寄生蟲(chóng)14-3-3蛋白的生物學(xué)功能研究進(jìn)展

李艷娥，古小彬

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130）

14-3-3蛋白最先由Moore 和Perez 兩位研究人員于牛腦組織提取的神經(jīng)元蛋白中發(fā)現(xiàn)，之后被命名為14-3-3[1]，又稱為酪氨酸3-加單氧酶/色氨酸5-加單氧酶激活蛋白[2]，該蛋白廣泛分布于動(dòng)物、植物、真菌等多個(gè)物種。近年來(lái)，隨著對(duì)14-3-3蛋白的深入研究，越來(lái)越多新的生物學(xué)功能逐漸被發(fā)現(xiàn)，該蛋白參與多種細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞周期控制、細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的增殖分化等[3-4]。因此，對(duì)寄生蟲(chóng)14-3-3 蛋白功能的研究，可更好的了解其在寄生蟲(chóng)致病過(guò)程中所發(fā)揮的重要作用，為臨床上防治寄生蟲(chóng)疾病提供新的靶標(biāo)。本文主要對(duì)近10年（2013—2023）寄生蟲(chóng)14-3-3 蛋白的結(jié)構(gòu)、定位以及生物學(xué)功能的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 14-3-3蛋白的分型與結(jié)構(gòu)

1.1 14-3-3蛋白的分型

在高等真核生物中存在多種14-3-3亞型，且不同的物種之間含有的亞型數(shù)目各不相同。如哺乳動(dòng)物有7種14-3-3亞型，分別用β、ε、η、γ、θ、ζ、σ來(lái)表示，而植物的14-3-3 亞型可多達(dá)15 種[5]；單細(xì)胞或者低等真核生物通常有1-2種14-3-3亞型[6]。

目前已報(bào)道14-3-3 蛋白的寄生蟲(chóng)有糞類圓線蟲(chóng)（Strongyloidesstercoralis）[7]、旋毛蟲(chóng)（Trichinella britovi）[8]、弓形蟲(chóng)（Toxoplasmagondii）[9]、犬新孢子蟲(chóng)（Neosporacaninum）[10]、惡性瘧原蟲(chóng)（Plasmodiumfalciparum）[11]、溶組織內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)（Entamoebahistolytica）[12]、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)（Eimeriatenella）[13]等，但它們的14-3-3 亞型數(shù)量和類型存在差異（表1）。溶組織內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)至少有3 種亞型[12]；豬帶絳蟲(chóng)（Taeniasolium）報(bào)道了6 個(gè)14-3-3 基因，其中有2 個(gè)基因尚未明確其蛋白亞型，故通常認(rèn)為是4 種亞型[14]。

表1 近十年內(nèi)報(bào)道的寄生蟲(chóng)14-3-3蛋白亞型Table 1 Isoform of parasite 14-3-3 protein reported in the last decade

1.2 14-3-3蛋白的結(jié)構(gòu)

14-3-3蛋白的分子量在25-33 kDa 之間，由247-280 個(gè)氨基酸組成[19-20]，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋，β-轉(zhuǎn)角，擴(kuò)展鏈和無(wú)規(guī)則卷曲4 種結(jié)構(gòu)組成[14]，其中α-螺旋結(jié)構(gòu)所占比例最高，其他3種結(jié)構(gòu)在不同種寄生蟲(chóng)中占比不同[9,14,21]。14-3-3 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要以兩個(gè)反向平行的單體締合成同源或者異源二聚體的形式存在（圖1），依靠Leu、Ala、Ile和Tyr的氨基酸側(cè)鏈之間的疏水力和靜電力驅(qū)使兩個(gè)單體間形成一個(gè)“U”形或杯型凹槽[20]，不變殘基多分布于凹槽內(nèi)壁，而可變殘基位于凹槽的突出面外壁上[22]，該凹槽具有兩親性，兩側(cè)分別攜帶極性殘基和疏水殘基構(gòu)成極性面和非極性面，用于結(jié)合靶蛋白上的磷酸化殘基[11]。

圖1 細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)14-3-3蛋白各亞型同源二聚體建模3D結(jié)構(gòu)[23]Figure 1 3D structure modeling of homologous dimers of14-3-3 protein isoform of Echinococcus granulosus[23]

2 寄生蟲(chóng)14-3-3蛋白的表達(dá)與定位

2.1 寄生蟲(chóng)14-3-3蛋白的表達(dá)

吸蟲(chóng)研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3 蛋白在日本血吸蟲(chóng)（Schistosomajaponicum）的成蟲(chóng)和童蟲(chóng)階段均有轉(zhuǎn)錄表達(dá)，但其在毛蚴的表達(dá)量高于成蟲(chóng)[24-25]；14-3-3蛋白在麝貓后睪吸蟲(chóng)（Opisthorchisviverrine）的蟲(chóng)卵、尾蚴和成蟲(chóng)階段具有轉(zhuǎn)錄表達(dá)，但在成蟲(chóng)階段的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量最高[26]。

絳蟲(chóng)14-3-3 蛋白主要在豬帶絳蟲(chóng)的成蟲(chóng)和囊尾蚴階段轉(zhuǎn)錄表達(dá)，但該蛋白不同亞型在不同階段的表達(dá)量存在差異，如14-3-3.1-4在囊尾蚴階段表達(dá)水平更高，且表達(dá)量以14-3-3.2、14-3-3.4、14-3-3.1、14-3-3.3 的順序遞減，而14-3-3.5-6 在成蟲(chóng)階段的表達(dá)水平更高[14,27-28]。

14-3-3 蛋白在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)（E.granulosus）的棘球蚴階段的表達(dá)量最高[23]。14-3-3 蛋白在旋毛蟲(chóng)的肌幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)階段也都均有轉(zhuǎn)錄表達(dá)[26]。14-3-3蛋白主要在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)和巨型艾美耳球蟲(chóng)的子孢子和第二代裂殖子階段轉(zhuǎn)錄表達(dá)，且表達(dá)水平會(huì)隨著寄生蟲(chóng)的生長(zhǎng)而逐漸降低[13,16]。

2.2 寄生蟲(chóng)14-3-3蛋白的定位

吸蟲(chóng)日本血吸蟲(chóng)14-3-3 蛋白分布于蟲(chóng)體的皮層、皮下層、肌層和實(shí)質(zhì)層[24]，且在蟲(chóng)卵內(nèi)毛蚴的體壁和左右兩側(cè)腺體中含量尤其高，體壁是血吸蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵部位，提示14-3-3可能在蟲(chóng)體的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用[29]；而曼氏血吸蟲(chóng)（S.mansoni）14-3-3 蛋白主要分布于成蟲(chóng)的排泄系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)，包括在卵黃細(xì)胞和卵母細(xì)胞的胞漿、胞核中都有分布，同時(shí)在尾蚴的皮層和肌層也有分布[30]。

華支睪吸蟲(chóng)（Clonorchissinensis）14-3-3 蛋白天然蛋白則主要分布于成蟲(chóng)的外表面、吸盤(pán)和囊蚴的囊壁上，在生殖系統(tǒng)（如精母細(xì)胞）中也有部分定位表達(dá)[31]。

線蟲(chóng)旋毛蟲(chóng)14-3-3 蛋白主要分布于成蟲(chóng)和童蟲(chóng)的蟲(chóng)體兩端[26]。

原蟲(chóng)犬新孢子蟲(chóng)14-3-3 蛋白主要定位于蟲(chóng)體的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，同時(shí)還在寄生泡中存在，能夠促進(jìn)寄生泡膜的形成[10,15]；布氏錐蟲(chóng)和溶組織內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)的14-3-3 蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)[1,12]；而惡性瘧原蟲(chóng)14-3-3I主要定位于成熟裂殖體和游離裂殖子的細(xì)胞外圍[11]。

3 寄生蟲(chóng)14-3-3蛋白的生物學(xué)功能

14-3-3 蛋白發(fā)揮其生物學(xué)功能多是與其他蛋白結(jié)合，通過(guò)蛋白間相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。能夠與14-3-3 蛋白結(jié)合的互作蛋白高達(dá)200 多種，包括Raf 激酶，磷酸酶和跨膜受體等[2,32]，14-3-3 蛋白利用其結(jié)構(gòu)凹槽來(lái)結(jié)合這些磷酸化或非磷酸化配基，通過(guò)調(diào)控靶蛋白從而參與到寄生蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、運(yùn)動(dòng)與入侵以及對(duì)宿主的免疫調(diào)控和信號(hào)傳導(dǎo)等重要的過(guò)程當(dāng)中。

3.1 14-3-3蛋白調(diào)控寄生蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育

14-3-3 蛋白在大多數(shù)寄生蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中都能表達(dá)，其可通過(guò)影響酶活性或干擾細(xì)胞分裂周期等多種形式來(lái)對(duì)自身發(fā)育進(jìn)行調(diào)控，表明該蛋白在寄生蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育等過(guò)程中至關(guān)重要。柔嫩艾美耳球蟲(chóng)14-3-3 蛋白基因與端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA 結(jié)合域直接結(jié)合，抑制端粒酶活性，對(duì)細(xì)胞的持續(xù)增殖和寄生蟲(chóng)生命周期發(fā)揮調(diào)控作用[33]；布氏錐蟲(chóng)14-3-3蛋白多以異源二聚體的形式存在，已證明這種形式不僅有助于維持亞型的穩(wěn)定水平，而且還能有效控制細(xì)胞周期和胞質(zhì)分裂[17]；藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)（Giardialamblia）14-3-3 與肌動(dòng)蛋白絲的形成有關(guān)，除維持G/F-肌動(dòng)蛋白穩(wěn)態(tài)外，似乎還可能在肌動(dòng)蛋白復(fù)合物的亞功能化中起作用[34]。

3.2 14-3-3蛋白調(diào)控寄生蟲(chóng)入侵宿主過(guò)程

有關(guān)14-3-3 蛋白在寄生蟲(chóng)入侵宿主組織中的作用的報(bào)道多集中于原蟲(chóng)，如溶組織內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)的滋養(yǎng)體前緣和偽足部位有大量14-3-3.3（EhP3）富集，推測(cè)該蛋白可能與阿米巴原蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)性相關(guān)，此外，在紅細(xì)胞附著于滋養(yǎng)體時(shí)，EhP3會(huì)迅速募集于附著點(diǎn)直至吞噬過(guò)程完成，提示該蛋白還可能會(huì)參與紅細(xì)胞的吞噬過(guò)程[12]。

惡性瘧原蟲(chóng)裂殖子14-3-3I可與宿主的鈣依賴性蛋白激酶1（CDPK1）、蛋白激酶A 的調(diào)節(jié)亞基（PKAr）相互作用形成多蛋白復(fù)合物，其中14-3-3作為支架蛋白介導(dǎo)并參與信號(hào)復(fù)合物磷酸化依賴性組裝，從而在瘧原蟲(chóng)入侵紅細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮作用[11,35-36]；而柔嫩艾美耳球蟲(chóng)14-3-3 蛋白同樣可以與CDPK作用，參與球蟲(chóng)對(duì)宿主的入侵[13]。

除上述與宿主蛋白酶類發(fā)生互作參與入侵細(xì)胞過(guò)程外，寄生蟲(chóng)14-3-3蛋白還可增加感染宿主細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，如弓形蟲(chóng)14-3-3蛋白大量集中于寄生泡中，且能夠誘導(dǎo)寄生性樹(shù)突狀細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度遷移，推測(cè)14-3-3蛋白在蟲(chóng)體向宿主組織的入侵過(guò)程中發(fā)揮作用[37]。

3.3 寄生蟲(chóng)14-3-3蛋白調(diào)控宿主免疫

多種寄生蟲(chóng)的14-3-3 蛋白都可以調(diào)控宿主的免疫功能，其可通過(guò)改變宿主分泌細(xì)胞因子、NO的產(chǎn)生和抗體水平，以及調(diào)控宿主免疫細(xì)胞的增殖、凋亡或遷移來(lái)調(diào)控宿主免疫，但不同種類的寄生蟲(chóng)14-3-3蛋白調(diào)控宿主免疫應(yīng)答存在一定差異。

吸蟲(chóng)大片吸蟲(chóng)（Fasciolagigantica）重組14-3-3ε 蛋白可增強(qiáng)山羊外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）分泌IL-10，并抑制IL-4、IFN-γ 的分泌，還可促進(jìn)細(xì)胞分泌TGF-β，并在高濃度條件下（80μg/mL）促進(jìn)NO 產(chǎn)生，同時(shí)該蛋白還可明顯抑制山羊PBMCs增殖和吞噬能力，且在蛋白濃度為20 μg/mL時(shí)促進(jìn)細(xì)胞遷移，在40和80 μg/mL 時(shí)抑制細(xì)胞遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[38]。

日本血吸蟲(chóng)14-3-3 蛋白除可促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞比例增加外，還顯著促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞的凋亡[39]。

絳蟲(chóng)多房棘球絳蟲(chóng)（E.multilocularis）重組14-3-3蛋白可改變小鼠血清中IFN-γ、IL-4的分泌水平，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Th1/Th2混合型免疫應(yīng)答[21]；細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭蚴重組14-3-3 蛋白可提高小鼠血清中IL-2的水平和抗體IgG、IgE水平[40-41]。

線蟲(chóng)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)（Haemonchuscontortus）重組14-3-3蛋白（rHCftt-2）刺激山羊PBMCs分泌IL-10、IL-17和IFN-γ，抑制IL-4和NO的分泌，同時(shí)還可促進(jìn)PBMCs細(xì)胞的遷移，但細(xì)胞的增殖水平卻以劑量依賴性方式顯著降低[42]，而旋毛蟲(chóng)重組14-3-3蛋白可促進(jìn)小鼠血清中IFN-γ、IL-2、IL-4 和IL-5水平升高，誘導(dǎo)小鼠Th1/Th2混合型免疫應(yīng)答[26]。

原蟲(chóng)巨型艾美耳球蟲(chóng)重組14-3-3 蛋白可促進(jìn)雞血清中IFN-γ、IL-2、IL-4 和TGF-β4 等細(xì)胞因子水平的升高[16]；犬新孢子蟲(chóng)重組14-3-3蛋白以不依賴于TLR2 的方式激活MAPK、AKT 和NF-κB 信號(hào)通路，誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌IL-6、IL-12和TNF-α 等細(xì)胞因子從而調(diào)節(jié)小鼠先天性免疫應(yīng)答[10]，同時(shí)還能夠增加CD8+T淋巴細(xì)胞比例，而在蛋白濃度高于100 μg/mL時(shí)顯著抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的增殖[10,15]。

3.4 寄生蟲(chóng)14-3-3作為多種寄生蟲(chóng)疫苗候選抗原

目前已報(bào)道有寄生蟲(chóng)14-3-3 蛋白的DNA 疫苗、重組亞單位疫苗和活載體疫苗，其中大部分寄生蟲(chóng)14-3-3蛋白的疫苗進(jìn)行了保護(hù)性效果評(píng)價(jià)，但它們的保護(hù)效果存在差異。

吸蟲(chóng)肝片吸蟲(chóng)（F.hepatica）重組14-3-3蛋白疫苗免疫山羊后，血清中IgG特異性抗體水平升高，但免疫后山羊的肝臟損傷程度與未免疫的山羊接近[43]。

絳蟲(chóng)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)14-3-3 亞單位疫苗免疫的小鼠對(duì)原頭蚴攻擊具有85.3%和84.47%的保護(hù)力，可顯著降低其肝臟和腸系膜處的棘球蚴包囊數(shù)目和包囊大小[40-41]，另外，該蛋白與疫苗佐劑MPLA形成的脂質(zhì)體疫苗可進(jìn)一步提高宿主對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)感染的抵抗力，高達(dá)95.07%[44]。

線蟲(chóng)旋毛蟲(chóng)14-3-3 蛋白聯(lián)合佐劑ISA50v2免疫小鼠，肌幼蟲(chóng)減蟲(chóng)率可達(dá)46.2%[26]；捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)重組14-3-3蛋白（rHcftt-2）疫苗免疫的山羊僅產(chǎn)生較弱的保護(hù)力，免疫組山羊排出的每克糞便蟲(chóng)卵數(shù)（EPG）和蠕蟲(chóng)負(fù)荷數(shù)較未免疫組相比分別降低26.46%、32.33%，同時(shí)減少了宿主血紅蛋白的損失[45]；而糞類圓線蟲(chóng)14-3-3重組蛋白亞單位疫苗無(wú)任何保護(hù)力，免疫后小鼠血清中的IL-10、TGF-β、IL-13 和TNF-α 細(xì)胞因子水平雖然升高，但小鼠體內(nèi)的蟲(chóng)體和蟲(chóng)卵數(shù)目甚至還高于未免疫小鼠[7]。

原蟲(chóng)堆型艾美耳球蟲(chóng)（E.acervulina）14-3-3蛋白DNA疫苗免疫的雞對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)、堆型艾美耳球蟲(chóng)和巨型艾美耳球蟲(chóng)的單獨(dú)或混合感染都呈現(xiàn)良好的抗球蟲(chóng)效應(yīng)，混合感染時(shí)抗球蟲(chóng)指數(shù)（ACI）可達(dá)170.92，雞群相對(duì)體重增加86.82%，卵囊減少率為39.33%，且腸道損傷減輕（病變?cè)u(píng)分降低3.11±1.08）[46]，巨型艾美耳球蟲(chóng)14-3-3 蛋白疫苗亦呈現(xiàn)良好的抗球蟲(chóng)效應(yīng)，攻蟲(chóng)后的ACI可達(dá)166.96，卵囊減少率75.91%，也可明顯降低雞的腸道損傷評(píng)分[16]。

弓形蟲(chóng)重組14-3-3蛋白聯(lián)合其他蛋白（MIF和CDPK3）組成的雞尾酒疫苗可有效抵抗致死性弓形蟲(chóng)的感染，其體內(nèi)包囊減少82.7%，且90%的免疫小鼠可存活[47]，而其14-3-3 蛋白DNA 疫苗雖可延長(zhǎng)免疫組小鼠約11天的壽命，但無(wú)法抵抗致死性弓形蟲(chóng)感染[48]。

犬新孢子蟲(chóng)重組14-3-3蛋白免疫小鼠后，小鼠體內(nèi)的蟲(chóng)體負(fù)荷量顯著降低，組織病變也較輕，可顯著延長(zhǎng)攻蟲(chóng)后小鼠的壽命，但其存活率僅40%[15]。

3.5 寄生蟲(chóng)14-3-3 蛋白作為潛在的血清學(xué)診斷靶標(biāo)

除上述功能外，14-3-3蛋白還有望被用作寄生蟲(chóng)疾病的血清學(xué)診斷。日本血吸蟲(chóng)重組14-3-3 蛋白與其天然蛋白均能夠被日本血吸蟲(chóng)感染患者和感染兔的血清識(shí)別[49]，旋毛蟲(chóng)重組14-3-3蛋白同樣可以被早期感染旋毛蟲(chóng)的豬或小鼠的血清所識(shí)別[50]，表明日本血吸蟲(chóng)和旋毛蟲(chóng)重組14-3-3蛋白具有作為血清學(xué)診斷靶標(biāo)的潛力；糞類圓線蟲(chóng)14-3-3蛋白所建立的血清學(xué)診斷方法具有較高的靈敏度（96%），且其特異性與市售試劑盒（Novatech）相似，表明14-3-3 蛋白可作為糞類圓線蟲(chóng)的有效候選診斷抗原[51]。

4 展望

隨著近些年對(duì)寄生蟲(chóng)14-3-3蛋白研究的深入，發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白與寄生蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育和入侵有關(guān)，且能夠調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)，其可作為潛在的寄生蟲(chóng)病血清學(xué)診斷靶標(biāo)和疫苗候選抗原。然而，關(guān)于寄生蟲(chóng)14-3-3 蛋白在信號(hào)通路中的作用報(bào)道較少，14-3-3 蛋白在寄生蟲(chóng)致病過(guò)程中具體的分子作用機(jī)制也尚未闡明，解決類似問(wèn)題將為寄生蟲(chóng)疾病的防治提供新思路。