• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    米曲霉磷酸甲羥戊酸激酶功能研究

    2024-01-12 12:41:30尚怡彤閆歡歡王麗紅田學(xué)琴薛萍紅羅濤胡志宏
    生物技術(shù)通報 2023年12期
    關(guān)鍵詞:麥角甾醇突變體

    尚怡彤 閆歡歡 王麗紅 田學(xué)琴 薛萍紅 羅濤 胡志宏

    (1. 江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,南昌 330013;2. 江西科技師范大學(xué)江西省生物加工過程重點實驗室,南昌 330013)

    在真核生物中,甲羥戊酸(mevalonate, MVA)途徑是甾醇和類異戊二烯生物合成的主要代謝通路[1]。整個途徑起始于兩分子乙酰輔酶A,由乙酰輔酶A 乙?;D(zhuǎn)移酶(acetyl?coenzyme A acetyltrans?ferase, AACT)、3?羥基?3?甲基戊二酰輔酶A 合酶(3?hydroxy?3?methylglutaryl?CoA synthase, HMGS)、3?羥基?3?甲基戊二酰輔酶A 還原酶(HMG?CoA reductase, HMGR)、甲羥戊酸激酶(mevalonate ki?nase, MK)、磷酸甲羥戊酸激酶(phosphomevalonate kinase, PMK)和甲羥戊酸?5?焦磷酸脫羧酶(meva?lonate?5?pyrophosphate decarboxylase, MVD)6 個連續(xù)的酶催化,合成異戊烯焦磷酸(isopentenyl?5?pyroph?osphate, IPP)(圖1)。在高等植物中,IPP 是類異戊二烯生物合成所需的基本骨架,類異戊二烯是許多植物特定分子的前體,如生長調(diào)節(jié)劑(如赤霉素和脫落酸)、光合色素、植物毒素、植物抗毒素和植物防御所需的其他化合物,以及芳香萜類化合物和天然橡膠等,這些化合物在細(xì)胞過程中具有重要功能[2]。在真菌中,IPP 是麥角甾醇生物合成所需的前體。麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的組成成分,對真菌的生長和生存極其重要。麥角甾醇及其衍生物也具有重要的經(jīng)濟價值,如麥角甾醇是維生素D2和類固醇激素藥物的前體[3-4];11?脫氫麥角甾醇過氧化物具有顯著的抗腫瘤活性;麥角甾醇的結(jié)構(gòu)類似物具有抗HIV 活性[5-6]等。真菌中,MVA 途徑的代謝工程可能為萜類及甾醇類生物合成提供新思路。

    圖1 MVA 途徑代謝通路Fig. 1 MVA pathway metabolic synthesis diagram

    PMK 屬于GHMP 超家族中的一員,其作用是催化磷酸甲羥戊酸(MVAP)進(jìn)一步磷酸化為焦磷酸甲羥戊酸(MVAPP),該過程消耗1 個ATP[7]。PMK在異戊二烯亞基的合成中發(fā)揮作用,異戊二烯亞基用于合成各種必需化合物,包括甾醇、多醇和泛醌。異戊二烯衍生的分子在一些物種中也用于tRNA和特定蛋白質(zhì)的共價修飾等。在動物中PMK 的研究較多,如PMK 基因突變將產(chǎn)生半乳糖激酶缺乏癥(導(dǎo)致動物產(chǎn)生白內(nèi)障)[8];MVA 途徑中的MK、PMK、MVD 參與了多孔性角化?。≒K)的發(fā)病機制[9]。在植物中,類異戊二烯和萜類化合物是極為重要的代謝產(chǎn)物,從植物中提取的精油等都有著豐富的藥用和經(jīng)濟價值,目前已從擬南芥(Arabidopsis thaliana)[10]、橡膠樹(Hevea brasiliensis)[11]、丹參(Salvia miltiorrhiza)[12]、 香 樟(Cinnamomum camphora)[13]、檀香木(Santalum album)[14]等植物中克隆分離并研究了PMK 基因。在真菌中PMK是麥角甾醇通路上游必不可少的酶,因此又稱為Erg8。1991 年,研究者首先從釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中克隆了ERG8基因,并且證明其是異戊二烯和麥角甾醇合成所必需基因[15]。在鮑姆桑黃菌(Sanghuangporus baumii)中研究發(fā)現(xiàn),Erg8 對其活性成分三萜類化合物的合成十分重要[16]。由于真菌中Erg8是合成麥角甾醇必不可少的基因,因此Erg8也是開發(fā)抗真菌藥物的作用靶點[17-18]。

    然而,Erg8基因在工業(yè)真菌——米曲霉(Aspergillus oryzae)中的功能研究甚少。米曲霉是食品和藥物管理局(FDA)和世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)定的安全生產(chǎn)菌株,長期以來,它不僅用于傳統(tǒng)的食品發(fā)酵、釀造和調(diào)味品行業(yè),還用于酶制劑和重組蛋白生產(chǎn)等現(xiàn)代生物技術(shù)行業(yè)[2,19]。之前的生物信息學(xué)研究表明,米曲霉基因組中有1 個PMK 編碼基因[20]。在本研究中,使用生物信息學(xué)分析鑒定編碼PMK 的基因,通過酵母互補研究該基因的功能,并確定它的表達(dá)模式、亞細(xì)胞定位以及過表達(dá)表型和對麥角甾醇生物合成的影響,揭示磷酸甲羥戊酸激酶在米曲霉中的作用,這將為米曲霉或其他真菌脂質(zhì)代謝的基因工程奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    野生型米曲霉3.042(CICC 40092)來源于國家菌種保藏中心(中國北京)。尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型(ΔpyrG)米曲霉3.042 菌株由本實驗室構(gòu)建[21]。米曲霉在30℃的Czapek Dox 瓊脂培養(yǎng)基(2%葡萄糖、0.2% NaNO3、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4、0.05%KCl、0.05% NaCl、0.002% FeSO4、1.5% agar、pH 5.5)中培養(yǎng),3-5 d 后收集孢子,然后懸浮在含有0.05%Tween 80 的無菌水中,并用血細(xì)胞計數(shù)器測定孢子的濃度。大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α 用于質(zhì)粒構(gòu)建,根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL1 用于根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的米曲霉轉(zhuǎn)化。大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌分別在37℃和28℃的LB 培養(yǎng)基(添加對應(yīng)的抗生素)中培養(yǎng)。

    1.2 方法

    1.2.1 進(jìn)化樹分析 以酵母ERG8 為參考序列,通過NCBI 在線查找其同源性序列,并使用相鄰連接方法在MEGA 6.0 中創(chuàng)建進(jìn)化樹。所用的物種及PMK/Erg8 蛋白GI 號見表1。

    表1 不同物種Erg8 序列號Table 1 Erg8 numbers of different species

    1.2.2 基因表達(dá)模式分析 收集不同生長時間和不同脅迫條件下的菌絲體,液氮中冷凍并粉碎,使用真菌RNA 試劑盒(Omega Bio?Tek, Norcross, GA)提取總RNA。使用NanoDrop ND?2000 分光光度計(Thermo Scientific, Wilmington, DE)測定質(zhì)量和濃度。使用Prime Script RT 試劑盒(Perfect Real Time,TaKaRa)從1 mg 總RNA 合成cDNA。使用試劑SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa,日本)和CFX96 實時PCR 檢測系統(tǒng)(Bio?Rad, CA)進(jìn)行所有熒光定量PCR(RT?qPCR)操作[22]。組蛋白H4 用作內(nèi)參基因,使用公式2-ΔΔCt計算相對表達(dá)量。用于RT?qPCR 的引物序列見表2。

    1.2.3 酵母互補erg8突變體(Y40835)和相應(yīng)的酵母菌株BY4741 均購自EUROSCARF(http://www.euroscarf.de/index.php)。質(zhì)粒pYES 2.0 用作酵母互補的載體[23]。使用一步克隆試劑盒(Vazyme Biotech Co., Ltd., China)將AoErg8的全長編碼序列(CDS)融合到pYES 2.0(Hind III 和EcoR I 線性化),所用引物列于表2 中。使用酵母轉(zhuǎn)化試劑盒II(Coolaber,中國北京)將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的酵母突變體中。對照和轉(zhuǎn)化子分別在YPD(1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、1% agar)和YPG(1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%半乳糖、1% agar)培養(yǎng)基上生長,在30℃和37℃下觀察表型。此外,收集在30℃的液體YPG 中培養(yǎng)2 d 的對照和轉(zhuǎn)化子,以測定麥角甾醇的含量。

    1.2.4 基因過表達(dá)表型及麥角甾醇的測定 使用二元載體pEX2B[24]進(jìn)行基因過表達(dá)。使用pEX2B?AoErg8?F/R 引物(表2)擴增AoErg8基因,通過一步法(Vazyme Biotech Co., Ltd., China) 連接到二元載體pEX2B(經(jīng)AflII 線性化),得到pEX2B?AoErg8?DsRed 載體;并轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌 AGL1中;最后使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化為米曲霉3.042 ΔpyrG[21]。

    麥角甾醇的提取采用醇堿皂化法。收集培養(yǎng)3 d 的米曲霉菌體,真空冷凍干燥至恒重,研磨,稱取0.05 g 菌體粉末置于小玻璃瓶中,加入3 mL 乙醇?KOH 溶液(25 g KOH + 35 mL ddH2O,無水乙醇定容至100 mL),渦旋1 min,85℃ 水浴鍋中水浴 1.5 h 進(jìn)行皂化。待其冷卻至室溫,加入3 mL 正庚烷和1 mL 超純水,渦旋3 min。靜置分層,取上層液體1.5 mL,于12 000 r/min 離心10 min,取上清1 mL 于進(jìn)樣瓶中,進(jìn)行高效液相色譜檢測。使用美國Waters e2695 HPLC 系統(tǒng)、Water 2489 UV 檢測器、Empower數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)、C18色譜柱;流動相體系為甲醇∶水=95∶5,流動相流速為1.5 mL/min,紫外檢測波長為282 nm,每針進(jìn)樣體積為10 μL,每個實驗重復(fù)3 次[22-23,25]。

    1.2.5 亞細(xì)胞定位 將構(gòu)建的pEX2B?AoErg8?DsRed質(zhì)粒和具有GFP 報告基因的pt?pEX1 質(zhì)粒[21]共轉(zhuǎn)到米曲霉3.042 ΔpyrG中,使用Leica DM5000B 顯微鏡觀察熒光,以確定融合蛋白的亞細(xì)胞定位。

    2 結(jié)果

    2.1 生物信息學(xué)分析

    為了研究米曲霉中AoErg8的功能,對不同生物中的PMK 進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果(圖2)顯示,所有分析的物種中都至少含有一個PMK 同源基因?;赑MK 基因的起源,系統(tǒng)發(fā)育樹可以分為植物、真菌、細(xì)菌和動物的分支,動物界智人和小鼠、節(jié)肢昆蟲中家蠶和歐洲熊蜂為一支;植物、真菌、細(xì)菌為一支。因此,Erg8 在植物、動物和真菌中是進(jìn)化保守的,這與其在植物、動物和微生物中均為MVA 途徑下游IPP 合成必需酶的功能一致。

    圖2 不同物種磷酸甲羥戊酸激酶的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of phosphomevalonate kinases from different species

    2.2 表達(dá)模式分析

    為了研究AoErg8在米曲霉生長過程中的作用,使用RT?qPCR 測定其在不同生長時間和不同生長條件下的表達(dá)量。在正常條件下,不同生長時間的AoErg8的表達(dá)水平不同,72 h 表達(dá)量最高,是24 h 的2 倍,是48 h 的20 倍(圖3?A)。據(jù)報道,麥角甾醇參與了釀酒酵母的應(yīng)激反應(yīng),因此還研究了AoErg8在溫度和非生物脅迫下的表達(dá):30℃時AoErg8表達(dá)水平最高;低溫下,22℃時表達(dá)量為30℃一半;高溫下,37℃時顯著降低,到42℃又明顯上調(diào)(圖3?B)。鹽處理抑制了AoErg8的表達(dá),在5%、10%和15% NaCl 脅迫下的表達(dá)水平僅約為對照的1/10、1/11 和3/10(圖3?C)。AoErg8的表達(dá)在2%乙醇脅迫下減少了約4/5,在4%乙醇脅迫下僅為對照的1/6 左右(圖3?D)。因此,AoErg8在不同生長時間和不同脅迫下表達(dá)量均發(fā)生了明顯的改變。

    圖3 AoErg8 在瓊脂CD 培養(yǎng)基上不同生長時間和不同非生物脅迫下的表達(dá)水平Fig.3 Expressions of AoErg8 on agar CD medium under different growth time and different abiotic stress

    2.3 酵母互補

    釀酒酵母erg8突變體對溫度敏感,在37℃下高溫致死。為了驗證米曲霉AoErg8功能是否保守,將AoErg8基因的全長CDS 融合到酵母表達(dá)載體(pYES2.0)上,并轉(zhuǎn)化到酵母erg8突變體中。由于pYES2.0 含有半乳糖誘導(dǎo)的GAL1 啟動子,在30℃和37℃的YPD(葡萄糖)和YPG(半乳糖作為誘導(dǎo)劑)培養(yǎng)基上分別觀察到所有轉(zhuǎn)化子的表型。結(jié)果(圖4?A)表明,erg8突變體在37℃下在YPD 和YPG 上不能生長;AoErg8轉(zhuǎn)化子可以恢復(fù)37℃下的致死表型。此外,測量了30℃液體培養(yǎng)基中對照和所有轉(zhuǎn)化子的麥角甾醇含量。當(dāng)YPG 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化基因時,AoErg8/erg8轉(zhuǎn)化子的麥角甾醇含量與突變體相比有所增加(圖4?B)。因此,AoErg8可以部分恢復(fù)erg8突變體中麥角甾醇的含量,進(jìn)一步說明AoErg8可以恢復(fù)erg8突變體的溫度敏感性表型。

    圖4 AoErg8 可以恢復(fù)釀酒酵母erg8 突變體的表型Fig. 4 AoErg8 may restore the phenotype of Saccharomyces cerevisiae erg8 mutant

    2.4 AoErg8過表達(dá)表型及對麥角甾醇的影響

    將構(gòu)建的pEX2B?AoErg8?DsRed 載體轉(zhuǎn)化米曲霉,過表達(dá)米曲霉AoErg8。轉(zhuǎn)化子馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)中培養(yǎng),觀察表型。結(jié)果(圖5?A)顯示,AoErg8過表達(dá)菌株顏色加深,孢子和氣生菌絲增多;從橫切面可以直觀觀察到孢子濃密以及氣生菌絲的高度增加。此外,還統(tǒng)計了PDA 培養(yǎng)基中的孢子數(shù)和菌落直徑,結(jié)果(圖5?B, C)表明,AoErg8過表達(dá)菌株的孢子數(shù)和菌落直徑都有所增加。由于AoErg8 參與麥角甾醇合成,還測量了AoErg8過表達(dá)菌株的麥角甾醇含量。結(jié)果(圖5?D)顯示,AoErg8過表達(dá)菌株中麥角甾醇的含量降低了50%。因此,AoErg8的過表達(dá)影響了米曲霉菌株生長、孢子形成和麥角甾醇含量。

    2.5 AoErg8亞細(xì)胞定位

    鑒定AoErg8 亞細(xì)胞定位對于理解其功能非常重要。因此,使用紅熒光蛋白DsRed 作為報告基因來研究AoErg8 在米曲霉中的亞細(xì)胞定位。DsRed基因在AoErg8的C 末端融合,以尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型作為篩選標(biāo)記構(gòu)建過表達(dá)載體,觀察到AoErg8在細(xì)胞中均勻分布。同時,將AoErg8?DsRed 與僅含GFP 為報告基因的pt?PEX1?GFP 載體(GFP 均勻定位于細(xì)胞質(zhì))共定位觀察發(fā)現(xiàn),綠色熒光和紅色熒光完全重合,從而表明AoErg8 定位在細(xì)胞質(zhì)(圖6)。

    圖6 AoErg8 的亞細(xì)胞定位Fig. 6 Subcellular localization of AoErg8

    3 討論

    鑒定MVA 途徑基因功能對MVA 途徑的遺傳修飾很重要。MVA 途徑在生產(chǎn)類異戊二烯、合成橡膠商業(yè)生產(chǎn)的重要原料和高能生物燃料方面具有潛在的應(yīng)用[16,26]。在真菌中,MVA 途徑是麥角甾醇生物合成途徑的上游,這在釀酒酵母中已經(jīng)得到了很好的研究[27]。然而,在工業(yè)應(yīng)用十分廣泛的米曲霉中關(guān)于麥角甾醇生物合成途徑的研究還很少。課題組前期研究表明,麥角甾醇生物合成途徑在釀酒酵母和米曲霉之間是保守的,而米曲霉中的麥角甾醇生物合成基因更為復(fù)雜,有多個同源物編碼相同的生物合成酶[28]。本實驗室前期工作對兩個MVA 途徑上游的基因Erg10和Erg19及下游的Sterol 甾醇14α-去甲基酶Erg11進(jìn)行了研究[2,22-23],而目前尚無關(guān)于米曲霉中Erg8基因的報道。

    3.1 AoErg8在米曲霉中的功能

    本研究主要對米曲霉麥角甾醇合成通路中的AoErg8基因功能進(jìn)行了研究。生物信息學(xué)分析表明,AoErg8在生物進(jìn)化上是保守的。據(jù)報道,橡膠樹[13]、檀香木[16]、茯苓[29]等PMK 基因可恢復(fù)釀酒酵母的erg8缺失突變,獨行菜[30]、紫蘇[31]、鮑姆桑黃菌[18]等具有GHMP 激酶超家族多個保守結(jié)構(gòu)域,說明PMK 在功能上是保守的。本研究發(fā)現(xiàn),AoErg8在早期(24 h)和晚期(72 h)表達(dá)量相對較高,暗示其可能參與早期生長發(fā)育和晚期產(chǎn)孢這兩個過程;與該結(jié)果一致的是,AoErg8過表達(dá)菌株確實影響了菌絲體的生長和產(chǎn)孢;酵母互補實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),AoErg8可以恢復(fù)erg8釀酒酵母突變體的溫度敏感表型,證明了AoErg8在米曲霉和酵母中功能相對保守;以熒光蛋白為報告基因研究發(fā)現(xiàn),AoErg8定位于細(xì)胞質(zhì)中;過表達(dá)AoErg8基因不僅降低了麥角甾醇的含量,還對米曲霉孢子和菌絲的生長都有影響。

    3.2 AoErg8在麥角甾醇合成通路中的功能

    之前本實驗室已經(jīng)研究了Erg8 下游的甲羥戊酸?5?焦磷酸脫羧酶(Erg19),AoErg19的功能在釀酒酵母和米曲霉之間也是保守的,AoErg19 定位在液泡,過表達(dá)AoErg19對米曲霉的菌絲生長沒有顯著影響,但同樣降低了麥角甾醇的生物合成[2],通過RT?qPCR 證明了在AoErg19過表達(dá)菌株中AoErg8表達(dá)量下調(diào),暗示AoErg8 可能是AoErg19過表達(dá)菌株中反饋調(diào)節(jié)的靶標(biāo)。因此,進(jìn)一步研究米曲霉麥角甾醇生物合成途徑中的相關(guān)基因,為將來通過基因的表達(dá)調(diào)控、合成生物學(xué)等手段提高麥角甾醇的產(chǎn)量提供重要的科學(xué)依據(jù)。AoErg8的研究不僅對理解MVA 途徑具有重要意義,而且對麥角甾醇生物合成途徑也具有重要意義。

    4 結(jié)論

    本研究確定了AoErg8的功能、表達(dá)模式、亞細(xì)胞定位。AoErg8作為MVA 途徑中的關(guān)鍵基因,在進(jìn)化上是保守的,其能夠回補釀酒酵母erg8突變體的溫度敏感表型。AoErg8 定位于細(xì)胞質(zhì)中,AoErg8的過表達(dá)不僅降低了麥角甾醇的生物合成,對米曲霉菌落生長和孢子形成都有一定影響,表明AoEgr8參與到米曲霉的多種生理過程。因此,對米曲霉AoErg8基因的鑒定可能為MVA 途徑及麥角甾醇合成通路的遺傳調(diào)控提供有價值的信息。

    猜你喜歡
    麥角甾醇突變體
    麥角硫因治療認(rèn)知衰弱的研究進(jìn)展
    高甾醇植物油研究現(xiàn)狀
    麥角新堿聯(lián)合縮宮素在高危妊娠剖宮產(chǎn)術(shù)中的應(yīng)用
    尼麥角林治療卒中后認(rèn)知障礙的臨床研究
    CLIC1及其點突變體與Sedlin蛋白的共定位研究
    擬南芥干旱敏感突變體篩選及其干旱脅迫響應(yīng)機制探究
    石杉堿甲聯(lián)合尼麥角林治療血管性癡呆的效果觀察
    Survivin D53A突變體對宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響
    微波輔助植物甾醇油酸酯的酶促催化合成
    磷酸三酯酶突變體H23A的真核表達(dá)及性質(zhì)表征
    听说在线观看完整版免费高清| 精品国产三级普通话版| 少妇的逼水好多| 在线免费观看的www视频| 国产色婷婷99| 国产成人a∨麻豆精品| 日韩欧美 国产精品| 久久久国产成人精品二区| 国产成人影院久久av| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 在现免费观看毛片| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 美女cb高潮喷水在线观看| 长腿黑丝高跟| 少妇被粗大猛烈的视频| 久久鲁丝午夜福利片| 中文字幕久久专区| 男人的好看免费观看在线视频| 成年女人永久免费观看视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产精品一区二区性色av| 日韩国内少妇激情av| 久久这里有精品视频免费| 极品教师在线视频| 国产人妻一区二区三区在| 国产精品三级大全| 亚洲真实伦在线观看| 日本成人三级电影网站| 国产伦理片在线播放av一区 | 成年av动漫网址| 性色avwww在线观看| 国产成年人精品一区二区| 少妇人妻一区二区三区视频| 天堂中文最新版在线下载 | 亚洲av电影不卡..在线观看| 69人妻影院| 日日撸夜夜添| 成人特级黄色片久久久久久久| 丝袜喷水一区| 午夜福利成人在线免费观看| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产成人精品久久久久久| 91狼人影院| 久久久久久久久久久丰满| 简卡轻食公司| 综合色丁香网| 波多野结衣高清无吗| 国产高清不卡午夜福利| 国产午夜精品一二区理论片| 一本一本综合久久| 精品免费久久久久久久清纯| 美女黄网站色视频| 只有这里有精品99| 国产精品1区2区在线观看.| 国产成人精品一,二区 | 国产视频内射| 亚洲最大成人手机在线| 午夜亚洲福利在线播放| 国产高清视频在线观看网站| av视频在线观看入口| av免费在线看不卡| 九九在线视频观看精品| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产久久久一区二区三区| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲va在线va天堂va国产| 中国国产av一级| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲欧洲国产日韩| 婷婷六月久久综合丁香| 久久精品影院6| 欧美在线一区亚洲| 一个人观看的视频www高清免费观看| 最近手机中文字幕大全| 天天躁日日操中文字幕| 中国美女看黄片| 国模一区二区三区四区视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 日本欧美国产在线视频| 人妻少妇偷人精品九色| 人妻系列 视频| 中出人妻视频一区二区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲在线自拍视频| 久久这里有精品视频免费| 看黄色毛片网站| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产精品99久久久久久久久| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 免费av不卡在线播放| 一区二区三区高清视频在线| 国产精品一区二区性色av| 亚洲自拍偷在线| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 免费看光身美女| 51国产日韩欧美| 中文字幕免费在线视频6| 日韩大尺度精品在线看网址| 午夜视频国产福利| 中国美白少妇内射xxxbb| 久久久久国产网址| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲电影在线观看av| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲美女视频黄频| 久久久久久久午夜电影| 两个人视频免费观看高清| 国产成人影院久久av| 国产人妻一区二区三区在| 欧美色欧美亚洲另类二区| 极品教师在线视频| 内地一区二区视频在线| 天堂影院成人在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 欧美最黄视频在线播放免费| 成人一区二区视频在线观看| 99热精品在线国产| 久久久欧美国产精品| 成人永久免费在线观看视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲一区二区三区色噜噜| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 午夜a级毛片| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲自偷自拍三级| 一级毛片久久久久久久久女| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲精品国产av成人精品| 午夜激情欧美在线| 国产91av在线免费观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 在线国产一区二区在线| 国产免费男女视频| 伦理电影大哥的女人| 高清午夜精品一区二区三区 | 激情 狠狠 欧美| 国产视频首页在线观看| 精品久久久久久久末码| 精品人妻熟女av久视频| 色视频www国产| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲丝袜综合中文字幕| 不卡视频在线观看欧美| 女同久久另类99精品国产91| 久久久午夜欧美精品| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲内射少妇av| 欧美zozozo另类| 毛片女人毛片| 青春草国产在线视频 | 国产精品乱码一区二三区的特点| 高清午夜精品一区二区三区 | 人妻制服诱惑在线中文字幕| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 国产精品综合久久久久久久免费| 成人三级黄色视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 一级二级三级毛片免费看| 美女内射精品一级片tv| 午夜激情欧美在线| av黄色大香蕉| kizo精华| 99视频精品全部免费 在线| 神马国产精品三级电影在线观看| 丰满的人妻完整版| 最近视频中文字幕2019在线8| 久久6这里有精品| 久久午夜福利片| 麻豆av噜噜一区二区三区| 美女被艹到高潮喷水动态| 看免费成人av毛片| 国产极品精品免费视频能看的| 又粗又爽又猛毛片免费看| www日本黄色视频网| 国产亚洲91精品色在线| 亚洲七黄色美女视频| 日韩高清综合在线| 最近的中文字幕免费完整| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产探花在线观看一区二区| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产一区二区三区av在线 | 中文在线观看免费www的网站| 国产成人一区二区在线| 国产成人精品久久久久久| 久久精品国产自在天天线| 深夜精品福利| 岛国在线免费视频观看| 1024手机看黄色片| 亚洲国产精品国产精品| 尾随美女入室| 精品熟女少妇av免费看| 婷婷色综合大香蕉| 一级毛片电影观看 | 在线观看一区二区三区| 欧美一区二区亚洲| 一级黄片播放器| 亚洲在线观看片| 黄色配什么色好看| 91久久精品电影网| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲国产欧美人成| 夜夜爽天天搞| 国产中年淑女户外野战色| 国产在视频线在精品| 国产成人一区二区在线| 99视频精品全部免费 在线| 欧美日韩精品成人综合77777| 97在线视频观看| 亚洲欧美清纯卡通| 国产高清有码在线观看视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 一区二区三区四区激情视频 | 夫妻性生交免费视频一级片| 欧美又色又爽又黄视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 两个人视频免费观看高清| 亚洲成人久久爱视频| 美女高潮的动态| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲在久久综合| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲av男天堂| а√天堂www在线а√下载| 能在线免费观看的黄片| 国产精品永久免费网站| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲成人av在线免费| 日韩精品青青久久久久久| 国产成年人精品一区二区| 欧美zozozo另类| 中出人妻视频一区二区| 国产午夜精品论理片| 国产精品一区二区性色av| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| av在线天堂中文字幕| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产综合懂色| .国产精品久久| 国产一区二区三区av在线 | 中文在线观看免费www的网站| 天天一区二区日本电影三级| 午夜福利高清视频| 免费电影在线观看免费观看| 观看美女的网站| 99热全是精品| 久久这里有精品视频免费| 午夜福利高清视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产淫片久久久久久久久| 极品教师在线视频| 国产日韩欧美在线精品| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 此物有八面人人有两片| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| videossex国产| 免费看日本二区| 波多野结衣巨乳人妻| 日本成人三级电影网站| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲av第一区精品v没综合| 成年免费大片在线观看| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 最新中文字幕久久久久| 天美传媒精品一区二区| 国产中年淑女户外野战色| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 不卡一级毛片| 国产亚洲91精品色在线| 亚洲欧美清纯卡通| 男女那种视频在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 日本五十路高清| or卡值多少钱| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲三级黄色毛片| 两个人的视频大全免费| 爱豆传媒免费全集在线观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 成年av动漫网址| 白带黄色成豆腐渣| 丰满的人妻完整版| 日韩高清综合在线| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲色图av天堂| 久久人人精品亚洲av| 国产精品精品国产色婷婷| 99热这里只有是精品在线观看| kizo精华| 国产精品无大码| 午夜亚洲福利在线播放| 中出人妻视频一区二区| 少妇高潮的动态图| 一区福利在线观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产精品久久电影中文字幕| 少妇的逼水好多| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产一区二区在线观看日韩| 国产精品,欧美在线| 嫩草影院入口| 亚洲在线观看片| 精品一区二区三区人妻视频| 国产男人的电影天堂91| 亚洲国产色片| 国产激情偷乱视频一区二区| 男女啪啪激烈高潮av片| 久久久久久大精品| 国产麻豆成人av免费视频| 看片在线看免费视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 成人特级av手机在线观看| 日本欧美国产在线视频| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲国产精品sss在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲av电影不卡..在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久这里只有精品中国| 亚洲精品久久国产高清桃花| 又爽又黄a免费视频| 熟女电影av网| 日韩欧美三级三区| 日本一二三区视频观看| 亚洲在线自拍视频| 91久久精品电影网| 色综合站精品国产| 日本黄色片子视频| h日本视频在线播放| 国产男人的电影天堂91| 在现免费观看毛片| 国产激情偷乱视频一区二区| 日韩精品青青久久久久久| 中文字幕熟女人妻在线| 99热这里只有是精品在线观看| 日韩成人伦理影院| 国产精品无大码| 色播亚洲综合网| 日本三级黄在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 美女黄网站色视频| 午夜激情福利司机影院| 色5月婷婷丁香| 精华霜和精华液先用哪个| 久久午夜福利片| 成人美女网站在线观看视频| 日韩一本色道免费dvd| 日本av手机在线免费观看| 校园春色视频在线观看| 成年版毛片免费区| 免费电影在线观看免费观看| 欧美色视频一区免费| 国产在线男女| 成人三级黄色视频| 久久韩国三级中文字幕| 天堂网av新在线| 日日啪夜夜撸| 深爱激情五月婷婷| 国产av一区在线观看免费| 国产一级毛片七仙女欲春2| 欧美性猛交黑人性爽| 欧美丝袜亚洲另类| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲精品成人久久久久久| 一个人观看的视频www高清免费观看| 在线播放国产精品三级| 精品熟女少妇av免费看| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产成人一区二区在线| 国产高清激情床上av| 在线观看午夜福利视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 最近视频中文字幕2019在线8| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 免费观看在线日韩| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产单亲对白刺激| 夫妻性生交免费视频一级片| 天堂√8在线中文| 国产精品一二三区在线看| 一级黄色大片毛片| 久久久精品94久久精品| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产成人精品久久久久久| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 日本在线视频免费播放| 人妻夜夜爽99麻豆av| 观看美女的网站| 在线播放国产精品三级| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 深夜a级毛片| 日本一二三区视频观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日本五十路高清| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产色婷婷99| 欧美日韩在线观看h| 亚洲五月天丁香| a级一级毛片免费在线观看| 精品久久久久久久久亚洲| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产午夜精品论理片| 国产一区亚洲一区在线观看| 日韩一区二区三区影片| 国产精品一区二区在线观看99 | 国产麻豆成人av免费视频| 不卡视频在线观看欧美| 深夜精品福利| 男人狂女人下面高潮的视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 亚洲精品国产成人久久av| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 天堂中文最新版在线下载 | 麻豆国产97在线/欧美| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产高清不卡午夜福利| 久久久久久久午夜电影| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产高潮美女av| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产私拍福利视频在线观看| 99热全是精品| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 91久久精品国产一区二区三区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 全区人妻精品视频| 成人漫画全彩无遮挡| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产三级在线视频| 久久九九热精品免费| 亚洲欧美日韩东京热| 床上黄色一级片| 级片在线观看| 美女大奶头视频| 麻豆成人午夜福利视频| 国产毛片a区久久久久| 国产单亲对白刺激| 黄色日韩在线| 精品午夜福利在线看| 成人亚洲精品av一区二区| 久久热精品热| 一边摸一边抽搐一进一小说| av在线亚洲专区| 高清日韩中文字幕在线| 干丝袜人妻中文字幕| 国产极品精品免费视频能看的| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 深夜精品福利| 国产精品久久久久久久久免| 国产极品精品免费视频能看的| 综合色丁香网| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产精品av视频在线免费观看| 午夜激情福利司机影院| 国产老妇女一区| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 波多野结衣高清作品| 晚上一个人看的免费电影| 国产爱豆传媒在线观看| 69av精品久久久久久| 18+在线观看网站| 床上黄色一级片| 久久久久久久久久久丰满| 国产 一区精品| 国产精华一区二区三区| 国产精品99久久久久久久久| 国产成人福利小说| 久久人妻av系列| 激情 狠狠 欧美| 精品久久久久久久久久免费视频| eeuss影院久久| 久久99热6这里只有精品| 一进一出抽搐gif免费好疼| 能在线免费看毛片的网站| 麻豆成人av视频| 国国产精品蜜臀av免费| 国产精品永久免费网站| 亚洲国产精品sss在线观看| 禁无遮挡网站| 国产成人freesex在线| 长腿黑丝高跟| 亚洲av电影不卡..在线观看| 日日啪夜夜撸| 亚洲精品国产av成人精品| 免费无遮挡裸体视频| 青春草亚洲视频在线观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 黄片wwwwww| 久久久国产成人精品二区| 日韩一本色道免费dvd| 久久九九热精品免费| 免费av不卡在线播放| 午夜亚洲福利在线播放| 国产在线精品亚洲第一网站| 精品久久久久久久久亚洲| 91aial.com中文字幕在线观看| 一个人免费在线观看电影| 看黄色毛片网站| 国产一区二区在线av高清观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 成人三级黄色视频| 国产日本99.免费观看| 国产乱人视频| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲成人av在线免费| 日日干狠狠操夜夜爽| 91狼人影院| 亚洲精品国产成人久久av| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲自偷自拍三级| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 哪个播放器可以免费观看大片| 人妻系列 视频| 日韩人妻高清精品专区| 麻豆成人午夜福利视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 有码 亚洲区| 国产探花在线观看一区二区| av专区在线播放| 五月伊人婷婷丁香| 99久国产av精品| 亚洲精品日韩av片在线观看| 日韩一区二区三区影片| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产片特级美女逼逼视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 超碰av人人做人人爽久久| 免费av观看视频| 国产视频首页在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 精品不卡国产一区二区三区| 国产精品久久视频播放| 国产毛片a区久久久久| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 国产精品三级大全| 精品国内亚洲2022精品成人| 变态另类丝袜制服| 午夜视频国产福利| a级毛片a级免费在线| 高清毛片免费看| 神马国产精品三级电影在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区 | 床上黄色一级片| 国产av麻豆久久久久久久| 日韩强制内射视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 久久亚洲国产成人精品v| 听说在线观看完整版免费高清| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲欧洲日产国产| 免费一级毛片在线播放高清视频| 精品久久国产蜜桃| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 欧美一区二区国产精品久久精品| 波多野结衣巨乳人妻| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 国产精品野战在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| a级一级毛片免费在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲成av人片在线播放无| 青春草亚洲视频在线观看| 特级一级黄色大片| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲色图av天堂| 高清毛片免费观看视频网站| 国产午夜福利久久久久久| 美女 人体艺术 gogo| 国产三级在线视频| 久久久国产成人精品二区| 欧美bdsm另类| 99久久成人亚洲精品观看| 99热只有精品国产| 国产成人精品一,二区 | 亚洲人成网站高清观看| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲精品国产成人久久av| 91狼人影院| 欧美激情在线99| av天堂中文字幕网| 久久国内精品自在自线图片| 欧美精品一区二区大全| 国产视频内射| 日韩中字成人| 在线播放国产精品三级| 亚州av有码| 欧美变态另类bdsm刘玥| 超碰av人人做人人爽久久| 色综合色国产| 插阴视频在线观看视频| 22中文网久久字幕| 久久久国产成人精品二区| 草草在线视频免费看| 丝袜喷水一区| 成人特级av手机在线观看| 伦精品一区二区三区| 亚洲精品影视一区二区三区av| 全区人妻精品视频|