玫瑰石斛的化學(xué)成分及其生物活性

莊晨曦 ，王慧敏 ，陳亞萍 ，張 銳 ，鄭金蓉 ，李美紅 ，李玉鵬

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500;2）紅河衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，云南 紅河 661100;3）昆明醫(yī)科大學(xué)現(xiàn)代生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)學(xué)院，云南 昆明 650500;4）云南傳染病醫(yī)院藥劑科，云南 昆明 650301）

玫瑰石斛（Dendrobium crepidatum）主要分布于云南南部至西南部[1]。文獻(xiàn)報(bào)道[2]，玫瑰石斛對(duì)口干煩渴、陰傷津虧、病后虛熱、食欲不振有利，蘊(yùn)含較高的保健價(jià)值，除此之外，其花大而鮮艷，極具觀賞價(jià)值。野生玫瑰石斛資源由于長(zhǎng)期過(guò)度采收，近年來(lái)已大量減少，甚至在有些地區(qū)已瀕臨滅絕[3]。因此，作好玫瑰石斛的栽培、化學(xué)成分和生物活性研究十分重要。

1 材料與方法

1.1 材料

核磁共振波譜儀為AVANCE-400/AVANCE-600 型；柱色譜硅膠為青島海洋化工廠生產(chǎn)；葡聚糖凝膠（安發(fā)瑪西亞生物技術(shù)公司，粒徑40～70 μm）；RP-18 柱色譜材料；所有有機(jī)溶劑均為工業(yè)純，經(jīng)重蒸后備用。10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，A549、MCF-7/S、SKOV-3 腫瘤細(xì)胞株。

1.2 植物來(lái)源

本實(shí)驗(yàn)所用玫瑰石斛樣品于2017 年9 月采自云南省保山龍陵石斛種植基地，經(jīng)鑒定為玫瑰石斛（Dendrobium crepidatum）的全草，標(biāo)本（No.20170917）。

1.3 研究方法

1.3.1 提取與分離方法云南玫瑰石斛干燥全草（3.30 kg），用有機(jī)溶劑甲醇提取，得到總浸膏（53.0 g），所得浸膏用水分散后不同溶劑萃取，得到石油醚萃取部分（15.1 g），乙酸乙酯萃取部分（25.3 g）。從石油醚提取部分得到化合物1～5，乙酸乙酯萃取部分經(jīng)硅膠柱層析、反相柱層析和凝膠柱層析，得到化合物6～9。

石油醚萃取部分，經(jīng)氯仿溶劑溶解，80～100 目的硅膠拌樣，經(jīng)混合溶劑石油醚-丙酮（20∶1～0∶1）梯度洗脫，得到5 個(gè)亞組分（Fr.AFr.F）?；衔?（120 mg）在亞組分Fr.E（1.7 g）中以白色針狀晶體析出，經(jīng)過(guò)濾分離得到。亞組分Fr.C（2.3 g）經(jīng)硅膠石油醚-乙酸乙酯（20∶1～5∶1）溶劑系統(tǒng)洗脫，Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠柱純化，洗脫劑為甲醇-氯仿（20∶1），得到化合物1（5.3 mg）和化合物2（3.1 mg）。亞組分Fr.B（3.1 g）經(jīng)硅膠柱層析，石油醚-丙酮（25∶1～0∶1）溶劑系統(tǒng)洗脫，Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠柱純化，洗脫劑為甲醇-氯仿（20∶1），得到化合物3（4.3 mg）和化合物4（13.1 mg）。

乙酸乙酯部分經(jīng)丙酮溶解，以80～100 目硅膠拌樣，經(jīng) 200～300 目硅膠柱層析，洗脫劑為石油醚-丙酮（9∶1～0∶1），混合溶劑梯度洗脫，合并相同流分得5 個(gè)組分（Fr.A～Fr.E）。

組分Fr.A（5.3 g）經(jīng)硅膠柱層析，洗脫劑為石油醚-丙酮（20∶1～0∶1），經(jīng)混合溶劑洗脫，得到3 個(gè)亞組分（Fr.A1～ Fr.A3）。亞組分Fr.A2（1.5 g），經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚-丙酮（25∶1～5∶1）進(jìn)行洗脫，得到化合物 8（5.6 mg）和化合物9（8.9 mg）。亞組分Fr.A3（0.21 g），經(jīng)凝膠柱層析和反相柱層析，得到化合物6（3.8 mg）和化合物7（7.3 mg）。

1.3.2 化合物的抗腫瘤活性篩選方法化合物5～9 對(duì)3 種腫瘤細(xì)胞株（A549、MCF-7/S、SKOV-3）抑制活性篩選方法為MTT 法[4]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 Microsoft Excel 2010 軟件計(jì)算抑制率，運(yùn)用IBM SPSS Statistics 24 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件計(jì)算化合物的半數(shù)抑制濃度IC50。

2 結(jié)果

2.1 化合物波譜數(shù)據(jù)

2.1.1 化合物 1 p-hydroxybenzaldehyde無(wú)色油狀物。MF: C7H6O2，MW: 122;1H NMR [CD3OD，600 MHz]:δ9.76（1H，s，H-7），7.79（2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6），6.93（2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5）;13C NMR[CD3OD，150 MHz）δ191.69（s，C-7），115.54（d，C-3，5），132.14（d，C-2，6），163.77（s，C-4），127.68（s，C-1）[5]。

2.1.2 化合物2 p-methoxyphenol黃色粉末，MF:C7H8O2，MW: 124;1H NMR [（CD3）2CO，600 MHz]δ3.85（3H，s，4-OCH3），6.74（2H，d，J=8.3 Hz，H-2，6），6.96（2H，d，J=8.3 Hz，H-3，5），7.78（1H，s，1-OH）[6]。

2.1.3 化合物3 p-Hydroxybenzyl alcohol黃色粉末，MF: C7H8O2，MW: 124;1H NMR [（CD3）2CO，600 MHz]:δ4.52（2H，s，H-7），6.78（2H，d，J=8.2 Hz，H-2，6），7.17（2H，d，J=8.2 Hz，H-3，5）;13C NMR[（CD3）2CO，150 MHz]:δ63.76（t，C-7），128.38（d，C-3，5），114.96（d，C-2，6），133.05（s，C-4），156.49（s，C-1）[7]。

2.1.4 化合物4 hydroquinone黃色粉末，MF:C6H6O2，MW: 110;1H NMR [CD3OD，600 MHz]:δ8.22（1H，s，1-OH），7.07（2H，d，J=9.0 Hz，H-2，6），6.95（2H，d，J=9.0 Hz，H-3，5），4.02（1H，s，4-OH）[8]。

2.1.5 化合物 5 （24R）-ethylcholest-5-en-3-ol-7-one白色針狀晶體，MF: C29H48O2，MW: 432;1HNMR [600 MHz，CDCl3]: δ 0.75（3H，s，H-18），0.78（3H，s，H-19），0.79（3H，s，H-29），0.82（3H，d，J=6.7，H-21），0.83（3H，d，J=6.5，H-27），0.86（3H，d，J=6.5，H-26），2.40（2H，m，H-15），2.47（2H，m，H-12），2.48（1H，m，H-28 α），2.51（2H，m，H-23），2.52（2H，m，H-16），2.55（1H，m，H-20），2.56（1H，m，H-11 α），2.45（1H，m，H-28β），2.57（2H，m，H-22），2.57（1H，m，H-11β），2.64（1H，m，H-25），2.81（1H，m，H-2 α），3.19（1H，m，H-2β），3.56（1H，m，H-3），3.79（1H，s，H-7），5.80（1H，d，J=5.1，H-6）.13C NMR [CDCl3，600 MHz]:δ36.12（t，C-1），31.87（t，C-2），65.01（d，C-3），39.63（t，C-4），146.51（s，C-5），126.28（d，C-6），64.02（d，C-7），36.12（d，C-8），53.62（d，C-9），38.00（s，C-10），20.98（t，C-11），42.51（t，C-12），42.50（s，C-13），55.89（d，C-14），24.16（t，C-15），29.15（t，C-16），55.89（d，C-17），12.20（q，C-18），18.73（q，C-19），36.12（d，C-20），19.03（q，C-21），34.26（t，C-22），24.15（t，C-23），53.63（d，C-24），29.14（t，C-25），20.97（q，C-26），19.49（q，C-27），23.06（t，C-28），12.25（q，C-29）[9]。

2.1.6 化合物 6 sinalexin黃棕色固體，MF:C10H8N2oS，MW: 204;1HNMR [CD3OD，600 MHz]:δ8.67（1H，s，H-1 ′），7.79（1H，m，H-4），7.27（1H，m，H-5），7.43（1H，m，H-6），7.55（1H，m，H-7），4.13（3H，s，1-OCH3）;13CNMR[CD3OD，150 MHz]:δ147.51（d，C-1 ′），156.53（s，C-2），124.86（s，C-3），121.13（d，C-4），120.19（d，C-5），124.86（d，C-6），109.43（s，C-7），138.30（s，C-3a），130.57（s，C-7a），58.86（q，1-OCH3）[10-11]。

2.1.7 化合物7 bis（2-ethylhexyl）benzene-1，2-dicarboxylate黃色油狀物。MF: C24H38O4，MW:390;ESI-MS: 391 [M+H]+;1HNMR [CDCl3，600 MHz]:δ7.76（2H，d，J=7.8，H-3，6），7.65（2H，d，J=7.8，H-4，5），4.06（4H，t，J=6.7，H-1 ′），1.68（2H，m，H-2 ′），1.46（4H，m，2 ′-CH2CH3），1.43（4H，m，H-5 ′），1.42（4H，m，H-3 ′），1.41（4H，m，H-4 ′），0.95（6H，t，J=7.3，2 ′-CH2CH3），0.90（6H，t，J=7.2，H-6 ′）;13CNMR [CDCl3，150 MHz]:δ167.15（s，-COO-），131.15（s，C-1，2），132.51（d，C-3，6），128.75（d，C-4，5），67.45（t，C-1 ′），38.77（d，C-2 ′），30.28（t，C-3 ′），27.61（t，C-4 ′），23.61（t，2 ′-CH2CH3），22.75（t，C-5 ′），13.43（q，C-6 ′），10.42（q，2 ′-CH2CH3）[12]。

2.1.8 化合物 8 pinoresinol棕色油狀物，C20H22O6，1H NMR（CD3OD，600 MHz）:δ7.52（2H，s，4 ′-OH，4 ′′-OH），6.99（2H，s，H-2 ′，H-2 ′′），6.83（2H，d，J=8.2 Hz，H-6 ′，H-6 ′′），6.78（2H，d，J=8.2 Hz，H-5 ′，H-H-5 ′′），4.67（2H，d，J=4.2 Hz，H-2，H-6），4.21（2H，dd，J=9.6，7.2 Hz，Hb-4，H-8），3.84（6H，s，3 ′，3 ′′-OCH3），3.80（2H，dd，J=9.6，5.4 Hz，Ha-4，H-8），3.06（2H，m，H-1，H-5）.13C NMR（CD3OD，150 MHz）:δC148.32（s，C-3 ′，C-3 ′′），146.84（s，C-4 ′，C-4 ′′），134.15（s，C-1 ′，C-1 ′′），119.60（d，C-6 ′，C-6 ′′），115.52（d，C-5 ′，C-5 ′′），110.56（d，C-2 ′，C-2 ′′），55.23（d，C-1，C-5），86.63（d，C-2，C-6），72.04（t，C-4，C-8），56.23（d，C-3 ′-OCH3，C-3 ′′-OCH3）[13]。

2.1.9 化合物9 Chaenomin B黃色油狀物，分子式為 C25H25O8。MW: 453;15% H2SO4乙醇顯色為紫色，與該化合物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行TLC 對(duì)照，在多種溶劑系統(tǒng)中Rf值均相同。

2.2 化合物5～9 對(duì)3 種腫瘤細(xì)胞株抑制活性篩選IC50（μM）

化合物5～9 對(duì)3 種腫瘤細(xì)胞株A549、MCF-7/S、SKOV-3 抑制活性結(jié)果，見(jiàn)表1。發(fā)現(xiàn)化合物9 對(duì)A549 細(xì)胞株顯示了較好的抑制活性，其IC50為29.35 μM，其作用略弱于陽(yáng)性對(duì)照品DDP。

表1 化合物5～9 對(duì)3 種細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性IC50（μM）Tab.1 Cytotoxic activities of compounds 5～9 on three cell lines IC50（μM）

3 討論

從玫瑰石斛分離鑒定得到9 個(gè)化合物，分別為p-hydroxybenzaldehyde（1），p-methoxyphenol（2），p-Hydroxybenzyl alcohol（3），hydroquinone（4），（24R）-ethylcholest-5-en-3-ol-7-one（5），sinalexin（6），bis（2-ethylhexyl）benzene-1，2-dicarboxylate（7），pinoresinol（8），Chaenomin B（9），化合物5～9 抗腫瘤活性測(cè)試結(jié)果表明，化合物9 對(duì)A549 細(xì)胞株顯示了較好的抑制活性?；衔?～5，7，8 為首次從本植物中分離得到，化合物6，9 為首次從本屬植物中分離得到，9 對(duì)A549 細(xì)胞株IC50為29.35 μM。

藥理研究報(bào)道，玫瑰石斛能夠在一定程度上抑制炎癥的形成和發(fā)展。國(guó)內(nèi)學(xué)者從玫瑰石斛得到一對(duì)外消旋二聚體（±）HomocrepidineA 和1 種哌啶類生物堿HomocrepidineB，利用甲苯誘導(dǎo)創(chuàng)建小鼠耳腫脹模型，證實(shí)了上述物質(zhì)的抗炎作用[14]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰石斛所含總生物堿（Total alkaloids）可對(duì)脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）產(chǎn)生抑制作用，并對(duì)LPS 引起的小鼠急性肺損傷提供保護(hù)作用，深入的化學(xué)分析結(jié)果顯示，吲哚嗪類化合物是玫瑰石斛抗炎功效的來(lái)源[15]。對(duì)玫瑰石斛素的生物活性進(jìn)行了研究，并證明其在實(shí)驗(yàn)中顯示較強(qiáng)體外活性，可對(duì)抗由LPS 引起的小鼠急性肺損傷[16]。張朝鳳等[17]發(fā)現(xiàn)，玫瑰石斛總生物堿具有良好的抗炎活性。筆者對(duì)玫瑰石斛的化學(xué)和生物活性研究對(duì)該植物的利用開發(fā)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)該屬植物進(jìn)行化學(xué)和藥理活性研究，李燕等[18]從鐵皮石斛得到2個(gè)聯(lián)芐類化合物4，4，′-二羥基-3，5-二甲氧基聯(lián)芐和4，4′-二羥基-3，3′，5-二甲氧基聯(lián)芐，化合物1 表現(xiàn)出對(duì) A2780 細(xì)胞毒活性（IC50=4.45 μM），化合2 表現(xiàn)出對(duì)A2780 細(xì)胞毒活性（IC50=1.41 μM），化合物還顯示出對(duì)BGC-823 的弱細(xì)胞毒活性，IC50值為 2.82 μM。Sopanya等[19]發(fā)現(xiàn)Gigantol 具有抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移作用；Klongkumnuankarn 等[20]發(fā)現(xiàn)該化合物不僅具有細(xì)胞毒性，還具有抗遷移活性；陳歡歡等[21]發(fā)現(xiàn)石斛酚確實(shí)具有抑制人肝癌細(xì)胞HepG2 的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡的作用，并且通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K-Akt 信號(hào)通路誘導(dǎo)HepG2 生長(zhǎng)抑制及細(xì)胞的凋亡。