 反應(yīng)時(shí)間的選擇

美拉德反應(yīng)的時(shí)間長(zhǎng)短可顯著影響美拉德產(chǎn)物的生成量和產(chǎn)品品質(zhì)。圖2 反映了美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的pH 值和感官評(píng)分隨反應(yīng)時(shí)間變化的趨勢(shì)。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)海鮮菇美拉德肽pH 值和感官評(píng)分的影響Fig.2 Effects of reaction time on pH and sensory score of Mail?lard reacted peptides from H.marmoreus

由圖2 可見(jiàn)，pH 值隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)快速下降（p＜0.05），這是因?yàn)樵诿览路磻?yīng)過(guò)程中，氨基殘基數(shù)量會(huì)不斷減少，并生成一系列有機(jī)酸（如甲酸、乙酸和苯甲酸等）[23]。另外，在反應(yīng)0～1.0 h，感官評(píng)分隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，這是由于美拉德反應(yīng)可生成呋喃、吡嗪、含硫化合物、小分子呈味肽和呈味氨基酸[15]，美拉德肽溶液咸鮮味較為突出，苦味、甜味不明顯；反應(yīng)1.0 h后，感官評(píng)分急劇下降（p＜0.05），美拉德肽溶液呈現(xiàn)出明顯的苦味，并伴澀味，甜味突出，咸味感知減弱。這是因?yàn)槊览路磻?yīng)后期生產(chǎn)一些具有刺激性風(fēng)味的惡唑、噻唑和強(qiáng)烈苦味的大分子聚合物及苦味氨基酸[24]。因此選擇反應(yīng)時(shí)間為0.5、1.0、1.5 h 進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3 反應(yīng)溫度的選擇

研究顯示，反應(yīng)溫度越高，美拉德反應(yīng)速率加快。圖3 反映了反應(yīng)溫度對(duì)海鮮菇美拉德肽pH 值和感官評(píng)分的影響。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)海鮮菇美拉德肽pH 值和感官評(píng)分的影響Fig.3 Effects of reaction temperature on pH and sensory score of Maillard reacted peptides from H.marmoreus

如圖3所示，體系pH 值隨反應(yīng)溫度升高而顯著降低（p＜0.05），這是因?yàn)楦邷孛览路磻?yīng)劇烈，利于有機(jī)酸的生成，pH 值下降幅度較大[25]。感官評(píng)分則隨反應(yīng)溫度升高呈先升高后降低趨勢(shì)。當(dāng)溫度小于120 ℃時(shí)，反應(yīng)溫度升高有利于苦味氨基酸與還原糖的交聯(lián)反應(yīng)，降低反應(yīng)產(chǎn)物的苦味，促進(jìn)咸鮮風(fēng)味的生成[15]；而當(dāng)反應(yīng)溫度超過(guò)120 ℃時(shí)，體系易產(chǎn)生有害物質(zhì)——丙烯酰胺，且反應(yīng)溫度越高生成量越多[25]，使美拉德肽溶液苦味明顯。因此選擇反應(yīng)溫度為100、110、120 ℃進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

2.4 海鮮菇美拉德肽響應(yīng)面法最佳制備工藝優(yōu)化

海鮮菇美拉德肽制備工藝響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3、方差分析見(jiàn)表4。

表3 海鮮菇美拉德肽制備工藝Box?Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Box?Behnken design for the preparation of Maillard re?acted peptides from H.marmoreus

表4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance of the regression equation

采用Box?Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到葡萄糖與D?木糖質(zhì)量比（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）和反應(yīng)溫度（C）與響應(yīng)值感官評(píng)分（Y）的關(guān)系結(jié)果如表3所示。經(jīng)二次多元回歸擬合獲得方程為Y=3.44+0.01A-0.075B+0.038C-0.028AB+0.038AC-0.017BC-0.44A2-0.3B2-0.29C2。

由表4 可知，方程p值＜0.000 1，說(shuō)明該方程極顯著。模型失擬項(xiàng)p=0.054 7＞0.05，不顯著。確定系數(shù)R2=0.999 0，R2Adj=0.997 7，表示模型擬合良好，可信度高。各因素對(duì)海鮮菇美拉德肽風(fēng)味影響的大小為B（反應(yīng)時(shí)間）＞C（反應(yīng)溫度）＞A（葡萄糖與D?木糖質(zhì)量比）。一次項(xiàng)B、C，二次項(xiàng)A2、B2、C2和交互項(xiàng)AC對(duì)美拉德風(fēng)味的影響極顯著（p＜0.01）；交互項(xiàng)AB作用顯著（p＜0.05），交互項(xiàng)BC作用不顯著（p＞0.05）。

交互作用對(duì)海鮮菇美拉德肽風(fēng)味影響的響應(yīng)面分析結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 交互作用對(duì)海鮮菇美拉德肽風(fēng)味影響的響應(yīng)面分析Fig.4 Response surface of the effects of interactions between fac?tors on the sensory score of Maillard reacted peptides from H.mar?moreus

從圖4 也可以看出，交互作用AC曲面最陡，交互作用影響極顯著，其次為AB，而B(niǎo)C的曲面陡峭程度較小，交互作用不顯著。由此可見(jiàn)，各因素對(duì)美拉德肽風(fēng)味的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

2.5 海鮮菇蛋白美拉德肽制備工藝最佳條件的確定和驗(yàn)證

由Design?Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析可得，海鮮菇美拉德肽的最佳制備工藝為葡萄糖與D?木糖質(zhì)量比4∶1，反應(yīng)時(shí)間56.4 min 和反應(yīng)溫度110.68 ℃，此時(shí)感官評(píng)分為3.450 01?？紤]到實(shí)際操作過(guò)程的可行性與方便性，調(diào)整配方工藝為葡萄糖與D?木糖質(zhì)量比4∶1、反應(yīng)溫度110 ℃和反應(yīng)時(shí)間56 min。經(jīng)3 次驗(yàn)證其感官評(píng)分均值為3.43，與預(yù)測(cè)值非常接近，且pH 值為6.55，驗(yàn)證了所建模型的準(zhǔn)確性。

2.6 美拉德反應(yīng)對(duì)海鮮菇蛋白肽褐變程度的影響

美拉德反應(yīng)對(duì)海鮮菇蛋白肽褐變程度的影響見(jiàn)圖5。

圖5 海鮮菇蛋白肽和美拉德肽的褐變程度Fig.5 Comparison on browning degree of H.marmoreus peptides before and after Maillard reaction

褐色的類黑素是美拉德反應(yīng)的重要產(chǎn)物，褐變程度是衡量美拉德反應(yīng)進(jìn)度的最重要的指標(biāo)之一[17]。由圖5 可知，在美拉德反應(yīng)中，前期生成的無(wú)色中間化合物可導(dǎo)致294 nm 下吸光值增加，而反應(yīng)后期形成的黑色素等大分子物質(zhì)則會(huì)造成420 nm 下吸光值顯著增加[15]。本研究中的海鮮菇蛋白肽經(jīng)美拉德反應(yīng)后，兩個(gè)波長(zhǎng)的吸光值均呈極顯著增加趨勢(shì)（p＜0.01），說(shuō)明美拉德反應(yīng)中間化合物有助于提高后續(xù)類黑素的生成，體系中的還原糖與肽之間的反應(yīng)活性增加，加速了美拉德褐色產(chǎn)物的累積，導(dǎo)致褐變程度增加。

2.7 美拉德反應(yīng)對(duì)海鮮菇蛋白肽分子量分布的影響

美拉德反應(yīng)對(duì)海鮮菇蛋白肽分子量分布的影響見(jiàn)圖6。

圖6 海鮮菇蛋白肽與美拉德肽分子量分布情況Fig.6 Molecular weight distribution of peptides and Maillard re?acted peptides from H.marmoreus

采用GPC 法測(cè)定海鮮菇蛋白肽和美拉德肽的分子量分布如圖6（A、B）所示。根據(jù)不同分子量肽段對(duì)美拉德反應(yīng)的貢獻(xiàn)，將其分為≤180、＞180～500、＞500～1 000、＞1 000～2 000 Da 及＞2 000 Da 5 個(gè)肽段范圍，各個(gè)肽段的含量占整個(gè)海鮮菇蛋白肽和美拉德肽的中比例如圖6（C、D）所示。相較于酶解后得到的一系列小分子肽，美拉德反應(yīng)后，相對(duì)分子質(zhì)量≤180 Da 和＞500 Da組分占比增大，而＞180～500 Da 組分占比減小。

肽在美拉德反應(yīng)過(guò)程中存在2 種轉(zhuǎn)化方式：一是肽直接參與美拉德反應(yīng)生成產(chǎn)物；二是通過(guò)熱降解形成小分子肽，這些小分子肽再參加美拉德反應(yīng)生成產(chǎn)物；且肽和小分子肽之間也會(huì)通過(guò)降解或交聯(lián)作用在美拉德反應(yīng)中同時(shí)發(fā)生，形成相對(duì)動(dòng)態(tài)平衡[26?27]。并且美拉德反應(yīng)后，分子量＞180～500 Da 組分含量明顯下降，說(shuō)明此組分在美拉德反應(yīng)中被消耗，因此推測(cè)分子量＞180～500 Da 組分應(yīng)為美拉德肽生成過(guò)程主要反應(yīng)肽段。這與嚴(yán)方[22]和劉平[25]的研究結(jié)果一致。Liu 等[28]研究了熱處理對(duì)木糖和雞肉肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)生風(fēng)味的影響，結(jié)果表明分子量為200～500 Da 的肽將是該交聯(lián)反應(yīng)的主要參與者。而在雞肉蛋白研究中發(fā)現(xiàn)，可能直接參與美拉德反應(yīng)的主要肽段則為2 800～3 500 Da[29]，這說(shuō)明美拉德反應(yīng)的最佳肽段可能存在原料差異性。

2.8 美拉德反應(yīng)對(duì)海鮮菇蛋白肽感官風(fēng)味特征的影響

美拉德反應(yīng)對(duì)海鮮菇蛋白肽感官風(fēng)味特征的影響見(jiàn)表5。

表5 海鮮菇蛋白肽與美拉德肽的感官風(fēng)味特征評(píng)分對(duì)比Table 5 Sensory score comparison of the tastes of peptides and Maillard reacted peptides from H.marmoreus

美拉德反應(yīng)對(duì)海鮮菇蛋白肽感官風(fēng)味特征可產(chǎn)生較顯著影響。由表5 可知，與未發(fā)生美拉德反應(yīng)的蛋白肽溶液相比，美拉德肽溶液咸味和鮮味評(píng)分明顯增高，說(shuō)明其具有更強(qiáng)烈的咸味，并伴有鮮味產(chǎn)生。同時(shí)，美拉德反應(yīng)后肽液的異味有所減弱，且未產(chǎn)生額外苦味。此外，由于美拉德反應(yīng)還原糖底物的加入，使產(chǎn)物的甜味評(píng)分有所增加，但由于其增幅不大且有咸鮮味加成，故海鮮菇美拉德肽的整體評(píng)分更高，接受度更好，口感更豐富。

2.9 美拉德反應(yīng)對(duì)海鮮菇蛋白肽電子舌風(fēng)味特征的影響

美拉德反應(yīng)對(duì)海鮮菇蛋白肽電子舌風(fēng)味特征的影響見(jiàn)圖7。

圖7 海鮮菇蛋白肽和美拉德肽電子舌結(jié)果雷達(dá)圖Fig.7 Electronic tongue radar map of peptides and Maillard re?acted peptides from H.marmoreus

用電子舌進(jìn)一步評(píng)價(jià)了肽和美拉德肽之間的味覺(jué)特性差異，從圖7 可以看出，經(jīng)過(guò)美拉德反應(yīng)后，咸味、鮮味和豐富味傳感器信號(hào)明顯升高，說(shuō)明美拉德反應(yīng)可有效提升海鮮菇蛋白肽的咸鮮味，風(fēng)味層次更加豐富；苦味、澀味、酸味和甜味等傳感器信號(hào)明顯下降，說(shuō)明原蛋白肽中的異味經(jīng)美拉德反應(yīng)后明顯減少。此外，肽和美拉德肽的咸味和鮮味均優(yōu)于電子舌無(wú)味點(diǎn)，苦味甜味均低于無(wú)味點(diǎn)，這與感官評(píng)分一致。

采用主成分分析（principal component analysis，PCA）進(jìn)一步分析美拉德反應(yīng)前后海鮮菇蛋白肽不同的口感特征，如圖8所示。

圖8 海鮮菇蛋白肽和美拉德肽電子舌結(jié)果主成分分析圖Fig.8 Principal component analysis plot of electronic tongue re?sults for peptides and Maillard reacted peptides from H.marmoreus

PC1 和PC2 兩個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為100%，說(shuō)明前兩個(gè)主成分間獨(dú)立性較強(qiáng)，并已包含全部信息。蛋白肽和美拉德肽與電子舌的咸味、鮮味和豐富性高度相關(guān)，其中美拉德肽較蛋白肽更靠近咸味和鮮味，說(shuō)明美拉德反應(yīng)具有增強(qiáng)原蛋白肽咸鮮味，減少苦味的作用。

2.10 電子舌與感官評(píng)分相關(guān)性分析

基于電子舌信號(hào)與感官評(píng)價(jià)兩種技術(shù)對(duì)樣品鮮、咸、苦、甜4 種風(fēng)味特征的結(jié)果，對(duì)其進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，如圖9所示。

圖9 電子舌與感官評(píng)價(jià)結(jié)果的相關(guān)性分析Fig.9 Correlations between the results of electronic tongue and sensory evaluation

由圖9 可知，海鮮菇蛋白肽和美拉德肽4 種風(fēng)味的電子舌傳感器信號(hào)與感官評(píng)分呈高度正相關(guān)關(guān)系，表明兩種評(píng)價(jià)手段對(duì)海鮮菇蛋白肽類物質(zhì)的風(fēng)味判定結(jié)果相對(duì)一致，電子舌數(shù)據(jù)合理可靠。同時(shí)也表明電子舌可作為一種有效判別蛋白肽和美拉德肽滋味的技術(shù)，該應(yīng)用也同樣在香菇特征風(fēng)味和相關(guān)化合物的比較研究[30]以及乳蛋白水解物苦味篩選研究[31]中得到了證實(shí)。邴芳玲等[32]曾利用這兩種評(píng)價(jià)手段探究5 種食用菌的鮮味，結(jié)果顯示電子舌與感官評(píng)分規(guī)律相同，可以利用電子舌儀器來(lái)預(yù)判感官評(píng)分。而本研究中對(duì)食用菌在鮮、咸、苦、甜4 種風(fēng)味特征相關(guān)性的綜合評(píng)價(jià)和分析，使電子舌技術(shù)對(duì)目前感官評(píng)價(jià)存在的耗時(shí)長(zhǎng)、易疲憊及處理量小等問(wèn)題[33]，提供了一種科學(xué)可行的補(bǔ)充替代方案。因此，將電子舌與感官評(píng)分兩種方法相結(jié)合將有助于更加科學(xué)有效地評(píng)價(jià)海鮮菇美拉德肽的風(fēng)味特征。

2.11 海鮮菇美拉德肽超濾分級(jí)組分的感官分析

海鮮菇美拉德肽超濾分級(jí)組分的感官分析見(jiàn)表6。

表6 各超濾組分咸味閾值、增咸閾值和風(fēng)味描述Table 6 Saltiness threshold，saltiness enhancement threshold and flavor description for each ultrafiltration component

膜超濾是一種利用膜兩側(cè)的壓力差值，在混合液料通過(guò)不同孔徑的超濾膜時(shí)，對(duì)混合料液進(jìn)行分子量截留，并篩選分離的物理分離過(guò)程[34]，由于其高通量的分離效率及溫和的分離條件，因此廣泛地用于蛋白質(zhì)、肽類物質(zhì)以及熱敏性原料的分離純化[35]。根據(jù)鄭瑩瑩[36]、溫青玉等[37]的研究結(jié)論顯示，小分子肽段顯示出更加強(qiáng)烈的咸鮮風(fēng)味特征，并結(jié)合海鮮菇美拉德肽分子量分析結(jié)果，以500 Da 超濾膜對(duì)其進(jìn)行分級(jí)分離，獲得＜500 Da 和500～2 000 Da 兩個(gè)組分。

由表6 可知，隨著對(duì)美拉德肽溶液的逐步分離，各超濾組分的咸味閾值逐漸降低，這是由于相比于經(jīng)超濾分離后的組分，美拉德肽溶液組成更復(fù)雜，體系中多種風(fēng)味成分共存可能導(dǎo)致一定程度的風(fēng)味掩蓋或風(fēng)味增強(qiáng)效應(yīng)[38]。而＜500 Da 的增咸閾值可測(cè)，可顯著提升原有咸味感知，且在水中和NaCl 溶液中的風(fēng)味明顯優(yōu)于美拉德肽溶液和500～2 000 Da 組分。此結(jié)果表明海鮮菇美拉德肽呈咸鮮味的肽分子量主要集中在500 Da 以下，這與張順亮的研究結(jié)論一致[39]。同時(shí)，結(jié)合＞180～500 Da 組分應(yīng)為美拉德肽生成過(guò)程主要反應(yīng)肽段的結(jié)果，也證明了本研究中的美拉德反應(yīng)是提高海鮮菇蛋白肽咸味水平的關(guān)鍵步驟之一，由此反應(yīng)生成的小分子量美拉德肽也是構(gòu)成海鮮菇美拉德肽咸鮮味感知的重要組分。

3 結(jié)論

本研究以海鮮菇蛋白肽為原料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化制備了具有特色咸鮮風(fēng)味的海鮮菇美拉德肽。最佳制備工藝條件為葡萄糖∶D?木糖質(zhì)量比為4∶1、反應(yīng)溫度110 ℃、反應(yīng)時(shí)間56 min。海鮮菇美拉德肽褐變程度顯著增強(qiáng)，咸鮮味突出，無(wú)苦味，異味減弱，口感豐富，整體接受度較好。其中，分子量＞180～500 Da 組分推測(cè)為美拉德反應(yīng)的主要活性肽段。電子舌技術(shù)與感官評(píng)分在其鮮、咸、苦、甜的綜合風(fēng)味評(píng)價(jià)方面呈高度正相關(guān)，可在食用菌風(fēng)味評(píng)價(jià)中互為補(bǔ)充。超濾結(jié)果表明，海鮮菇美拉德肽呈咸鮮味的肽分子量主要集中在500 Da 以下。本研究可為擴(kuò)展可替代鈉鹽的新型食用菌調(diào)味領(lǐng)域的研究和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。