基于抗體-適配體夾心生物傳感器檢測(cè)大腸桿菌O157: H7

侯煒辰 葉柯 李潔 張洋子 許文濤 朱龍佼 李相陽(yáng)

（1. 北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與健康系 食品精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

大腸桿菌（Escherichia coli）是一種革蘭氏陰性短桿菌，作為正常菌群存在于人或溫血?jiǎng)游锏捏w內(nèi)，同時(shí)也被用作多種基質(zhì)糞便污染的指標(biāo)［1-3］。然而，一些進(jìn)化的大腸桿菌群體已經(jīng)積累了致病性，對(duì)人類造成潛在威脅。

腸出血性大腸桿菌O157: H7 是一種產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌，是主要致病性大腸桿菌之一。大腸桿菌O157: H7 是一種罕見的大腸桿菌血清型，1980 年首次作為腸道病原體報(bào)道，從食用半熟漢堡后患出血性結(jié)腸炎的患者中分離［4］。此后，陸續(xù)報(bào)告了由大腸桿菌O157: H7 導(dǎo)致的出血性和非出血性腹瀉以及溶血性尿毒癥綜合征（haemolytic uraemic syndrome，HUS）、出血性結(jié)腸炎（haemorrhagic colitis，HC）、血栓性血小板減少性紫癜（thrombocytopenic purpu?ra，TTP），如果未進(jìn)行及時(shí)的治療會(huì)危及生命［5-6］。

目前對(duì)于大腸桿菌的檢測(cè)方法主要依據(jù)國(guó)標(biāo)GB 4789.36-2016［7］、免疫學(xué)鑒定法［8］和分子學(xué)中基于核酸擴(kuò)增的檢測(cè)方法［9］，此外還有一些光學(xué)［10］和電化學(xué)［11］等檢測(cè)手段。目前的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法仍是傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，通常基于選擇性預(yù)富集、富集和鍍膜，然后使用菌落形態(tài)、糖發(fā)酵模式和溶血特性來(lái)確認(rèn)疑似菌落。雖然這種方法廉價(jià)且簡(jiǎn)單，但由于其耗時(shí)長(zhǎng)且操作繁雜，并不適用于致病菌的快速篩查和即時(shí)檢測(cè)。

適配體是基于DNA 或RNA 的短單鏈寡核苷酸，當(dāng)其折疊成獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)時(shí)，可以選擇性地靶標(biāo)結(jié)合，具有高親和力和特異性［12-13］。目前已有報(bào)道多種適配體作為診斷工具和疾病治療藥物靶向不同的目標(biāo)。利用適配體進(jìn)行檢測(cè)、分析和量化小分子和蛋白質(zhì)已經(jīng)成為時(shí)下熱點(diǎn)。使用適配體作為探針的一個(gè)最重要的優(yōu)點(diǎn)是該技術(shù)不需要?jiǎng)游锘蝮w內(nèi)免疫，從而最大限度地減少批次與批次之間的差異［14-15］。

傳統(tǒng)方法由于耗時(shí)長(zhǎng)，需要培養(yǎng)和核酸提取等步驟，無(wú)法滿足快速檢測(cè)需求。為了克服這些限制，及時(shí)采取措施防止疾病傳播和擴(kuò)散，本研究旨在開發(fā)一種快速、準(zhǔn)確的大腸桿菌檢測(cè)方法，以便在醫(yī)療、食品安全和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，為保護(hù)公共衛(wèi)生和人民的健康提供有力支持。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究涉及的核酸適配體序列在上海生工生物技術(shù)有限公司合成（表1）；大腸桿菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌、單核增生李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌、兔多克隆抗體由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)估（食品）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；NaCl、MgCl2、KCl、Na2HPO4、KH2PO4購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA）購(gòu)自山東拓普生物工程有限公司；吐溫20（Tween?20）購(gòu)自天津富宇精細(xì)化工有限公司；1?（3?二甲氨基丙基）?3?乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N?羥基琥珀酰亞胺（NHS）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；2?（N?嗎啉）乙磺酸（MES）購(gòu)自南京都萊生物技術(shù)有限公司。自配制PBS 緩沖溶液（pH 7.4，8 g NaCl，0.2 g KH2PO4，2.9 g Na2HPO4·12H2O，0.2 g KCl，使用蒸餾水定容至1 L）、PBST 緩沖溶液（1 L PBS 緩沖溶液，0.5 mL Tween?20）、TE（稱取1.211 4 g Tris，0.033 6 g EDTA，使用蒸餾水定容至100 mL。）、SPSS（稱取NaCl 0.45 g，使用蒸餾水定容至50 mL）、BB結(jié)合緩沖液（pH 7.5，6.06 g Tris，8.775 g NaCl 和0.476 g MgCl2溶于800 mL 去離子水中，使用蒸餾水定容至1 L）。

LineGene 9600plus 熒光定量PCR 檢測(cè)儀購(gòu)于杭州博日科技有限公司）；CF1524R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)于杭州恒流科技有限公司；可調(diào)式混勻儀旋渦混合器購(gòu)于北京開源國(guó)創(chuàng)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗體-適配體夾心法檢測(cè)原理 以免疫磁珠（immune magnetic beads, IMB）和裁剪后得到的具有高親和力的適配體S1?3 為識(shí)別分子，搭建生物傳感器檢測(cè)致瀉性大腸桿菌O157:H7。IMB 識(shí)別靶標(biāo)上抗原區(qū)域和靶標(biāo)進(jìn)行特異性結(jié)合，形成IMB?靶標(biāo)復(fù)合物。當(dāng)在體系中進(jìn)一步加入適配體S1?3 后，靶標(biāo)上的適配體結(jié)合區(qū)域會(huì)進(jìn)一步被結(jié)合，從而形成IMB?靶標(biāo)-適配體三明治夾心復(fù)合物。當(dāng)加入不同濃度的靶標(biāo)時(shí)，復(fù)合物的形成比例也將不同，對(duì)其進(jìn)行qPCR 實(shí)驗(yàn)，根據(jù)其閾值周期數(shù)值（cycle thr?eshold value，Ct）變化即可對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行量化（圖1）。

圖1 抗體-適配體夾心法檢測(cè)大腸桿菌原理圖Fig. 1 Schematic diagram of antibody aptamer sandwich method for detecting Escherichia coli

1.2.2 適配體的裁剪 取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的大腸桿菌培養(yǎng)物1 mL 于6 000 r/min 4℃離心5 min 移去上清，使用BB 清洗3 遍，再使其重懸于1 mL BB 中。將合成的適配體溶解于BB 中（100 μmol/L）并稀釋至1μmol/L，95℃孵育10 min，冰上立即冷卻10 min 以使核酸變性，便于后續(xù)與靶標(biāo)的充分結(jié)合。取20 μL（1 μmol/L）適配體與180 μL 重懸在BB 中的大腸桿菌于25℃，200 r/min 孵育1 h 后，8 000 r/min 離心5 min，并用BB 漂洗5 次。將漂洗完成的菌體內(nèi)加入100 μL TE 緩沖溶液，95℃下孵育10 min，立即4℃ 12 000 r/min 離心15 min，將上清稀釋至合適倍數(shù)后做qPCR 擴(kuò)增模板。qPCR 反應(yīng)體系總體積為20 μL：0.6 μL FP 和RP，10 μL 2×Universal SYBR qPCR Mix，2 μL 模板Apt，去離子水6.8 μL。反應(yīng)體系在95℃下預(yù)變性10 min；95℃下變性10 s，在60℃下退火及延伸30 s，經(jīng)過(guò)39 個(gè)循環(huán)。設(shè)置陰性對(duì)照組為不加入適配體其他操作相同，利用其Ct 值得出適配體裁剪效果。

1.2.3 免疫磁珠的制備 本實(shí)驗(yàn)采用EDC/NHS 兩步法進(jìn)行IMB 的制備。取100 μL 磁珠（magnetic beads，MB）至離心管中，磁性分離去除上清液，用200 μL MEST 溶液進(jìn)行磁性分離洗滌2 次,然后移除上清液。迅速加入新鮮配制的100 μL EDC 溶液和100 μL NHS 溶液到裝有磁珠的離心管中，漩渦混勻使磁珠充分懸浮，25℃活化30 min，期間保持磁珠的懸浮狀態(tài)，200 μL 偶聯(lián)液反復(fù)洗滌3 次，磁分離去除上清；向其中加入40 μL 純化抗體置于搖床200 r/min 振蕩1 h，保持MB 處于單分子懸浮狀態(tài)；然后加入100 μL 封閉液孵育30 min，以封閉未反應(yīng)的活化基團(tuán)，磁分離洗滌3 次棄上清；最后加入200 μL PBS 緩沖液放于4℃冰箱備用。

1.2.4 抗體- 適配體夾心qPCR 法檢測(cè)大腸桿菌 制備完成IMB 后，加入不同濃度的培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌，室溫孵育1 h，使用BB 反復(fù)清洗磁珠3 次，以充分去除未結(jié)合的靶標(biāo)。向IMB中加入100 nmol/L 裁剪適配體充分反應(yīng)30 min，進(jìn)行3 次磁分離以去除未結(jié)合的融合適配體。qPCR反應(yīng)體系總體積為20 μL：0.6 μL FP 和RP，10 μL 2×Universal SYBR qPCR Mix，2 μL 制備完成的生物傳感器，去離子水6.8 μL。對(duì)擴(kuò)增曲線Ct 值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?？瞻讓?duì)照不添加靶標(biāo)物質(zhì)，其余操作與陽(yáng)性樣本同步進(jìn)行。除非特殊說(shuō)明，所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.2.5 條件優(yōu)化 由于生物傳感器是通過(guò)兩步反應(yīng)法完成，且為避免IMB?適配體偶聯(lián)，不改變?cè)荚O(shè)定IMB?靶標(biāo)和裁剪適配體孵育時(shí)間30 min，對(duì)IMB?靶標(biāo)孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，在30-60 min 內(nèi)改變反應(yīng)時(shí)間，測(cè)定其Ct 值變化，選取IMB?靶標(biāo)最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.6 檢測(cè)性能探究 在最佳條件下，對(duì)生物傳感器在純培養(yǎng)物中定量檢測(cè)大腸桿菌的性能進(jìn)行了探究。將濃度為106CFU/mL 的大腸桿菌進(jìn)行10 倍梯度稀釋，使用稀釋后的菌液進(jìn)行1.2.4 的操作，根據(jù)Ct 值和靶標(biāo)濃度之間的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用Ct值對(duì)靶標(biāo)濃度進(jìn)行量化。

1.2.7 特異性驗(yàn)證 為探究傳感器是否具有特異性，選取金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）、副溶血性弧菌、單增李斯特菌（屬間特異性驗(yàn)證）和大腸桿菌ATCC 25922、大腸桿菌ATCC 35218、大腸桿菌CICC 10389、大腸桿菌CICC 10663（種間特異性測(cè)試）作為非特異性靶標(biāo)，和大腸桿菌O157: H7進(jìn)行對(duì)比測(cè)試傳感器傳感能力。

1.2.8 實(shí)際樣品檢測(cè) 在實(shí)際檢測(cè)中，往往無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)單純培養(yǎng)基質(zhì)中大腸桿菌的研究，因此本實(shí)驗(yàn)探究了傳感器在食品基質(zhì)中的檢測(cè)性能。在最佳條件下，對(duì)生物傳感器在購(gòu)自華聯(lián)超市的金典純牛奶基質(zhì)中定量檢測(cè)大腸桿菌的性能進(jìn)行了探究。對(duì)牛奶中3×103、3×104、3×105CFU/mL 的大腸桿菌進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果

2.1 適配體裁剪

在對(duì)適配體S1 進(jìn)行截短前，首先對(duì)該適配體的親和力進(jìn)行評(píng)估。通過(guò)改變其與菌液結(jié)合的適配體的濃度和菌液濃度，評(píng)估其Ct 值變化。如圖2 所示，當(dāng)改變與靶標(biāo)結(jié)合適配體的濃度，從10 μmol/L 變?yōu)? μmol/L 時(shí)，其Ct 值呈現(xiàn)了10 倍梯度變化的趨勢(shì)（Ct：8.93-12.02）；當(dāng)改變菌液濃度，從約為108CFU/mL 變?yōu)?07CFU/mL，而不改變適配體濃度1 μmol/L 時(shí)，其Ct 值呈現(xiàn)了10 倍梯度變化的趨勢(shì)（Ct：12.02-14.96）。且由于適配體濃度在1 μmol/L 時(shí)，其梯度變化趨勢(shì)更為明顯，后續(xù)裁剪實(shí)驗(yàn)中均采用此濃度與靶標(biāo)結(jié)合。

圖2 適配體裁剪可行性分析Fig. 2 Feasibility analysis of adaptor clipping

確定適配體S1 具有可行性后，開始對(duì)其進(jìn)行裁剪。通過(guò)對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，其在接近5'端區(qū)域存在一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，推測(cè)核心序列位于該區(qū)域，因此首先裁剪得到接近5'端22 nt 的裁剪適配體S1?1，發(fā)現(xiàn)其和原適配體序列相比Ct 值從12.46下降至11.66，親和力有所上升（圖3?A）。雖然變化較小，但相比于原長(zhǎng)已經(jīng)減少了23 nt。第二步驗(yàn)證了減少的23 nt 序列的冗余。裁剪適配體S1?2 和原始適配體S1 相比，Ct 從12.46 變?yōu)榱?3.69（圖3?B），因此可得出結(jié)論減去接近5'端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)后的適配體S1?2 的親和力有所下降。第三步繼續(xù)對(duì)適配體S1 的中間部分進(jìn)行探究，保留11-30 位堿基即長(zhǎng)達(dá)20 nt 的序列S1?3，發(fā)現(xiàn)其和原始適配體相比Ct 值明顯下降，由12.46 下降至9.87，親和力大幅度提升，因此得到核心序列S1?3（圖3?C）。最后對(duì)S1?3 繼續(xù)進(jìn)行裁剪至12 nt 得到適配體S1?3?1，其Ct值為13.28，親和力明顯下降，推測(cè)由于序列太短導(dǎo)致其加上引物后占比過(guò)小從而失去和靶標(biāo)結(jié)合能力（圖3?D）。

2.2 免疫磁珠的表征

本實(shí)驗(yàn)對(duì)IMB 的制備結(jié)果進(jìn)行了動(dòng)態(tài)光散射表征，主要從粒徑變化和zeta 電位兩方面進(jìn)行評(píng)估。當(dāng)羧基磁珠與抗體分子經(jīng)過(guò)偶聯(lián)時(shí)，激活羧基官能團(tuán)并形成穩(wěn)定的NHS 酯中間體，形成穩(wěn)定的酰胺鍵，將抗體與羧基磁珠連接起來(lái)，由于羧基磁珠表面的羧基官能團(tuán)帶有負(fù)電荷，而抗原分子中的氨基官能團(tuán)是中性的，因此在偶聯(lián)過(guò)程中，抗原的連接會(huì)引入正電荷，導(dǎo)致電位點(diǎn)升高。如圖4?A 所示，MB 粒徑約為1 000 nm，與抗體偶聯(lián)后顯著增加至約1 271 nm，表明成功合成了IMB。同時(shí)zeta 電位值（圖4?B）表明，偶聯(lián)前后MB 表面上的電荷也發(fā)生了變化，再次驗(yàn)證IMB 的成功合成。

圖4 IMB 的表征Fig. 4 Characterization of IMB

2.3 可行性驗(yàn)證

當(dāng)生物傳感器分別加入IMB、靶標(biāo)和適配體后，生物傳感器出現(xiàn)較高響應(yīng)（圖5?A），當(dāng)菌液濃度在8×106CFU/mL 時(shí)，其Ct 值為7.27。當(dāng)向生物傳感器中加入IMB 和適配體時(shí)，傳感器出現(xiàn)較低響應(yīng)（Ct：18.85），推測(cè)由于體系中不存在任何菌細(xì)胞時(shí)，適配體和IMB 出現(xiàn)了非特異性結(jié)合從而出現(xiàn)了較低響應(yīng)。當(dāng)向生物傳感器中加入IMB 和靶標(biāo)時(shí)，生物傳感器未出現(xiàn)響應(yīng)，和預(yù)想一致。因此對(duì)8×106CFU/mL 菌液連續(xù)10 倍梯度稀釋4 次，測(cè)試其傳感能力，結(jié)果表明其梯度良好（圖5?B）。

圖5 生物傳感器可行性分析Fig. 5 Feasibility analysis for biosensor

2.4 條件優(yōu)化結(jié)果

在適配體裁剪過(guò)程中，對(duì)菌液清洗去除培養(yǎng)基時(shí)，將緩沖液由BB 分別替換為PBS、PBST、TE、SPSS。由圖6?A 可得，除PBS 的Ct 值15.45 接近BB 的Ct 值15.23 外，其余緩沖液結(jié)合效果均更差，因此緩沖液確定為BB 結(jié)合緩沖液。確定緩沖液類型后，改變緩沖液pH 為5.7、6.6、7.5 和8.4，由圖6?B 可得，適配體和靶標(biāo)在pH 為7.5 時(shí)結(jié)合效果最好，因?yàn)樵谥行原h(huán)境中適配體穩(wěn)定性更好。由圖6?C可得，孵育溫度在25℃時(shí)適配體和靶標(biāo)結(jié)合效果更好，因此選用更便于實(shí)驗(yàn)操作的25℃完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖6 條件優(yōu)化結(jié)果Fig. 6 Condition optimization results

在傳感過(guò)程中，IMB 和靶標(biāo)結(jié)合，由圖6?D 可得，在30-50 min 內(nèi)，Ct 值有所變化，當(dāng)50 min 以后，結(jié)合趨于飽和，Ct 值基本不再發(fā)生變化。為保證IMB 和靶標(biāo)充分結(jié)合，減少IMB 和適配體的偶聯(lián)，選取1 h 作為IMB?靶標(biāo)孵育時(shí)間。

2.5 靈敏度分析

為了確定生物傳感器的檢測(cè)限，將在培養(yǎng)條件下的菌液從8×106CFU/mL 連續(xù)10 倍梯度稀釋至8×103CFU/mL。由圖7 可得，隨著細(xì)菌細(xì)胞濃度的增加，Ct 值也成比例地降低。在（8×103）-（8×106）CFU/mL 范圍內(nèi)，存在良好的線性關(guān)系，線性方程為y=18.973 43-1.858 3LgC，回歸系數(shù)為0.999 74。其中y表示Ct 值，C 表示菌液濃度。通過(guò)該線性方程，可以計(jì)算出定量限為8×103CFU/mL，檢測(cè)限為800 CFU/mL。

圖7 靈敏度測(cè)定Fig. 7 Sensitivity measurement

2.6 特異性驗(yàn)證

首先檢測(cè)了裁剪適配體的特異性。由圖8?A 可以看到，當(dāng)加入相同濃度（100 nmol/L）的適配體時(shí)，靶標(biāo)菌和其他非特異性靶標(biāo)相比，具有較高響應(yīng)，Ct 值為9.44，而非特異性靶標(biāo)副溶血性弧菌（Ct：16.17）、金黃色葡萄球菌（Ct：15.00）、克羅諾菌屬（阪崎腸桿菌Ct：17.94）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Ct：18.14）和沙門氏菌（Ct：17.92）均與之有所差距。靶標(biāo)菌Ct 值和非靶標(biāo)菌之間存在顯著差異（P<0.05），證明該適配體具有良好的特異性。

圖8 大腸埃希菌 O157∶H7 檢測(cè)方法的特異性Fig. 8 Specificity of detection method for E. coli O157∶H7

其次檢測(cè)生物傳感器的特異性，向傳感器中加入不同靶標(biāo)測(cè)試其傳感能力。由于不同菌生長(zhǎng)情況不同，為盡可能地減小誤差，且更好展現(xiàn)出生物傳感器的特異性，靶標(biāo)濃度稀釋至8×104CFU/mL，其他均復(fù)蘇4 h 后使用。由圖8?B 可以看到，在屬間測(cè)試中，當(dāng)加入靶標(biāo)菌時(shí)，生物傳感器具有較高響應(yīng)，Ct 值為12.19，而非特異性靶標(biāo)金黃色葡萄球菌（Ct：24.79）、沙門氏菌（Ct：29.43）、克羅諾菌屬（阪崎腸桿菌Ct：34.22）、副溶血性弧菌（Ct：34.61）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Ct：35.06）均與靶標(biāo)有較大差距，靶標(biāo)菌Ct 值和非靶標(biāo)菌之間存在顯著差異（P<0.05）。由圖8?C 可以看到，在種間測(cè)試中，當(dāng)加入靶標(biāo)菌時(shí)，生物傳感器具有較高響應(yīng)，Ct 值為12.25，而非特異性靶標(biāo)大腸桿菌ATCC 25922（Ct：33.67）、大腸桿菌ATCC 35218（Ct：29.35）、大腸桿菌CICC 10389（Ct：29.81）、大腸桿菌CICC 10663（Ct：32.26）均與靶標(biāo)有較大差距，靶標(biāo)菌Ct 值和非靶標(biāo)菌之間存在顯著差異（P<0.05）。因此認(rèn)為該生物傳感器對(duì)大腸桿菌O157: H7 具有高度特異性。

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

由于生物傳感器最終目的是用于食品中大腸桿菌O157: H7 的檢測(cè)，因此有必要將生物傳感器應(yīng)用于人工污染的食品樣品中，對(duì)生物傳感器在食品中的檢測(cè)性能進(jìn)行驗(yàn)證。市面上的食品樣品被證實(shí)沒有可檢測(cè)到的病原體。在牛奶樣品中人工接種約108CFU /mL 的大腸桿菌O157: H7。接種4 h 后，通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)法測(cè)得實(shí)際細(xì)胞數(shù)約為3×107CFU/mL。連續(xù)10 倍梯度稀釋后選取細(xì)胞數(shù)為3×103、3×104、3×105CFU/mL 使用生物傳感器對(duì)其進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，測(cè)得其回收率分別為96.3%、103%、108%，RSD 分別為2.15%、2.07%、1.35%（表2）。

表2 實(shí)際樣品檢測(cè)Table 2 Actual sample testing

3 討論

大腸桿菌O157: H7 是最主要的致病菌之一，常與食源性疾病相關(guān)，每年都會(huì)引起疾病發(fā)生和甚至造成死亡，因此對(duì)其構(gòu)建檢測(cè)方法十分有必要。傳統(tǒng)常規(guī)培養(yǎng)法雖然準(zhǔn)確度高，但耗時(shí)耗力。因此近年來(lái)更為快速的基于抗原和抗體的特異性結(jié)合的免疫學(xué)技術(shù)備受青睞。辛思培等［16］建立了一種針對(duì)大腸桿菌O157: H7 的雙抗夾心化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，檢測(cè)限為2.5×104CFU/mL，雖然與傳統(tǒng)ELISA 方法相比有更好的特異性和靈敏度,但仍需擴(kuò)增培養(yǎng)10 h，同時(shí)單純的免疫學(xué)檢測(cè)方法易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果。核酸類的分子檢測(cè)方法是檢測(cè)大腸桿菌和其他食源性病菌的常用手段。除了單一技術(shù)的使用，研究者們也已經(jīng)嘗試將免疫學(xué)與分子學(xué)技術(shù)相結(jié)合，王淑娟等［17］開發(fā)了一種基于金屬有機(jī)骨架免疫磁珠富集結(jié)合多酶恒溫核酸快速擴(kuò)增的檢測(cè)大腸桿菌O157:H7 的方法，檢測(cè)限為1.18×105CFU/mL。

近年來(lái)生物傳感器技術(shù)在致病菌菌株檢測(cè)方面取得了巨大的進(jìn)步，并成為一種備受大眾認(rèn)可的通用分析工具［18］。樊凱等［19］開發(fā)了用于檢測(cè)食品中大腸桿菌O157:H7，通過(guò)測(cè)量HRP 酶催化之后的過(guò)氧化氫的氧化還原電流，來(lái)實(shí)現(xiàn)電化學(xué)免疫生物傳感器，能在（5.2×10）-（5.2×106） CFU/mL 的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)食品中大腸桿菌的檢測(cè)。以適配體作為識(shí)別原件，將生物識(shí)別事件轉(zhuǎn)化為可測(cè)量的物理或化學(xué)信號(hào)，信號(hào)檢測(cè)與處理系統(tǒng)則負(fù)責(zé)將信號(hào)轉(zhuǎn)化為可讀的結(jié)果的優(yōu)勢(shì)更為突出。

本文章利用免疫磁珠的捕獲作用和磁分離，并通過(guò)多克隆抗體和裁剪得到的適配體搭建生物傳感器。使用傳統(tǒng)的PCR 檢測(cè)由于取樣小，磁珠技術(shù)在檢測(cè)的過(guò)程中可以排除樣品基質(zhì)性質(zhì)的干擾，從而提高檢出率，縮短樣品中病原菌富集的時(shí)間［20］。在前人研究的基礎(chǔ)上，將45 nt 長(zhǎng)的適配體序列裁剪至20 nt，得到其核心序列。從核酸文庫(kù)中選擇的全長(zhǎng)適配體長(zhǎng)度一般約為80 nt，但發(fā)揮靶體接觸作用的區(qū)域通常為10-15 nt［21］。在某些條件下，非必需核苷酸的存在會(huì)干擾適配體與靶分子的結(jié)合。多余的和不必要的核苷酸被消除后會(huì)提高其親和力。當(dāng)在體系中進(jìn)一步加入適配體S1?3 后，靶標(biāo)上的適配體結(jié)合區(qū)域會(huì)進(jìn)一步被結(jié)合，從而形成IMB?靶標(biāo)-適配體三明治夾心復(fù)合物。加入不同濃度的靶標(biāo)時(shí)，復(fù)合物的形成比例也將不同，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，可以根據(jù)其Ct 值變化即可對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行量化，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌O157：H7 的定量檢測(cè)。將該生物傳感器引入紙基技術(shù)或微流控技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)高通量的樣品處理和便捷快速檢測(cè)，能夠進(jìn)一步縮短在實(shí)際應(yīng)用中的檢測(cè)時(shí)間。

4 結(jié)論

本文成功構(gòu)建了一種用于檢測(cè)大腸桿菌O157:H7 的抗體-適配體夾心生物傳感器。實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌O157: H7 在（8×103）-（8×106） CFU/mL 范圍內(nèi)的定量檢測(cè)，該檢測(cè)限為800 CFU/mL，該方法具有良好的特異性，操作簡(jiǎn)便成本低廉，可以在2 h內(nèi)完成檢測(cè)。