伍隍豬和內(nèi)江豬拷貝數(shù)變異差異與嘴型全基因組關(guān)聯(lián)分析

劉成銘，楊祎挺，甘麥鄰，楊佳珺，李永紅，沈林園*，朱 礪*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽生物組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130；3.四川永鑫農(nóng)牧集團(tuán)股份有限公司，四川 資陽(yáng)，641300）

伍隍豬主要分布于四川省資陽(yáng)市雁江區(qū)，飼養(yǎng)歷史悠久[1]，具有適應(yīng)性強(qiáng)、母性好、肉質(zhì)優(yōu)良等優(yōu)點(diǎn)；但同時(shí)也存在生長(zhǎng)慢、料肉比過(guò)高等問(wèn)題。據(jù)《雁江區(qū)志》（1986—2005）記載，1988年內(nèi)江市畜牧部門依據(jù)當(dāng)時(shí)國(guó)家提倡同一地區(qū)不同品種以類群合并的政策將“伍隍老槽豬”命名為“內(nèi)江豬伍隍類群”。隨后因內(nèi)江市與資陽(yáng)市行政轄區(qū)變更及外來(lái)品種的沖擊，在1999年的全國(guó)畜牧遺傳資源動(dòng)態(tài)補(bǔ)充調(diào)查中，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部宣布伍隍豬遺傳資源已經(jīng)滅絕。但隨著國(guó)內(nèi)對(duì)地方種群保護(hù)意識(shí)的不斷增強(qiáng)，研究人員對(duì)伍隍豬種群進(jìn)行重收集，并利用基因組測(cè)序手段證明現(xiàn)今伍隍豬與內(nèi)江豬的遺傳結(jié)構(gòu)存在差異，是有相同地理起源的2個(gè)不同品種[2]。

CNV 為基因組序列中長(zhǎng)度為50 bp～5 Mb 的一種變異類型。在群體中，不同個(gè)體間重疊的CNV區(qū)域整合結(jié)果稱為CNVR。當(dāng)CNV 位于蛋白質(zhì)編碼基因或miRNA基因區(qū)域時(shí)，可能會(huì)影響生物的表型和對(duì)疾病的易感性[3-6]。從基因組中檢測(cè)CNV 的常用方法有芯片法和測(cè)序法，芯片法主要包括比較基因組雜交芯片（array comparative genomic hybridization，aCGH）和SNP 芯片（single nucleotide polymorphism arrays）。DNA測(cè)序法主要包括全基因組測(cè)序（whole genome sequencing，WGS）和單分子測(cè)序。前期由于測(cè)序成本高，大部分動(dòng)物遺傳育種研究利用aCGH陣列和SNP芯片方法來(lái)檢測(cè)動(dòng)物基因組中的CNV。但該方法檢測(cè)數(shù)據(jù)在基因組上的覆蓋度有限且分辨率低，難以檢測(cè)到新的或罕見(jiàn)的CNV[7-10]。

CNV 在人類先天性遺傳缺陷疾病的研究中同樣應(yīng)用廣泛，隨著CNV 研究的深入，逐漸在畜禽行業(yè)應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)[11-16]。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)王源[17]通過(guò)檢測(cè)大白豬的CNV，發(fā)現(xiàn)2 個(gè)與產(chǎn)仔數(shù)性狀有顯著關(guān)聯(lián)的CNVR，篩選到2個(gè)與繁殖性狀相關(guān)的功能基因。江西農(nóng)業(yè)大學(xué)的宿英團(tuán)隊(duì)[18]利用豬Illumina 60 SNP 芯片對(duì)純種杜洛克、長(zhǎng)白、大白、皮特蘭豬進(jìn)行掃描，篩選到4個(gè)CNV同時(shí)影響臍疝和陰囊/腹股溝疝，結(jié)果暗示疝氣發(fā)病可能存在共同的影響通路。

先前的研究?jī)H使用SNP 信息揭示了伍隍豬與內(nèi)江豬遺傳結(jié)構(gòu)的差異，但伍隍豬與內(nèi)江豬基因組中的CNV 的差異至今鮮有報(bào)道，伍隍豬的CNV 鑒定有助于描述伍隍豬品種基因組中的特性，探究伍隍豬與內(nèi)江豬的基因組特征、遺傳多樣性與復(fù)雜性狀的遺傳關(guān)系。此外，探究CNV與嘴長(zhǎng)表型之間的聯(lián)系有利于解釋“豪桿嘴”表型的形成機(jī)制，為中國(guó)地方品種的改良與資源利用提供研究基礎(chǔ)。

因此，本研究旨在利用SNP芯片探究伍隍豬在人工選擇中形成的拷貝數(shù)變異差異與獨(dú)特表型的誘因，并運(yùn)用全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）探究與伍隍豬嘴型相關(guān)的候選基因與決定機(jī)制。為我國(guó)優(yōu)質(zhì)地方種源保護(hù)以及種群多樣性與開(kāi)發(fā)利用提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集與表型測(cè)定

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自四川資陽(yáng)市永鑫畜牧養(yǎng)殖有限公司民合生豬專業(yè)合作社與四川省內(nèi)江市內(nèi)江豬國(guó)家保種場(chǎng)。采集伍隍豬全保種群共計(jì)131頭個(gè)體（包括7 頭公豬，79 頭母豬，45 頭后備母豬）的耳組織樣品與內(nèi)江豬156 頭個(gè)體（公豬20 頭，母豬136頭）的耳組織樣品。本研究采用嘴長(zhǎng)作為研究性狀，通過(guò)對(duì)豬只保定后測(cè)量吻突正中位置至額中部突起前緣（cm）收集“嘴長(zhǎng)”表型數(shù)據(jù)。共采集伍隍豬群體中的86 頭個(gè)體的嘴長(zhǎng)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2 DNA提取與基因分型

使用酚-氯仿法提取耳組織DNA,經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計(jì)鑒定質(zhì)量，符合分型標(biāo)準(zhǔn)后送北京康普森公司進(jìn)行豬中芯一號(hào)50 k SNP芯片進(jìn)行基因分型。

1.3 原始數(shù)據(jù)處理與拷貝數(shù)變異檢測(cè)、過(guò)濾

使用Python（v3.9.10）編寫腳本處理為包含每頭豬SNP編號(hào)、染色體編號(hào)、SNP位點(diǎn)、BAF值、LRR值5 列的文件。隨后使用PennCNV（v1.0.7）和R-Gada（v0.7）分別進(jìn)行拷貝數(shù)變異檢測(cè)。同時(shí)對(duì)檢測(cè)出來(lái)CNV記錄進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾條件為：CNV長(zhǎng)度大于10 kb，CNV包含的最小SNP數(shù)為3。

其中，PennCNV[19]檢測(cè)CNV 使用的是隱馬爾可夫模型（hidden Markov model，HMM），HMM 是一種對(duì)馬爾可夫過(guò)程進(jìn)行建模的統(tǒng)計(jì)技術(shù)，其中在特定時(shí)間點(diǎn)觀察特定狀態(tài)的概率僅取決于先前時(shí)間點(diǎn)的狀態(tài)。HMM 提供了自然的統(tǒng)計(jì)框架，用于模擬附近SNP拷貝數(shù)之間的依賴結(jié)構(gòu)。

其中ri、bi、zi分別代表SNPi處的logR比率、B等位基因頻率與拷貝數(shù)變異狀態(tài)。

而R-Gada[20]檢測(cè)CNV 使用的是貝葉斯算法（sparse Bayesian learning，SBL）（公式2）與反向消除算法（backward elimination，BE）（公式3）結(jié)合，利用SBL進(jìn)行分段分析，然后再用BE評(píng)估分段結(jié)果的顯著性，二者結(jié)合可以提供1 組接近最佳的振幅和斷點(diǎn)位置，以最符合陣列中觀察到的log2比率。

其中γ由Gada 函數(shù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)生成，α由用戶輸入設(shè)置，范圍為0.2～0.8。

1.4 共同CNVR數(shù)據(jù)整理與CNVR結(jié)果注釋

針對(duì)PennCNV和R-Gada檢測(cè)出來(lái)的拷貝數(shù)變異，使用Python提取出每條拷貝數(shù)變異記錄的染色體編號(hào)、起始位點(diǎn)與終止位點(diǎn)信息并整理為Excel文件，隨后使用Bedtools 軟件的-merge 命令對(duì)拷貝數(shù)變異的坐標(biāo)取并集進(jìn)行合并，得到CNVR[21]，用于后續(xù)分析。

利用Ensembl 網(wǎng)站的Biomart 工具，對(duì)Bedtools合并后得到的CNVR 進(jìn)行基因注釋，得到CNVR 中所涵蓋的基因信息，基因組選擇Pig genes（Sscrofa11.1），同時(shí)，對(duì)內(nèi)江豬與伍隍豬群體的注釋結(jié)果進(jìn)行篩選，得到2個(gè)群體間的差異基因，用于后續(xù)分析。

1.5 差異基因功能富集分析

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)注釋到的基因進(jìn)行GO（Genontology）基因本體功能富集和KEGG（Kyoto Encyclopediaof Genesand Genomes）Pathway 富集分析，當(dāng)P<0.05 時(shí)，則表示顯著富集。隨后，利用微生信網(wǎng)站（http://www.bioinformatics.com.cn/basic_local_go_pathway_enrichment_analysis_122）進(jìn)行功能富集的可視化。

1.6 全基因組關(guān)聯(lián)分析

針對(duì)伍隍豬的嘴長(zhǎng)表型，將所有實(shí)驗(yàn)豬的嘴長(zhǎng)表型和家系信息、SNP 芯片信息和拷貝數(shù)變異信息匯總以后，使用GEMMA（v0.98.5）進(jìn)行GWAS 分析，分析過(guò)程中采用混合線性模型（linear mixed model，LMM）進(jìn)行估計(jì)：

其中，Y表示嘴長(zhǎng)表型值；μ表示嘴長(zhǎng)平均值；X表示固定效應(yīng)矩陣，b為固定效應(yīng)向量；u表示剩余多基因效應(yīng)；e表示產(chǎn)仔表型值的隨機(jī)殘差，u和e均服從正態(tài)分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

伍隍豬最突出的特點(diǎn)為嘴長(zhǎng)（如圖1A），而內(nèi)江豬主要表型特點(diǎn)為嘴短、頭大（如圖1B）。表1為伍隍豬群體與內(nèi)江豬群體的體尺數(shù)據(jù)，其中伍隍豬群體的嘴長(zhǎng)[（11.12±2.78）cm]顯著長(zhǎng)于內(nèi)江豬群體[（5.04±1.26）cm，P<0.05]。伍隍豬的體高、體長(zhǎng)與嘴斜長(zhǎng)數(shù)據(jù)均顯著高于內(nèi)江豬（P<0.05），并且體高與體長(zhǎng)數(shù)據(jù)差異極顯著（P<0.01）。

圖1 伍隍豬與內(nèi)江豬嘴長(zhǎng)對(duì)比Figure 1 Comparison chart of mouth length of Wuhuang pig and Neijiang pig

表1 內(nèi)江豬與伍隍豬體尺數(shù)據(jù)Table 1 Body size data of Neijiang pig and Wuhuang pigcm

表2 PennCNV的拷貝數(shù)變異檢測(cè)結(jié)果Table 2 Copy number variation test results for PennCNV

表3 R-Gada（v0.7）的拷貝數(shù)變異檢測(cè)結(jié)果Table 3 Copy number variation detection results f or R-Gada （v0.7）

表4 不同軟件檢測(cè)的CNVR在染色體中的數(shù)量Table 4 The number of CNVRs detected by different software in chromosomes

2.2 拷貝數(shù)變異檢測(cè)

2.2.1 PennCNV檢測(cè)結(jié)果

使用PennCNV，在伍隍豬群體中檢測(cè)出664 條CNV記錄，其中缺失類型CNV有379條，占50.78%；獲得類型CNV 有285 條，占42.92%。其中13 號(hào)染色體上檢出的CNV記錄最多，有85條；16號(hào)染色體中檢出的數(shù)量最少，有2條。

在內(nèi)江豬群體中檢測(cè)出981條CNV 記錄，其中缺失類型CNV 有320 條，占32.62%；獲得類型CNV有661 條，占67.38%。其中1 號(hào)染色體上檢出的CNV 記錄最多，有116條；17、18號(hào)染色體中檢出的數(shù)量最少，各4條。

2.2.2 R-Gada檢測(cè)結(jié)果

使用R-Gada，在伍隍豬群體中檢測(cè)出833 條CNV記錄，其中缺失類型CNV有608條，占73.00%；獲得類型CNV 有225 條，占27.00%。其中2 號(hào)染色體上檢出的CNV記錄最多，有175條；5號(hào)染色體中檢出的數(shù)量最少，有8條。

在內(nèi)江豬群體中檢測(cè)出1 096 條CNV 記錄，其中缺失類型CNV 有774 條，占70.62%；獲得類型CNV 有322 條，占29.38%。其中2 號(hào)染色體上檢出的CNV記錄最多，有238條；16、18號(hào)染色體中檢出的數(shù)量最少，各20條。

2.3 共同CNVR合并與CNVR結(jié)果注釋

對(duì)PennCNV 和R-Gada 的檢測(cè)結(jié)果使用Bedtools進(jìn)行合并，在伍隍豬群體1～18號(hào)染色體上共整理出120個(gè)和143個(gè)CNVR。內(nèi)江豬群體1～18號(hào)染色體上共整理出123個(gè)和159個(gè)CNVR。

對(duì)得到的CNVR 數(shù)據(jù)進(jìn)一步整理后進(jìn)行可視化，結(jié)果如圖2。分別對(duì)從PennCNV和R-Gada結(jié)果中整理得出的CNVR 用R-BioMart 進(jìn)行注釋。在伍隍豬群體中，共注釋得到403和207個(gè)基因，合并后共有555個(gè)基因；在內(nèi)江豬群體中，共注釋到454和287 個(gè)基因，合并后共有585 個(gè)基因。對(duì)注釋得到基因進(jìn)行篩選，共得到386個(gè)差異基因。

圖2 伍隍豬（A）與內(nèi)江豬（B）CNVR在染色體上的分布Figure 2 Distribution of CNVR on chromosomes in Neijiang pigs （A） and Wuhuang pigs （B）

2.4 基因功能富集與互作分析

將注釋得到的CNVR 差異基因通過(guò)DAVID 網(wǎng)站（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）工具進(jìn)行富集分析，在分析結(jié)果中選擇GO和KEGG富集分析項(xiàng)，GO富集到72條通路，其中P<0.05的通路有33條，其中13 屬于Biological process 通路，11 條屬于Cellular component 通路，9 條屬于Molecular function 通路；KEGG 富集共富集到15 條通路，其中Pathways of neurodegeneration-multiple diseases 通路富集到的基因最多，有14個(gè)，Sphingolipid signaling pathway 富集的P值最小為0.001 048 496；同時(shí)，有MAPK10、FOSL1、MAPK11、SPI1、FYN和MAPK126 個(gè)基因富集到破骨細(xì)胞分化通路。對(duì)富集結(jié)果進(jìn)行可視化，結(jié)果如圖3A，圖3B所示。進(jìn)一步對(duì)KEGG 富集最高的前10條通路中基因進(jìn)行相互作用分析，結(jié)果表明MAPK12位于網(wǎng)絡(luò)中心，同時(shí)MAPK10、FYN、FOSL1、PLD1、PPARA、INS處于中心節(jié)點(diǎn)位置。對(duì)基因互作結(jié)果進(jìn)行可視化，結(jié)果如圖4所示。

圖3 GO（圖A）和KEGG（圖B）差異基因富集結(jié)果Figure 3 Results of differential gene enrichment for GO （panel A） and KEGG （panel B）

圖4 差異基因互作分析結(jié)果Figure 4 Results of differential gene interaction analysis

2.5 全基因組關(guān)聯(lián)分析

伍隍豬群體的表型數(shù)據(jù)中，對(duì)記錄嘴長(zhǎng)表型數(shù)據(jù)的86 頭伍隍豬，整理其家系信息、表型信息和拷貝數(shù)變異信息后，使用GEMMA 對(duì)嘴長(zhǎng)表型與拷貝數(shù)變異進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共檢測(cè)出49個(gè)極顯著位點(diǎn)，（P<0.001），分布在1、3、4、5、7、8、12、13、14、15 號(hào)染色體上，顯著性最高的位點(diǎn)位于15 號(hào)染色體上；其中15 號(hào)染色體上位點(diǎn)最多有23 個(gè)，1 號(hào)3 號(hào)和12 號(hào)染色體最少各有1 個(gè)；選取49 個(gè)極顯著位點(diǎn)其附近10 k 的區(qū)域合并后進(jìn)行注釋后得到11 個(gè)基因，分別為RANGRF、SLC25A35、ARHGEF15、GORASP2、TLK1、CWC22、MOSMO、TMEM64、KLHL31、C4orf19和ENSSSCG00000048542。GWAS結(jié)果可視化后，結(jié)果如圖5和圖6所示。

圖5 與嘴長(zhǎng)相關(guān)的基因位點(diǎn)在染色體上分布的曼哈頓圖Figure 5 Manhattan plot of the distribution of gene loci associated with mouth length on chromosomes

圖6 嘴長(zhǎng)表型GWAS結(jié)果QQ圖Figure 6 QQ plot of mouth long phenotype GWAS results

3 討論與結(jié)論

先前的研究結(jié)果表明，從體型外貌和基因?qū)用娴确矫骘@示，內(nèi)江豬與伍隍豬是地理同源但不為同一品種的2個(gè)群體[2]。在本研究結(jié)果中，相較于內(nèi)江豬，伍隍豬缺失類型CNV 比例增加，獲得類型CNV比例減少，并在PennCNV 與R-Gada 檢測(cè)的結(jié)果中呈現(xiàn)出相同趨勢(shì)。CNV 數(shù)據(jù)差異反映出內(nèi)江豬與伍隍豬拷貝數(shù)變異的品種特異性[22]，為先前將2 個(gè)品種進(jìn)行劃分提供新證據(jù)。其次，從CNVR 的統(tǒng)計(jì)結(jié)果來(lái)看，內(nèi)江豬在1號(hào)染色體上CNVR分布最多，伍隍豬在2 號(hào)染色體上CNVR 分布最多，但總的來(lái)看，2 個(gè)群體CNVR 均在1、2 號(hào)染色體上數(shù)量最多，在17 號(hào)染色體上數(shù)量最少；另外，CNVR 的可視化結(jié)果反映出2 個(gè)群體的CNVR 分布有一定相似性，揭示了內(nèi)江豬與伍隍豬有著共同的起源。

基于2 個(gè)群體可能有著相同起源這一假設(shè)，本研究對(duì)CNV 檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)一步進(jìn)行了基因功能富集分析與差異基因互作分析。對(duì)于GO 富集結(jié)果，差異基因較多富集在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)等與細(xì)胞組分相關(guān)的信號(hào)通路和ATP 結(jié)合、金屬離子結(jié)合、同一蛋白質(zhì)結(jié)合等與能量代謝相關(guān)的信號(hào)通路；對(duì)于KEGG富集結(jié)果，差異基因主要富集在神經(jīng)退行性病變通路，這一通路與許多神經(jīng)疾病發(fā)生息息相關(guān)；另外，有6個(gè)基因(MAPK10、FOSL1、MAPK11、SPI1、FYN、MAPK12)富集到破骨細(xì)胞分化通路，破骨細(xì)胞是骨吸收的主要功能細(xì)胞，在骨發(fā)育、生長(zhǎng)、修復(fù)、重建中具有重要的作用，同時(shí)也參與骨形成調(diào)控，這可能是伍隍豬與內(nèi)江豬嘴型長(zhǎng)短存在差異的原因。對(duì)KEGG 前10 條富集到的差異基因進(jìn)一步進(jìn)行差異基因蛋白互作分析后，發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞分化通路相關(guān)基因MAPK12位于網(wǎng)絡(luò)中心，MAPK10，F(xiàn)OSL1，MAPK11等則處于中心節(jié)點(diǎn)位置，表明伍隍豬與內(nèi)江豬CNV 的差異可能主要與骨細(xì)胞發(fā)育與增殖分化相關(guān)。此外，這些基因與免疫細(xì)胞的發(fā)育與癌細(xì)胞的發(fā)生與清除密切相關(guān)[23-24]。其中，MAPK12是MAPK信號(hào)通路的重要組成部分，而MAPK信號(hào)通路一方面可以調(diào)解成骨性基因[25-26]的表達(dá)與細(xì)胞增殖，另一方面還會(huì)影響豬類固醇激素的分泌，表明內(nèi)江豬與伍隍豬嘴型決定機(jī)制可能與MAPK信號(hào)通路相關(guān)。

針對(duì)伍隍豬群體嘴長(zhǎng)表型進(jìn)行GWAS，在曼哈頓圖結(jié)果顯示極顯著位點(diǎn)多分布于15號(hào)染色體上。最后的注釋結(jié)果在15 號(hào)染色體注釋到3 個(gè)基因GORASP2、TLK1和CWC22，其中GORASP2與自噬體成熟[27-28]與部分核蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)[29]密切相關(guān)；TLK1高表達(dá)則會(huì)加重缺血性腦卒中后神經(jīng)元損傷和神經(jīng)功能缺損[30]，并會(huì)影響肝癌[31]和前列腺癌[32]發(fā)生；CWC22則是與mRNA剪接與外顯子連接密切相關(guān)[33-34]。盡管GWAS 結(jié)果顯示極顯著位點(diǎn)大多位于15 號(hào)染色體上，但在15號(hào)染色體上并未找到我們所期望的與骨骼發(fā)育或骨細(xì)胞增殖分化相關(guān)的基因。15 染色體上注釋到的基因多與細(xì)胞自噬與翻譯過(guò)程相關(guān)，說(shuō)明伍隍豬嘴長(zhǎng)表型的決定可能還存在與翻譯后加工相關(guān)的獨(dú)特機(jī)制。相反地，在4 號(hào)染色體上注釋到的TMEM64卻與骨骼發(fā)育或骨細(xì)胞增殖分化高度相關(guān)。TMEM64表達(dá)下調(diào)使破骨細(xì)胞數(shù)量減少，導(dǎo)致成骨細(xì)胞顯著增加[35]；并減少骨髓來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化[36]；同時(shí)，TMEM64表達(dá)水平下降也可能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[37]，說(shuō)明伍隍豬骨量或骨質(zhì)的差異可能會(huì)導(dǎo)致嘴長(zhǎng)表型發(fā)生變化。但是，目前鮮有研究報(bào)道TMEM64與豬的嘴長(zhǎng)表型相關(guān)。綜上，對(duì)GWAS注釋的結(jié)果進(jìn)一步進(jìn)行篩選，得到3個(gè)與伍隍豬嘴長(zhǎng)表型的候選基因GORASP2、CWC22和TMEM64，相關(guān)遺傳機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究基于SNP 芯片進(jìn)一步證明了伍隍豬與內(nèi)江豬在長(zhǎng)期的進(jìn)化選育中的基因組拷貝數(shù)變異差異；同時(shí)，2個(gè)群體的差異基因富集到一些與細(xì)胞組分，如細(xì)胞核、核質(zhì)和能量代謝，如ATP 結(jié)合、金屬離子結(jié)合相關(guān)的信號(hào)通路；另一方面，差異基因互作分析顯示MAPK12位于互作網(wǎng)絡(luò)的中心位置，這些通路與基因可能與伍隍豬嘴型相關(guān)。最后，GWAS結(jié)果尋找到49個(gè)極顯著位點(diǎn)，這些位點(diǎn)多位于15號(hào)染色體上，經(jīng)注釋后得到與自噬體成熟和核蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因GORASP2，以及與mRNA的剪接與外顯子連接相關(guān)的基因CWC22；同時(shí)，在4 號(hào)染色體上，注釋得到的基因TMEM64與骨骼發(fā)育或骨細(xì)胞增殖分化相關(guān)。以上4 個(gè)基因MAPK12、GORASP2、CWC22、TMEM64均有可能為伍隍豬嘴長(zhǎng)表的候選基因，相關(guān)的機(jī)制與作用還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。