珊瑚狀猴頭菇多糖的提取及其體外抗氧化活性分析

涂曉媛 褚路路 王冕 陳炳智，2 江玉姬，2

（1. 福建農(nóng)林大學食品科學學院，福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學菌物研究中心，福州 350002）

珊瑚狀猴頭菇（Hericium coralloides），屬于擔子菌亞門（Basidiomycetes），傘菌綱（Agaricomycetes），紅菇目（Russulales），猴頭菌科（Hericiaceae），猴頭菌屬（Hericium），又名松花蘑（長白山區(qū)）、玉髯［1］。子實體的形態(tài)特征為花椰菜狀，新鮮時白色或淡黃色，干時淡褐色至銹褐色［2］。目前珊瑚狀猴頭菇已馴化成功，能夠實現(xiàn)人工栽培，該食用菌含有多糖、猴頭菌素、猴頭菌酮、甾醇等功能成分［3］，具有利五臟、滋補、助消化，主要用于神經(jīng)衰弱、胃潰瘍等疾病，是一種優(yōu)良的藥用真菌［4］。

多糖是猴頭菇主要活性成分之一［5］，對珊瑚狀猴頭菇多糖（H. coralloidespolysaccharide, HCP）的功能研究主要有增強機體的免疫力［6］、降血膽固醇［7］、抗氧化［8］、抗幽門螺桿菌［9］以及保護胃黏膜［10］等方面。近年來對食用菌多糖的研究較多，主要集中在香菇［11］、靈芝［12］、銀耳［13］等，珊瑚狀猴頭菇是近幾年栽培馴化成功的新品種，對珊瑚狀猴頭菇多糖的提取工藝優(yōu)化研究較少，本試驗采用熱水浸提法探求珊瑚狀猴頭菇多糖最佳的提取工藝參數(shù)，并通過紫外吸收光譜、傅里葉變換紅外光譜、X?射線衍射對珊瑚狀猴頭菇粗多糖的結構進行初步鑒定，同時研究珊瑚狀猴頭菇多糖的抗氧化活性。為后期進一步探索珊瑚狀猴頭菇多糖的功能活性提供基礎，也為珊瑚狀猴頭菇的開發(fā)及深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

珊瑚狀猴頭菇由國家食用菌品種改良中心福建分中心提供；葡萄糖、水楊酸（均為分析純）、雙縮脲法蛋白含量檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；苯酚分析純購于西隴科學股份有限公司；1,1?二苯基?2?三硝基苯肼（DPPH）、2,2?聯(lián)氮-二（3?乙基-苯并噻唑?6?磺酸）二銨鹽ABTS、抗壞血酸（VC）、硫酸亞鐵、過硫酸鉀、無水四硼酸鈉、間羥基聯(lián)苯（均為分析純購于上海麥克林有限公司；95%乙醇購于福州鑫偉誠實驗儀器有限公司；過氧化氫購于上海沃凱生物有限公司；正丁醇購于天津市恒興化學試劑制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 珊瑚狀猴頭菇粗多糖（HCP）的提取 新鮮的珊瑚狀猴頭菇烘干后研磨成粉，提取過程參考楊嘉丹等［14］的方法，并稍加修改：

將粉末與蒸餾水按1∶30（g/mL）混合，熱水浴浸提后，浸提液5 000 r/min 離心10 min，取上清液用旋轉蒸儀濃縮，在濃縮液中加入4 倍的95%乙醇，4℃下沉淀多糖；再將獲取的粗多糖溶液使用Sevage 法（V氯仿∶V正丁醇=4∶1）去除蛋白質后放入透析袋（截留分子12 000-14 000 Da）中透析24 h；最后把透析袋中多糖溶液5 000 r/min 離心10 min，取上清液并冷凍干燥得HCP。

1.2.2 珊瑚狀猴頭菇多糖含量測定 采用苯酚-硫酸法［15］測定多糖含量，以葡萄糖為標準品，繪制標準曲線。配制質量濃度為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL 的葡萄糖溶液，分別取2 mL 于各試管中，加入1 mL 5%苯酚溶液和5 mL 濃硫酸溶液，避光放置15 min；以蒸餾水取代葡萄糖溶液作為空白對照，在490 nm 處測定其吸光度。繪制標準曲線得回歸方程y=?0.010 1+10.212 9x，R2=0.999 4。按照上述方法測定HCP 含量并根據(jù)標準曲線按公式（1）計算HCP 提取率：

公式中：P：多糖提取率（%）；C：多糖質量濃度（mg/mL）；N：稀釋倍數(shù)；m：樣品質量（g）。

1.2.3 單因素試驗 按照1.2.1 方法提取珊瑚狀猴頭菇多糖，提取條件為：固定料液比1∶30（g/mL）、提取時間2.0 h、顆粒大小40 目，考察提取溫度60、70、80、90、100℃對HCP 的影響；固定提取時間2.0 h、提取溫度90℃、顆粒大小40 目，考察料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）對HCP 的影響；固定料液比1∶30（g/mL）、提取溫度90℃、顆粒大小40 目，考察提取時間1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h 對HCP 的影響；固定料液比1∶30（g/mL）、提取溫度90℃、提取時間2.0 h，考察顆粒大小20、40、60、80、100 目對HCP 的影響。

1.2.4 響應面試驗 在單因素試驗結果的基礎上對最優(yōu)的提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C）、顆粒大?。―）4 個因素，利用Design?Expert 8.0.6進行四因素三水平的響應面分析試驗，優(yōu)化HCP 的熱水浸提工藝參數(shù)，試驗設計的方案見表1。對各因素水平下HCP 的提取率進行測定，并以計算所得的HCP 的提取率為響應值進行方差分析。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.5 化學成分測定 采用苯酚硫酸法測定總糖含量；雙縮脲法測定蛋白質含量；以半乳糖醛酸為標準品，采用間羥基聯(lián)苯法測定糖醛酸含量［16］。

1.2.6 紫外光譜分析（UV?Vis） 參考馮鑫等［17］的方法修改，將HCP 配制成質量濃度為0.1 mg/mL 的溶液，以水作為空白對照，在190-400 nm 波長范圍內(nèi)進行掃描。

1.2.7 傅里葉變換紅外光譜分析（FI?IR） 使用FI?IR 測定多糖的官能團，將HCP 粉末與KBr 粉末混合并壓縮成1 mm 顆粒，采集4 000-500 cm-1范圍內(nèi)的多糖光譜［18］。

1.2.8 X?射線衍射（XRD）分析 參照文獻［19］方法修改，采用X 射線衍射儀，掃描范圍10°-90°，掃描速率步長為10°/min,采樣間隔0.02°對HCP 進行掃描。

1.2.9 體外抗氧化試驗 根據(jù)Chen 等［20］的方法稍加修改，測定HCP 清除DPPH 自由基能力。配制0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL 不同濃度的HCP 溶液。取1 mL 樣品溶液加入1 mL 0.1 mmol/L DPPH 溶液充分混合，常溫避光反應30 min，在517 nm 處測定吸光度?？瞻捉M以95%乙醇溶液取代HCP 溶液；VC為陽性對照，操作方法與樣品組相同，每組重復3 次，取其平均值，按公式計算DPPH 自由基清除率。

式中：A1：樣品溶液或者VC溶液的吸光度值；A2：95%乙醇溶液取代DPPH 溶液加入HCP 溶液或者VC溶液所測的吸光度值；A0：空白溶液的吸光度值。

參考文獻［20］的方法稍加修改測定HCP 對ABTS+自由基的清除能力，取7 mmol/L ABTS 溶液5 mL 和15 mmol/L 過硫酸鉀1 mL 于23℃恒溫箱中孵化12-16 h，使用時用蒸餾水稀釋其溶液，在734 nm 處的吸光度為0.7±0.02。取0.75 mL HCP 溶液于試管中，再加入3 mL ABTS 溶液室溫反應15 min，在734 nm 處測量不同濃度樣品的吸光度?？瞻捉M以蒸餾水取代HCP 溶液；VC為陽性對照，操作方法與樣品組相同，每組重復3 次，取其平均值，按公式計算ABTS+自由基清除率。

式中：A1：樣品溶液或者VC溶液的吸光度值；A2：蒸餾水取代ABTS 溶液加入HCP 溶液或者VC溶液所測的吸光度值；A0：空白溶液的吸光度值。

參考文獻［21］的方法稍加修改，取1 mL HCP 溶液，分別加入5 mmol/L 的FeSO4、水楊酸、H2O2溶液各1 mL 混合，放入37℃恒溫箱中避光反應30 min，測定其在510 nm 處測得吸光度?？瞻捉M以蒸餾水取代HCP 溶液；VC為陽性對照，操作方法與樣品組相同，每組重復3 次，取其平均值，按公式計算羥自由基清除率。

式中：A1：樣品溶液或者VC溶液的吸光度值；A2：蒸餾水取代H2O2溶液加入HCP 溶液或者VC溶液所測的吸光度值；A0：空白溶液的吸光度值。

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用SPSS Statistics 23.0進行數(shù)據(jù)處理，Origin 2021 軟件繪圖。

2 結果

2.1 珊瑚狀猴頭菇多糖提取的單因素試驗

如圖1?A 所示，隨著提取溫度的升高HCP 提取率呈上升的趨勢，當提取溫度在80-90℃時，多糖提取率增長較快，當高于90℃，上升趨于平緩。綜合考慮節(jié)約能源問題，提取溫度選擇90℃較為適宜。多糖提取率隨著料液比的增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢（圖1?B），考慮加大溶液體積會使后期濃縮和沉淀工藝難度加大［22］，因此選擇1∶30（g/mL）的液料比。如圖1?C 所示，當提取時間達到2.0 h 時，多糖提取率達到最高，提取時間超過2.0 h，多糖提取率下降，因此，選擇提取時間2.0 h 較為適宜。隨著顆粒大小的增加，多糖的提取率逐漸升高，當顆粒大小大于80 目后，多糖提取率開始下降（圖1?D）。因此，試驗選擇顆粒大小為80 目較適宜。

圖1 不同提取條件對多糖提取率的影響Fig. 1 Effects of different extraction conditions on the extraction rates of polysaccharides

2.2 響應面法優(yōu)化提取工藝

2.2.1 響應面試驗結果及方差分析 根據(jù)單因素試驗結果，以提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C）、顆粒大?。―）4 個因素為自變量，以珊瑚狀猴頭菇多糖提取率為響應值，利用Box?Behnken 試驗方案，進行四因素三水平的響應面分析試驗。試驗設計及結果見表2。回歸分析見表3。

表2 Box-Behnken 試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 回歸模型的方差分析表Table 3 Variance analysis table of regression model

利用Design Expert 8.0.6 軟件對數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合，得到珊瑚狀猴頭菇多糖的提取率對提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C）、顆粒大?。―）之間的二次多項回歸方程為：Y=10.83+0.46A+0.30B+1.27C+0.1D-0.21AB-0.26AC+0.14AD-0.38BC-0.075BD-0.37CD-0.52 A2-0.43B2-1.63C2-0.7D2。

由表3 可知，P模型<0.000 1, 表明模型顯著，失擬項P=0.395 9 表示失擬項不顯著，決定系數(shù)R2=0.989 9 接近R2adj=0.979 8，證明該模型是可靠的；對模型進行回歸方程系數(shù)顯著性檢驗，得到模型的一次項A、B、C 是極顯著的，說明提取溫度、提取時間、料液比對多糖的提取率有顯著影響。F值表示因素對多糖提取率的影響程度，從方差分析表中F值大小可以判斷各因素對試驗結果影響的程度，F(xiàn)值越大，因素對多糖提取率的影響越大。因此可得到各因素對多糖提取率從大到小的影響順序次序是：C（料液比）> A（提取溫度）> B（提取時間）> D（顆粒大小）。

2.2.2 響應面各因素交互作用分析 由圖2 可知，AB、AC、BC、CD 響應面都是向下開放的，并且曲面陡峭。AC、BC、CD 等高線圖沿著料液比向等高線相對密集，響應面圖以及等高線圖表明料液比對多糖提取率的影響比提取溫度、提取時間及顆粒大小大。等高線呈現(xiàn)橢圓形，表明AC、BC、CD 有明顯的交互作用；AB 等高線圖沿著提取溫度向等高線相對密集，表明與提取時間相比較，提取溫度對HCP 的影響更大。AD、BD 兩個響應面圖曲面向下開發(fā)，但等高線圖中的等高線較為稀疏并且其中心沒有呈現(xiàn)橢圓形，顏色變化緩慢，表明兩者交互作用不顯著。各因素交互作用對HCP 提取率影響的響應面圖和等高線圖分析結果與方差分析一致。

圖2 各因素交互作用對珊瑚狀猴頭菇多糖提取率影響的響應面圖和等高線圖Fig. 2 Response surface diagram and contour map of the effects of interactions of various factors on the extraction rates of HCP

2.2.3 優(yōu)化提取工藝參數(shù)的驗證 通過Design?Expert 8.0.6 軟件分析，獲得珊瑚狀猴頭菇多糖的最佳水提條件：提取溫度93.34℃、提取時間2.06h、料液比1∶33.5（g/mL）、顆粒大小80.15 目，在此條件下，HCP 的提取率最高，粗多糖預測值為11.14%?？紤]實際操作，在提取溫度93℃、提取時間2.0 h、料液比1∶33（g/mL）、顆粒大小80 目的條件下做驗證試驗。經(jīng)3 次重復試驗，得到實際粗多糖的提取率為11.02%，相對誤差小于1%，表明此模型可以更好地反映HCP 的提取率與影響因素之間的關系，由此可以確定HCP 最佳提取工藝條件。

2.3 HCP的化學成分分析

粗多糖經(jīng)成分分析（表4）顯示，總糖含量為65.21%±0.90%，糖醛酸含量13.52%±1.95%，含有極少量的蛋白質。

表4 HCP 的化學成分Table 4 Chemical composition of HCP%

2.4 HCP紫外光譜分析結果

如圖3 所示，HCP 在198 nm 處有多糖特征吸收峰，260 nm 和280 nm 附近有細微雜峰，表明HCP含有少量核酸和蛋白質。

圖3 HCP 的紫外吸收光譜圖Fig. 3 UV absorption spectrum of HCP

2.5 HCP紅外光譜分析結果

如圖4 所示，在3 417 cm-1附近的吸收峰為O?H伸縮振動；在2 931 cm-1附近的吸收峰是C?H 伸縮振動產(chǎn)生這兩個是多糖類化合物的特征吸收峰［23］。在1 651 cm-1附近的吸收峰顯示為糖醛酸中的C=O拉伸振動，說明該物質中可能含有糖醛酸；在1 411 cm-1附近顯示為C?H 變形振動吸收峰；在1 080 cm-1附近的特征吸收峰表明HCP 可能存在吡喃糖環(huán)，在1 249 cm-1附近的特征吸收峰表示HCP 含有C?O 糖苷鍵。綜上所述，是典型的多糖類物質并且具有吡喃糖環(huán)結構。

圖4 HCP 的傅里葉變換紅外吸收光譜圖Fig. 4 Fourier transform infrared absorption spectrogram of HCP

2.6 XRD分析

由圖5 可知，HCP 在θ=20°處附近有一個強烈凸起的寬衍射峰，表明HCP 結晶度較低，同時存在無定形和結晶部分。

圖5 HCP 的XRD 譜圖Fig. 5 XRD spectra of HCP

2.7 珊瑚狀猴頭菇粗多糖的體外抗氧化活性

2.7.1 DPPH 自由基清除能力 如圖6 所示，在0-2.5 mg/mL 范圍內(nèi)，HCP 質量濃度的增加，對DPPH 自由基的清除能力從40.03%±4.23%增加到87.02%±2.24%呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢。從質量濃度的角度考慮，HCP 清除DPPH 自由基的能力要弱于陽性對照組VC。HCP 對DPPH 自由基的EC50值為0.663 mg/mL。

圖6 HCP 對DPPH 自由基清除率Fig. 6 Scavenging rate of DPPH free radical to HCP

2.7.2 ABTS+自由基清除能力 如圖7 所示，HCP對ABTS+自由基的清除能力存在劑量關系，HCP對ABTS+自由基的清除能力隨著多糖質量濃度的增大而增加；當質量濃度為2.5 mg/mL 時，HCP 表現(xiàn)出最強清除活性，對ABTS+自由基的清除率達到98.27%±0.73%接近陽性對照VC。HCP 對ABTS+自由基的EC50值為0.767 mg/mL。

圖7 HCP 對ABTS+自由基清除率Fig. 7 Scavenging rate of HCP to ABTS+ free radical

2.7.3 羥自由基清除能力 如圖8 所示，HCP 對羥自由基的清除能力具有依賴關系，在0-2.5 mg/mL 范圍內(nèi)，其清除率從23.99%±1.51%增加到87.65%±0.75%。與陽性對照VC相比，HCP 對·OH 自由基的清除活性相對較弱，其EC50值為0.952 mg/mL。

圖8 HCP 對羥自由基清除率Fig. 8 Scavenging rate of HCP free radical to OH

3 討論

真菌多糖常用的提取方法有熱水提取法、超聲提取法、酶提取法等，但大多數(shù)真菌多糖在熱水中溶出率較高，而且對多糖活性影響較小［24］。因此本試驗采用水提醇沉法提取珊瑚狀猴頭菇多糖。熱水法提取多糖的提取率與溫度、時間、料液比、顆粒大小等條件有著密切的關系。因此，本研究在單因素試驗的基礎上，對這些因素進行了響應面優(yōu)化試驗，根據(jù)二次模型的響應面圖以及等高線圖評價了試驗因素對HCP 提取率的兩兩交互作用，結果表明各因素對HCP 提取率的影響強弱順序為：料液比>提取溫度> 提取時間> 顆粒大小，與胡麗玲等［25］研究一致。料液比對HCP 提取率的影響最大，胡瑞財?shù)龋?6］研究表明靈芝多糖最佳料液比為1∶30（g/mL），與本研究測定結果一致；可能是因為料液比過小會限制HCP 的溶出［27］，但隨著溶液體積的增大，其他水溶性雜質會析出，降低水提液中的固形物含量，加大后期除蛋白工藝的難度［22］。其次是提取溫度，提取溫度會直接影響多糖在水中的溶解度，多糖提取率隨著溫度的升高而升高，白鳳岐等［28］對靈芝多糖的研究表明在90-100℃提取率最高，與本研究相似，但由于沸水提取對工業(yè)設備要求高［29］，因此選擇90℃為最適溫度。提取時間過長，多糖的結構可能遭到破壞，從而導致多糖提取率降低［22］；顆粒過粗，多糖溶出不充分，顆粒研磨過細，顆粒容易成團，傳質阻力增加促使傳質速率降低，不利于多糖分子的溶出［30-31］。研究表明HCP在此優(yōu)化提取參數(shù)條件下，提取率為11.02%，與游賢珍［32］提取滑菇多糖研究結果相比，HCP 提取率較高，說明本試驗水提多糖最佳提取工藝參數(shù)可靠。

UV?Vis 在190-200 nm、260 nm 和280 nm 附近分別為多糖、核酸和蛋白質的特征吸收峰；HCP在198 nm 處有最大吸收峰，符合多糖的特征曲線；280 nm 存在極其微小的弱峰，表明HCP 含有少量的蛋白質，進一步采用雙縮脲法測定HCP 中蛋白質含量，其含量為5.28%±0.50%，證明HCP 確實含有少量蛋白質。XRD 可以對樣品進行物相定性，可精準測定樣品的晶體結構、結晶度等性質［33］；且多糖的結晶結構特征直接決定其抗張強度、柔韌性、溶解性、膨脹性和其他物理性質［34］；本研究表明HCP 為半結晶聚合物，與Peng 等［35］研究竹筍殼多糖結果相似。FI?IR 可以分析化合物的存在，多糖在4 000-400 cm-1范圍內(nèi)有特征吸收峰，HCP 在此范圍內(nèi)有多糖的特征吸收峰并且含有糖醛酸和吡喃糖環(huán)結構。

自由基會破壞體內(nèi)蛋白質和酶，引起機體炎癥和衰老，清除自由基可以保護機體免受氧化損傷［36］。猴頭菇多糖具有良好的抗氧化作用，黃越等［37］研究發(fā)現(xiàn)，猴頭菇粗多糖質量濃度為5 mg/mL 時，對DPPH 和·OH 自由基的清除能力為72%和75%；對ABTS＋自由基的清除效果為85%（0.5 mg/mL）。本研究結果顯示，當HCP 質量濃度為2.5 mg/mL時，對DPPH、ABTS+、·OH 自由基清除能力分別為87.02%±2.24%、98.27%±0.73%、87.65%±0.75%。兩者相比，珊瑚狀猴頭菇粗多糖對DPPH、·OH 自由基的清除作用強于猴頭菇粗多糖，對ABTS+自由基的清除能力弱于猴頭菇粗多糖，可能因為品種不同，不同提取方法所提取的多糖，其糖醛酸、分子量等結構不同，導致抗氧化效果有所差異。大量研究證明多糖的抗氧化活性可能與其結構有關，Liu等［38］從金針菇菌渣中提取的中性多糖和酸性多糖，研究這兩種多糖對ABTS+自由基的清除效果，結果表明酸性多糖的抗氧化作用優(yōu)于中性多糖，認為可能是因為酸性多糖含有更多的糖醛酸和硫酸鹽；Leng 等［39］研究釀酒葡萄多糖的抗氧化活性發(fā)現(xiàn)Moldova（MD）品種的葡萄多糖分子量較低，糖醛酸含量較高，具有較強的抗氧化活性。綜上所述，HCP 具有良好的體外抗氧化活性，可進一步在動物體內(nèi)探究其抗氧化活性和其他功能。

4 結論

本研究通過響應面法得到HCP 最佳水提工藝條件：提取溫度93℃、提取時間2.0 h、料液比1∶33（g/mL）、顆粒大小80 目。HCP 體外抗氧化試驗表明，在一定濃度范圍內(nèi)，對DPPH、ABTS+、·OH 自由基具有良好的清除效果。