一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌的篩選及氮轉(zhuǎn)化特性研究

蔣慧慧 王強(qiáng) 付維來，3 饒志明 張顯

（1. 巢湖學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，合肥 238024；2. 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122；3. 福建大北農(nóng)華有水產(chǎn)科技有限公司功能飼料與養(yǎng)殖環(huán)境控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，漳州 363500）

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過度使用氮肥、生活和工業(yè)廢水中氮的釋放均可產(chǎn)生含氮廢水，水體中高水平的氮化合物可導(dǎo)致富營養(yǎng)化和水質(zhì)惡化，進(jìn)而對(duì)生態(tài)平衡和人民群眾的飲水安全帶來威脅［1］，綠色、安全、經(jīng)濟(jì)的廢水脫氮技術(shù)亟待開發(fā)。生物脫氮法通過微生物自身代謝活動(dòng)使有機(jī)氮向無機(jī)氮轉(zhuǎn)化，最終形成氮?dú)忉尫?，相較于物理、化學(xué)脫氮具有成本低廉、安全高效和無二次污染等優(yōu)點(diǎn)［2］。傳統(tǒng)的生物脫氮分為硝化反應(yīng)和反硝化反應(yīng)兩個(gè)過程，第一步由好氧自養(yǎng)型微生物完成硝化反應(yīng)，將氨氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮；第二步是反硝化菌在缺氧條件下將亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮還原成氮?dú)獾姆聪趸^程［3-4］。然而，新型異養(yǎng)硝化-好氧反硝化（heterotrophic nitrification and aerobic denitrification，HNAD）細(xì)菌可以在一個(gè)反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)銨和亞硝酸鹽/硝酸鹽的同步去除（圖1）［5］，單菌脫氮進(jìn)一步提高廢水生物處理效率，降低運(yùn)行成本和復(fù)雜性。為滿足高鹽［6］、低溫［7-8］、高溫［9］等不同環(huán)境條件下脫氮的應(yīng)用需求，研究人員從不同生長環(huán)境中篩選出多種HNAD 菌，包括芽孢桿菌屬（Bacillussp.）［10-11］、腸球菌屬（Enteroco?ccussp.）［12］、假單胞菌屬（Pseudomonassp.）［5,13-14］、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobactersp.）［15］、葡萄球菌屬（Staphylococcussp.）［16］等，其中Pseudomonassp.和Bacillussp.報(bào)道較多。

圖1 異養(yǎng)-好氧反硝化微生物氮代謝途徑Fig. 1 Nitrogen metabolism pathways of HNAD microorganisms

根據(jù) HNAD 細(xì)菌的特點(diǎn)，本研究從水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘底泥中取樣，分離篩選出一株轉(zhuǎn)化銨態(tài)氮的微生物菌株，經(jīng)16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定為阿氏芽孢桿菌（Bacillusaryabhattai），通過逐步提高銨態(tài)氮的添加濃度馴化篩選菌株，提高其銨態(tài)氮的耐受能力和氨氮去除能力。進(jìn)一步探索菌株氨氮降解的最佳條件，并對(duì)菌株的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化特性研究，為其在水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水處理中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源 福建某水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘池底的新鮮污泥。

1.1.2 培養(yǎng)基 DM 基本培養(yǎng)基（/L）：C6H5Na3O75.64g，KH2PO41.5 g，Na2HPO40.42 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，NaNO21.5 g，pH 7.0。DM 固體培養(yǎng)基，即在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2%的瓊脂粉。

改良的硝化培養(yǎng)基（/L）：C4H4Na2O48.67g、KH2PO41 g、Na2HPO40.42 g、NaCl 2 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、NH4Cl 0.764 g、微量元素溶液2 mL，pH 7.2。

改良的反硝化培養(yǎng)基（/L）：C4H4Na2O48.67g、KH2PO41 g、Na2HPO40.42 g、NaCl 2 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、NaNO31.21 g（或NaNO20.99 g）、微量元素溶液2 mL，pH 7.2。

LB 培養(yǎng)基（/L）：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g。固體培養(yǎng)基，即在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2%的瓊脂粉。

微量元素溶液（/L）：MnCl2·4H2O 1.5 g、ZnSO41.05 g、H3BO30.3 g、（NH4）6Mo7O24·4H2O 1.1 g、CuCl2·2H2O 0.15 g、EDTA?2Na·2H2O 5.71 g、FeSO4·7H2O 4.87 g、CaCl2·2H2O 7 g。

上述培養(yǎng)基在使用前需121℃高溫滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離與篩選 將來自水產(chǎn)養(yǎng)殖池底的新鮮污泥取5.0 g 加入到含有100 mL 無菌水的500mL 錐形瓶中，加入玻璃珠，于30℃、180 r/min 振蕩分散。取3 mL 的菌懸液轉(zhuǎn)移到含有100 mL DM培養(yǎng)基的燒瓶中，在30℃和180 r/min 下孵育，以富集表現(xiàn)良好的氨降解菌株。需氧孵育36 h 后，取3 mL 菌懸液在同等條件下進(jìn)行二次富集。接種環(huán)蘸取二次富集懸液并在DM 固體培養(yǎng)基上劃線，多次轉(zhuǎn)接劃線后獲得單個(gè)菌落。取單菌落轉(zhuǎn)接于DM 液體培養(yǎng)基，然后按接種量6%接種于NH4+?N 濃度為200 mg/L 的硝化培養(yǎng)基，30℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)。每12 h 取樣一次，測(cè)定OD600nm下的菌液密度，其余樣品以5 000 r/min 離心5 min，提取上清液，測(cè)定上清液的NH4+?N 濃度，并計(jì)算氨氮去除率。綜合分析菌株的生長曲線和脫氮性能，篩選出優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行形態(tài)觀察、生物鑒定和氮轉(zhuǎn)化特性研究。

1.2.2 菌株的鑒定 以通用引物27F（5'?AGAGTT TGATCMTGGCTCAG?3'）和1492R（5'?CGGTTACCT TGTTACGACTT? 3'）擴(kuò)增菌株的16S rRNA 基因。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序，將測(cè)序獲得的基因序列與GenBank 中已有序列進(jìn)行比對(duì)，并用MEGA11 建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株的馴化 用接種環(huán)挑取單菌落，接種到含有10 mL 液體LB 的50 mL 錐形瓶中，以30℃和180 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h。然后，取3 mL 菌液置于無菌EP 管中，8 000 r/min 離心5 min，用無菌生理鹽水洗滌2 次，將洗滌后的菌液按6%接種量接種于 NH4+?N 濃度為200 mg/L 的硝化培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h，開始適應(yīng)性馴化。每個(gè)濃度循環(huán)轉(zhuǎn)移數(shù)次，直到菌株適應(yīng)此濃度環(huán)境，然后將菌液轉(zhuǎn)移到下一個(gè)梯度硝化培養(yǎng)基（NH4+?N 濃度為400 mg/L、600 mg/L）中，接種量依然為6%，直到菌株不再顯著降解氨氮。定期采樣并檢測(cè)OD600nm和NH4+?N 濃度。馴化獲得突變株用于后續(xù)脫氮性能試驗(yàn)。

1.2.4 影響菌株脫氮性能的單因素實(shí)驗(yàn) 分別研究氨氮濃度、碳源、碳氮比、初始pH 和培養(yǎng)溫度對(duì)菌株氨氮降解的影響。以丁二酸鈉為碳源、氯化銨為氮源，配置氯化銨濃度分別為200、400、600、800 mg/L 的改良的硝化培養(yǎng)基。在50 mL 培養(yǎng)基中分別接種6%的活化菌株。30℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h 以上。每隔12 h 取一次樣，分光光度計(jì)測(cè)定菌液密度（OD600nm），離心取上清后測(cè)定NH4+?N 濃度，并計(jì)算氨氮降解率。分別選擇碳源：丁二酸鈉、檸檬酸三鈉、丙三醇、甲醇；碳氮比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1；初始pH 為6.0、7.0、7.5 和8.5；溫度為20℃、25℃、30℃ 和35℃，以氯化銨為氮源，接種量及培養(yǎng)條件同上，每12 h 取樣后測(cè)定菌液密度及上清液的NH4+?N 濃度。

1.2.5 菌株的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化特性研究 按6%接種量分別在50 mL NH4+?N 濃度為200 mg/L 的硝化培養(yǎng)基和NO3??N 濃度為200 mg/L 的反硝化培養(yǎng)基中接種。30℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h 以上。12 h 取樣一次，OD600nm測(cè)定菌液密度，離心取上清后測(cè)定上清液中的NH4+?N、NO2??N、NO3??N 和TN 濃度，并計(jì)算相應(yīng)氮去除率。

1.2.6 氮元素濃度測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)中NH4+?N、NO3-?N、NO2-?N 和TN 濃度是通過水質(zhì)測(cè)定儀（煙臺(tái)海洋啟恒環(huán)保技術(shù)有限公司HX?C 型）進(jìn)行檢測(cè)的。以NH4+?N 濃度測(cè)定為例，打開主機(jī)電源將測(cè)定指標(biāo)設(shè)定為氨氮，選擇量程為5-50 mg/L 的1 號(hào)曲線；取5 mL 蒸餾水做空白樣，待測(cè)試管中加入0.5 mL 待測(cè)樣品和4.5 mL 蒸餾水。向空白試管和各待測(cè)試管中加入兩滴氨氮1 試劑，再加入兩滴氨氮2 試劑；混勻后靜置10 min，比色并記錄測(cè)定結(jié)果。NO3-?N 和NO2-?N 濃度測(cè)定時(shí)，只需將測(cè)定指標(biāo)設(shè)定為硝酸鹽氮或亞硝酸鹽氮，選擇合適量程，分別添加硝酸鹽氮試劑或亞硝氮試劑，其余操作參考同上。

TN 濃度測(cè)定，先打開消解儀電源，設(shè)置總氮指標(biāo)消解（125℃，30 min），啟動(dòng)升溫；打開測(cè)定儀電源，將測(cè)定指標(biāo)設(shè)定為總氮，選擇量程為20-100 mg/L的1 號(hào)曲線；取2 mL 蒸餾水做空白樣，向待測(cè)試管中加入0.4 mL 樣品（可稀釋），再加入1.6 mL 蒸餾水；向空白試管和各待測(cè)試管依次加入1 mL TN1 試劑，混勻后插入恒溫的消解儀加熱孔內(nèi)進(jìn)行消解；消解完成后，冷卻至室溫。再依次向各管加入0.5 mL TN2 試劑，混勻即為消解液；分別移取1 mL 消解液加入到4 mL TN3 試劑中，混勻后靜置，15 min后比色測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的篩選

從養(yǎng)殖池底污泥中篩選出5 株具有亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化功能的菌株，分別命名為JN01-05。將其轉(zhuǎn)接至改良的硝化培養(yǎng)基中，獲得的生長曲線如圖2?A 所示。JN01 的生長速率遠(yuǎn)高于其他菌株，其次是JN04和JN05。各菌株在以NH4+?N 為氮源的培養(yǎng)基中的氨降解率如圖2?B，在200 mg/L 氨氮濃度和搖瓶發(fā)酵72 h 時(shí)，JN01 的氨氮去除率達(dá)到75.79%，高于JN04 的62.48%，而其他3 株菌的降解效率均低于30%。綜合考慮菌株的生長速率和脫氮性能，發(fā)現(xiàn)菌株JN01 具有較高的氨氮降解能力，菌種保藏后用于后續(xù)菌種鑒定和脫氮性能試驗(yàn)。

圖2 不同菌株的生長曲線（A）和NH4+-N 的去除效率（B）Fig. 2 Growth curves（A）and NH4+-N removal efficiencies（B）of different strains

2.2 菌落形態(tài)和系統(tǒng)發(fā)育樹

菌株JN01 可形成單一菌落，白色，表面粗糙，邊緣不規(guī)則；電子顯微鏡下觀察其形態(tài)呈長桿狀。PCR 獲得菌株JN01 的部分16S rRNA，測(cè)序后獲得序列，基于GenBank 數(shù)據(jù)庫，通過在NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行同源序列比較，建立了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。菌株JN01 與芽孢桿菌屬的關(guān)系最密切，因此菌株被鑒定為阿氏芽孢桿菌（Bacillusaryabhattai）JN01。

圖3 菌株JN01 的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of the strain JN01

2.3 菌株的馴化

采用氨氮遞增法對(duì)菌株JN01 的耐銨態(tài)性進(jìn)行了馴化。馴化前，菌株JN01 在培養(yǎng)基內(nèi)的NH4+?N 濃度為200 mg/L 的條件下，24 h 內(nèi)的生長速度最快，培養(yǎng)60 h 時(shí)OD600nm達(dá)到最大值1.701，如圖4?A。當(dāng)NH4+?N 濃度為600 mg/L 時(shí)，菌株生長受到明顯抑制，最大菌體密度僅0.768。馴化前的最高氨氮去除率為菌株在NH4+?N 濃度為200 mg/L 時(shí)達(dá)到70.18%，最低為NH4+?N 濃度為600 mg/L 時(shí)僅有35.74%，如圖4?B。馴化后，菌株的生長、氨氮去除率均有不同程度提高，在NH4+?N 濃度為200 mg/L 的條件下，菌體OD600nm最高為2.645，同時(shí)氮去除率最高87.29%；NH4+?N 濃度為600 mg/L 時(shí)，OD600nm為1.261，氨氮去除率增加為44.72%。通過馴化，菌株JN01 對(duì)銨態(tài)氮的耐受能力進(jìn)一步提升，可用于高濃度NH4+?N 水樣的脫氮處理。

圖4 菌株JN01 馴化前后的 OD600 nm（A）和 NH4+-N 去除效率（B）的變化Fig. 4 Variation of OD600 nm（A）and NH4+-N removal efficiency（B）before and after the domestication of B. aryabhattai JN01

2.4 影響菌株脫氮特性的單因素研究

2.4.1 不同氨氮濃度對(duì)NH4+?N 去除率的影響 為研究不同氨氮濃度對(duì)菌株 JN01 生長速率和降解銨態(tài)氮的影響，選擇NH4+?N 濃度為200、400、600、800 mg/L 進(jìn)行氨降解實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖5 所示，NH4+?N 濃度越高，菌株JN01 的生長速率受到抑制，氨氮降解率也隨之降低。NH4+?N 濃度為200 mg/L 時(shí)，菌株JN01 的OD600nm在36 h 時(shí)達(dá)到2.267 后進(jìn)入生長穩(wěn)定期，表明低濃度下銨態(tài)氮能較好的被菌株吸收利用，滿足菌體的生長，并獲得84.72%的銨態(tài)氮去除效率。

圖5 不同氮源濃度對(duì)菌株JN01 的OD600 nm（A）和NH4+-N 去除率（B）的影響Fig. 5 Effects of N concentration on the growth characteristics OD600 nm（A）and NH4+-N removal efficiencies（B）of B. aryabhattai JN01

2.4.2 不同碳源對(duì)NH4+?N 去除率的影響 為探究菌株JN01 的最佳碳源，在NH4+?N 濃度為200 mg/L 時(shí)，選擇丁二酸鈉、檸檬酸三鈉、丙三醇和甲醇作為實(shí)驗(yàn)碳源。如圖6 所示，菌株JN01 在使用丙三醇、丁二酸鈉和檸檬酸三鈉時(shí)生長效果更好，當(dāng)碳源為甲醇時(shí)，菌株的生長速率明顯降低，可見不同碳源對(duì)菌株JN01 的生長影響存在較大差異。其中，丙三醇為碳源時(shí)，菌株JN01 的OD600nm最高達(dá)3.172，而以甲醇為碳源時(shí)培養(yǎng)60 h OD600nm僅0.709。對(duì)各碳源條件下，菌株JN01 對(duì)銨態(tài)氮的降解效果進(jìn)行比較，可以明顯看到菌株JN01 在含丁二酸鈉的硝化培養(yǎng)基中NH4+?N 的去除率最高，為87.13%，其次是檸檬酸三鈉為碳源時(shí)，獲得83.54%的銨態(tài)氮去除率。其他兩種碳源條件下，NH4+?N 去除率均不高于40%。綜合考慮菌株的生長情況和NH4+?N 去除率，選擇丁二酸鈉為最佳碳源用于后續(xù)脫氮實(shí)驗(yàn)。

圖6 不同碳源對(duì)菌株JN01 的OD600 nm（A）和NH4+-N 去除率（B）的影響Fig. 6 Effects of different carbon sources on the growth characteristics OD600 nm（A）and NH4+-N removal efficiencies（B）of B. aryabhattai JN01

2.4.3 不同碳氮比對(duì)NH4+?N 去除率的影響 為探明菌株JN01 氨氮代謝的最佳初始碳源濃度，選擇氮源濃度為200 mg/L，最佳碳源為丁二酸鈉，分別控制C/N 比為5∶1、10∶1、15∶1 和20∶1，記錄培養(yǎng)72 h 的OD600nm和NH4+?N 濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7 所示，當(dāng)C/N 為5∶1 時(shí)，OD600nm最高為1.758，NH4+?N 濃度為79.44 mg/L，NH4+?N 去除率為60.28%；當(dāng)C/N為10∶1 和15∶1 時(shí)，由于碳濃度增加，菌株的生長更加旺盛，NH4+?N 的降解率也隨之提高，C/N為15∶1 時(shí)，NH4+?N 濃度降至18.52 mg/L，降解率為90.74%，此時(shí)菌株OD600nm為2.776。C/N 增加到20∶1 時(shí)，菌株JN01 對(duì)NH4+?N 降解效率沒有明顯提高，OD600nm也與C/N 為15∶1 時(shí)相差不大。在成本控制的原則下，選擇C/N 為15∶1 繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)單因素實(shí)驗(yàn)。

圖7 C/N 對(duì)菌株JN01 的OD600 nm（A）和NH4+-N 去除率（B）的影響Fig. 7 Effects of C/N on the growth performance OD600 nm（A）and NH4+-N removal efficiencies（B）of B.aryabhattai JN01

2.4.4 初始pH 對(duì)NH4+?N 去除率的影響 為研究pH對(duì)菌株 JN01 生長和氨氮去除效率的影響，設(shè)置初始pH 為6.0、7.0、7.5 和8.5。結(jié)果（圖8）顯示，菌株 JN01 在初始 pH 值為 7.0 和 7.5 的硝化培養(yǎng)基中生長良好，NH4+?N 的去除率都在90%以上，其中，pH 為7.5 時(shí)，菌株生長最好，60 h 的OD600nm達(dá)到2.792，同時(shí)NH4+?N 去除率是92.37%。pH 為6.0 時(shí)，菌株JN01 的生長明顯受到抑制，對(duì)數(shù)生長期較短，且最高OD600nm僅1.584，NH4+?N 去除率約60%。

2.4.5 培養(yǎng)溫度對(duì)NH4+?N 去除率的影響 菌株JN01 的細(xì)胞生長和銨態(tài)氮的去除受溫度影響程度如圖9，結(jié)果表明，在20-35℃范圍內(nèi)，較高的溫度有利于提高HNAD 的性能。經(jīng)過72 h 的培養(yǎng)，在30℃條件下，NH4+?N 去除率達(dá)到92.78%，但在20℃和25℃條件下，去除率分別只有74.55%和82.08%。

2.5 菌株的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化特性研究

分別將菌株JN01 接種于NH4+?N 濃度為200 mg/L 的異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基和NO2-?N 濃度為200 mg/L的好氧反硝化培養(yǎng)基中，菌株的生長情況及NH4+?N、NO3-?N、NO2-?N 和TN 變化趨勢(shì)見圖10。以NH4+?N為氮源時(shí)，如圖10?A，24 h 內(nèi)NH4+?N 的濃度明顯下降，且菌株在24 h 內(nèi)的生長速度最快，OD600nm在60 h 時(shí)達(dá)到最大值2.636，之后處于穩(wěn)定期。72 h 內(nèi)，培養(yǎng)基內(nèi)的NH4+?N 和TN 分別降至31.87 mg/L 和38.55 mg/L，降解率分別為84.07%和80.73%。異養(yǎng)硝化過程中NO3-?N 逐漸上升，NO2-?N 呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。

圖10 菌株JN01 在銨態(tài)氮（A）和亞硝態(tài)氮（B）為唯一Fig. 10 Growth characteristics of strain JN01 and trends of NH4+-N, NO3--N, NO2--N, TN with initial NH4+-N(A) or initial NO2--N (B) as sole nitrogen source

NO2-?N 為氮源時(shí)，如圖10?B，菌株JN01 適應(yīng)時(shí)間相對(duì)較長，24 h 后NO2-?N 的濃度開始有較明顯下降。菌株72 h 后進(jìn)入生長穩(wěn)定期，OD600nm最高達(dá)到2.433，此時(shí)NO2-?N 濃度降至35.41 mg/L，降解率為82.30%，TN 從200 mg/L 降至43.64 mg/L，TN 的降解率為78.18%。好氧反硝化過程中NO3-?N 逐漸上升，NH4+?N 先上升后下降。

3 討論

HNAD 菌對(duì)不同氮源的降解情況不盡相同，表1 列舉了部分HNAD 菌對(duì)NH4+?N、NO3-?N、NO2-?N 和總氮的降解情況。由表可知，大多數(shù)菌株來源于水體（含污泥）或土壤，以芽孢桿菌屬的相關(guān)研究報(bào)道最多；從氮去除率來看，Pseudomonas alcaliphila對(duì)NH4+?N、NO3-?N 和NO2-?N 均 具 有100%的去除率［7］，其他菌株多表現(xiàn)為異養(yǎng)硝化或好氧反硝化性能突出，如Bacillus thuringiensisWXN?23［11］和Halomonas venustaTJPU05［6］對(duì)NO2-?N 的去除率達(dá)100%，而對(duì)NH4+?N 的去除率低于87%。B.aryabhattaiJN01 具有良好的異養(yǎng)硝化能力，與其他具有HNAD 特性的芽孢桿菌屬細(xì)菌相比，其對(duì)NH4+?N 的降解率僅次于Bacillus cereusGS?5［17］，后者是利用研制的填料床生物反應(yīng)器固定菌株，并在生物反應(yīng)器中多層交替填充，降解處理過程復(fù)雜，降解成本高。菌株JN01 對(duì)NO2-?N 和總氮的去除率處于中等水平，綜合NH4+?N 的去除情況，B.aryabhattaiJN01 在芽孢桿菌屬中具有良好的異養(yǎng)硝化和好氧反硝化特性。

表1 HNAD 菌對(duì)NH4+-N、NO3--N、NO2--N 和TN 的去除情況Table 1 Removal efficiencies of NH4+-N, NO3--N, NO2--N and TN by HNAD microorganisms

硝化過程是氮化合物轉(zhuǎn)化的開始，會(huì)受到銨態(tài)氮濃度的影響。NH4+?N 濃度越高，菌株JN01 的生長速率受到抑制，氨氮降解率也隨之降低，這表明氮源濃度能夠顯著影響菌株JN01 的生長和氮代謝，即高濃度的銨態(tài)氮抑制了硝化過程，這一結(jié)果與Marek 等［23］的研究結(jié)果一致，即高濃度的NH4+?N 對(duì)微生物細(xì)胞產(chǎn)生脅迫作用。同理，雖然P.alcaliphila［7］和Glutamicibactersp. WS1［22］對(duì)NH4+?N的去除率達(dá)到100%，但兩者處理的初始氨氮濃度分別為150 mg/L 和45 mg/L，若將濃度增加到200 mg/L，相應(yīng)菌株的脫氮性能極有可能受到不同程度的影響。

碳源可以為細(xì)胞生長提供碳骨架元素，并為細(xì)胞代謝提供能量。根據(jù)好氧反硝化細(xì)菌的代謝特點(diǎn)，合適的碳源不僅可以加快菌體生長速率，還可以為好氧反硝化這一氧化還原反應(yīng)過程提供充足的電子供體［10］。不同碳源的化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子量對(duì)反硝化效率有顯著影響，有研究指出菌株一般傾向于利用化學(xué)結(jié)構(gòu)簡單、分子量小的碳源，如乙酸鈉［24］、琥珀酸鈉［14］、和檸檬酸鈉［16］等，也有以蔗糖［12］、葡萄糖［10,25］等為碳源的報(bào)道。菌株JN01 的生長與NH4+?N 降解趨勢(shì)存在一定程度的相關(guān)性。菌株在丙三醇中生長旺盛可能是丙三醇進(jìn)入糖酵解途徑，為菌株生長提供充足能量。以丁二酸鈉和檸檬酸三鈉為碳源的培養(yǎng)基中，菌株JN01 的生長狀況良好，銨態(tài)氮降解效果也較好，這可能是因?yàn)槎《岷蜋幟仕崾侨人嵫h(huán)的中間代謝物［26］，易于直接被菌體細(xì)胞所利用。碳源的濃度會(huì)直接影響菌株的生長和好氧反硝化性能［27］。過低的碳源濃度不僅不能滿足菌體生長的需求，還無法提供氮代謝過程中的有效電子，使菌體的物質(zhì)代謝和能量代謝同時(shí)受限；過高的碳源濃度會(huì)增加培養(yǎng)成本，也會(huì)帶來資源浪費(fèi)。綜合菌株生長及NH4+?N 去除率，說明在一定 C/N 范圍內(nèi)，碳源濃度越高，能量供應(yīng)越充分，好氧反硝化效果越好，這與Patureau 等［28］的研究結(jié)論一致。

大多數(shù)HNAD 細(xì)菌具有較寬泛的pH 適應(yīng)范圍，但進(jìn)行好氧反硝化代謝的最適pH 一般為中性或弱堿性［29］。pH 為7.5 時(shí)，菌株JN01 生長最好，NH4+?N 去除率也最高，這可能是由于弱堿性培養(yǎng)條件下部分NH4+轉(zhuǎn)化為NH3，后者以游離的狀態(tài)更利于細(xì)菌進(jìn)行氨氮代謝［30］。綜合分析菌體生長情況和NH4+?N 去除率發(fā)現(xiàn)，中性至弱堿性培養(yǎng)基更利于菌株 JN01 生長和進(jìn)行氨氮代謝，這一結(jié)論與Glutamicibactersp. WS1［22］類似。細(xì)菌可以在很寬的溫度范圍內(nèi)生存，對(duì)于HNAD 細(xì)菌來說，溫度不僅影響其生長，還對(duì)好氧反硝化效率產(chǎn)生影響。Zhang等［31］指出NH4+?N 向N2的轉(zhuǎn)化是由與硝化和反硝化相關(guān)的功能酶催化的，其活性極易受到溫度變化的影響，因此極端溫度不利于絕大多數(shù)HNAD 細(xì)菌的生長和代謝。菌株JN01 的最適生長溫度和最佳NH4+?N 去除溫度一致，均為30℃，這一結(jié)果與假單胞菌 NP5［26］和不動(dòng)桿菌C?13［32］相似，可見菌株的氨氮降解與細(xì)菌生長密切相關(guān)。

廢水處理過程中銨態(tài)氮和亞硝態(tài)氮往往同時(shí)存在，尤其是在處理水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水時(shí)，氨氮和亞硝態(tài)氮同時(shí)超標(biāo)的情況經(jīng)常遇到。綜合分析比較兩種氮源條件下菌株的生長情況和脫氮能力，菌株JN01 可以在氮起始濃度為200 mg/L 的條件下保持較高的脫氮性能，其中在以NH4+?N 為唯一氮源時(shí)，生長速率更快，表現(xiàn)出良好的異養(yǎng)硝化特性；而NO2-?N 為唯一氮源時(shí)，生長速率和脫氮性能稍弱，但仍保持在較高水平，略高于B. simplexH?b［19］。綜上，菌株JN01 兼具異養(yǎng)硝化和好氧反硝化特性，可適用于氨氮和亞硝酸鹽超標(biāo)的含氮廢水的處理。氮源培養(yǎng)時(shí)的生長曲線及NH4+-N、NO3--N、NO2--N 和TN 變化趨勢(shì)

4 結(jié)論

從福建某水產(chǎn)養(yǎng)殖池底的新鮮污泥中分離篩選到一株氨氮降解菌JN01，通過 16S rRNA 鑒定為阿氏芽孢桿菌（B.aryabhattai）。采用氨氮遞增法對(duì)菌株進(jìn)行馴化，最高氨氮去除率由馴化前的70.18%提升到87.29%。以丁二酸鈉為碳源、碳氮比為15∶1、初始pH 7.5、培養(yǎng)溫度30℃，氨氮添加濃度200.0 mg/L 時(shí)NH4+?N 去除率達(dá)到 92.78%。另外，在亞硝態(tài)氮為唯一氮源的條件下，菌株JN01 對(duì)NO2-?N 降解率可以達(dá)到82.30%。綜上，B.aryabhattaiJN01 能分別利用銨態(tài)氮和亞硝態(tài)氮作單一氮源，并具有較好的生長性能和氮去除率。