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    飼料中粗脂肪超聲提取快速測定方法的研究

    2024-01-12 13:25:38高志存余舒寧袁雪波萬彬彬崔惠娟
    畜牧與飼料科學(xué) 2023年6期
    關(guān)鍵詞:索氏粗脂肪濾紙

    高志存,高 蕓,余舒寧,袁雪波,王 薇,萬彬彬,崔惠娟

    (1.云南省紅河哈尼族彝族自治州動物疫病預(yù)防控制中心,云南 紅河哈尼族彝族自治州 661199;2.云南省紅河哈尼族彝族自治州農(nóng)民科技教育培訓(xùn)中心,云南 紅河哈尼族彝族自治州 661199;3.云南省紅河哈尼族彝族自治州動物衛(wèi)生監(jiān)督所,云南 紅河哈尼族彝族自治州 661199)

    粗脂肪是飼料中重要的組成成分之一, 是動物生長發(fā)育必需的營養(yǎng)物質(zhì)。 飼料中粗脂肪含量是衡量飼料質(zhì)量的重要指標(biāo)之一,因此,準(zhǔn)確測定飼料中粗脂肪含量, 對評價飼料質(zhì)量和指導(dǎo)飼料配方設(shè)計及優(yōu)化具有重要意義[1]。 目前,飼料中粗脂肪含量測定方法包括索氏提取法(油重法)、殘余法、濾袋法、快速溶劑萃取法等,但大多存在操作繁瑣、耗時長等問題,難以滿足大批量樣品檢測需求[2-8]。 超聲提取技術(shù)是將超聲換能器的振動在溶液中產(chǎn)生的空化等各種特殊作用, 用于待測樣本化學(xué)成分提取工藝中, 促使樣本中所含成分快速、高效率地溶入溶劑中的一項提取技術(shù),具有快速、高效、方便、提取率高等優(yōu)點[9]。 超聲提取技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中藥、食品、油脂等特定成分提取和檢測中, 但在飼料粗脂肪提取中的應(yīng)用尚無報道[10-17]。

    本文利用超聲波特有的高頻率以及超聲波在媒質(zhì)中高速傳播的工作原理, 將其首次應(yīng)用于飼料中粗脂肪的提取測定,以期建立一種能快速、簡便、準(zhǔn)確測定飼料中粗脂肪含量的方法,并分析比較超聲提取法和索氏提取法在測定飼料粗脂肪含量的差異,以期為實際檢測工作提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 飼料樣品來源

    飼料樣品共計14 種, 包括草魚膨化配合飼料、 仔豬前期配合飼料、 生長育肥豬前期配合飼料、生長育肥豬后期配合飼料、肉用仔雞前期配合飼料、肉用仔雞中期配合飼料、肉用仔雞后期配合飼料、產(chǎn)蛋雞育成前期配合飼料、產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋高峰期配合飼料、產(chǎn)蛋種雞配合飼料、仔豬濃縮飼料、熊飼料、玉米、豆粕,來源于云南省紅河哈尼族彝族自治州飼料生產(chǎn)企業(yè)和畜禽養(yǎng)殖場。 飼料樣品按《動物飼料 試樣的制備》(GB/T 20195—2006)用四分法縮減至500 g,粉碎后過40 目篩,混勻后裝入樣品瓶中備用。

    1.1.2 主要試劑耗材石油醚(沸程30~60 ℃),購自重慶川東化工(集團)有限公司;海砂(含量不少于99.8%),購自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;定性濾紙(12.5 cm),購自杭州新華紙業(yè)有限公司;高型稱樣瓶(40 mm×70 mm),購自福州北玻實驗儀器有限公司。

    1.1.3 主要儀器設(shè)備

    CSM-1 型旋風(fēng)式樣品磨, 購自北京一輕研究院有限公司;AG-204 型電子天平, 購自瑞士梅特勒公司;101C-IIB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱,購自上海實驗儀器廠有限公司;SZC-101 型脂肪測定儀,購自上海纖檢儀器有限公司;SK5200HP 型超聲波清洗器,購自上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司;超聲波脂肪快速測定儀(專利號:ZL 2021 2 1564314.6),筆者所在實驗室自行研發(fā)。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 超聲提取法

    精密稱?。?.000 0±0.000 5)g 飼料樣品和2 g海砂于定性濾紙上,疊成濾紙包,用鉛筆編號,裝入稱樣瓶中,放入103 ℃烘箱中干燥4 h,取出放入干燥器中冷卻至室溫,稱重后記為m1;將濾紙包轉(zhuǎn)移至超聲波脂肪快速測定儀的廣口瓶中, 按一定液料比(V/W)加入適量石油醚,進(jìn)行超聲波處理。 超聲提取結(jié)束后, 用30 mL 石油醚沖洗濾紙包,將濾紙包裝入相應(yīng)的稱樣瓶中,放入103 ℃烘箱中干燥1 h, 取出放入干燥器中冷卻至室溫,稱重后記為m2。

    結(jié)果計算:粗脂肪含量(%)=(m1-m2)/m×100;式中,m 為飼料樣品的質(zhì)量(g),m1為超聲提取前恒重的濾紙包+稱樣瓶質(zhì)量(g),m2為超聲提取后恒重的濾紙包+稱樣瓶質(zhì)量(g)。

    1.2.2 索氏提取法

    精密稱?。?.000 0±0.000 5)g 飼料樣品于定性濾紙上,疊成濾紙包,用鉛筆編號,放入103 ℃烘箱中干燥4 h,取出裝入濾紙筒架內(nèi),把濾紙筒放到脂肪測定儀中,置于回收位置;將鋁杯編號,放入103 ℃烘箱中干燥1 h,取出放入干燥器中冷卻至室溫,稱重后記為m1;在鋁杯中加入50 mL 石油醚,放入托架上,移入脂肪測定儀加熱板內(nèi),拉下壓桿,將濾紙筒移至浸泡位置,接通冷凝水;打開電源開關(guān),手握把下移,將試樣降至鋁杯底,55 ℃浸泡1 h; 將提把升至抽提位置,75 ℃抽提1 h;將提把升至回收位置,85 ℃回收15 min;回收完成后,將壓桿抬起,取出鋁杯,放入103 ℃烘箱中干燥1 h,移入干燥器中冷卻至室溫,稱重后記為m2。

    結(jié)果計算:粗脂肪含量(%)=(m2-m1)/m×100;式中,m 為飼料樣品的質(zhì)量(g),m1為恒重的空鋁杯質(zhì)量(g),m2為恒重的鋁杯+濾紙包質(zhì)量(g)。

    1.2.3 超聲提取工藝單因素試驗設(shè)計

    選擇草魚膨化配合飼料為試驗樣品, 設(shè)計單因素試驗, 考查分析各因素不同水平對粗脂肪含量測定的影響,單因素試驗設(shè)計見表1。 各影響因素各水平分別進(jìn)行獨立提取試驗, 且每個試驗分別設(shè)3 個平行樣, 結(jié)果取3 次試驗的平均值,用Origin 2019 軟件繪圖。

    1.2.4 正交試驗設(shè)計

    根據(jù)單因素試驗結(jié)果,以液料比、浸泡時間、超聲時間、超聲次數(shù)為研究對象,粗脂肪含量為考查指標(biāo),設(shè)計4 因素3 水平L9(34)正交試驗,優(yōu)化飼料粗脂肪超聲提取工藝, 各正交試驗均進(jìn)行2次平行重復(fù)試驗。 同時,利用Minitab 18 軟件對正交試驗結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析。

    1.2.5 最佳超聲提取工藝條件的試驗驗證

    按正交試驗優(yōu)化后的最佳條件, 測定草魚膨化配合飼料中粗脂肪含量, 并與索氏提取法測定結(jié)果進(jìn)行比較,重復(fù)6 次,取平均值。

    1.2.6 兩種提取方法的比較

    超聲提取工藝確定后, 分別采用此工藝條件和索氏提取法測定13 種飼料樣品中的粗脂肪含量,重復(fù)6 次,測定結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。利用SPSS 18 統(tǒng)計學(xué)軟件中配對樣本t 檢驗法對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗結(jié)果

    由圖1 可知,隨著液料比的增加,粗脂肪含量先逐漸增大后基本保持平穩(wěn)。當(dāng)液料比較低時,濾紙包不能完全浸泡在提取溶劑中, 濾紙包與提取溶劑接觸不充分,空化效應(yīng)弱,從而導(dǎo)致粗脂肪提取率低。液料比增加時,濾紙包與提取溶劑接觸充分,空化效應(yīng)增強,使粗脂肪提取率增加,因此,后續(xù)正交試驗液料比選擇25、37.5、50 mL/g。

    圖1 液料比對粗脂肪含量測定的影響

    由圖2 可知,隨浸泡時間的增加,粗脂肪含量略有增加,但差距不大。為了使浸泡時間考查覆蓋范圍更廣,所以后續(xù)正交試驗中浸泡時間選擇0、60、120 min。

    圖2 浸泡時間對粗脂肪含量測定的影響

    由圖3 可知,隨著超聲時間延長,粗脂肪含量呈先升高后保持平緩的趨勢,而超聲30、40、50 min時的粗脂肪含量測定結(jié)果基本一致, 為了考查超聲30 min 時是否為粗脂肪提取的拐點,所以后續(xù)正交試驗超聲時間選擇20、30、40 min。

    圖3 超聲時間對粗脂肪含量測定的影響

    由圖4 可知,隨著超聲次數(shù)增加,粗脂肪含量呈先升高后平緩的趨勢, 而超聲次數(shù)為2、3、4、5次時的粗脂肪含量測定結(jié)果基本一致, 為了考查超聲次數(shù)為2 時是否為拐點, 所以后續(xù)正交試驗中超聲次數(shù)選擇1、2、3 次。

    圖4 超聲次數(shù)對粗脂肪含量測定的影響

    通過單因素試驗分析各因素不同水平對粗脂肪含量測定的影響結(jié)果可設(shè)計正交試驗各因素水平,正交試驗因素水平設(shè)計見表2。

    表2 正交試驗因素水平設(shè)計

    2.2 正交試驗和方差分析結(jié)果

    由表3 和表4 可知, 各因素對飼料粗脂肪超聲提取影響大小依次為: 超聲次數(shù)>液料比>超聲時間>浸泡時間;超聲次數(shù)、液料比和超聲時間均對飼料粗脂肪超聲提取率具有極顯著(P<0.01)影響; 浸泡時間對飼料粗脂肪超聲提取率具有顯著(P<0.05)影響。

    表3 正交試驗結(jié)果及直觀分析結(jié)果

    表4 方差分析

    以k 值為依據(jù), 各影響因素中k 值最大的組合A3B3C3D3是最優(yōu)選擇。 但是, 比較A2B1C2D3和A3B1C3D2組合的檢測結(jié)果,二者相差不大,且在單因素試驗中, 可以看出浸泡時間對粗脂肪超聲提取影響不是很大,超聲30 min 和超聲40 min,超聲2 次和3 次的檢測結(jié)果相近。 故綜合考慮檢測成本、檢測時間、準(zhǔn)確性等因素,認(rèn)為飼料粗脂肪超聲提取的最佳工藝條件為:液料比37.5 mL/g,浸泡0 min,超聲時間30 min,超聲提取2 次。

    2.3 最佳超聲提取工藝條件的驗證

    按照“2.2”項下確定的超聲提取最佳工藝條件,重復(fù)測定6 次,飼料中粗脂肪含量測定結(jié)果分別為:4.72%、4.68%、4.75%、4.83%、4.79%、4.77%,平均值4.76%。 同時,采用索氏提取法測定同一飼料樣品粗脂肪含量,重復(fù)測定6 次,結(jié)果分別為:4.76%、4.77%、4.78%、4.77%、4.79%、4.74%, 平均值4.77%。 試驗證明該工藝穩(wěn)定且可行。

    2.4 超聲提取法和索氏提取法的比較

    分別采用超聲提取法和索氏提取法測定13種不同飼料樣品粗脂肪含量, 兩種方法測定結(jié)果基本一致, 符合 《飼料中粗脂肪的測定》(GB/T 6433—2006)中關(guān)于重復(fù)性的要求(≤0.25%),結(jié)果見表5。 由表6 可知,兩種方法測定飼料粗脂肪含量差異不顯著(P>0.05)。

    表5 超聲提取法和索氏提取法粗脂肪測定結(jié)果分析 單位:%

    表6 超聲提取法和索氏提取法的t 檢驗結(jié)果

    3 討論

    3.1 海砂的使用

    裝有飼料樣品的濾紙包, 放入廣口瓶超聲提取時,濾紙包漂浮在液面上,濾紙包與提取溶劑接觸不充分,直接影響到超聲提取效果。為解決這個難題,筆者進(jìn)行了多方摸索。將裝有飼料樣品的濾紙包和1 個直徑35 mm 的POM 球,裝于同一個塑料網(wǎng)兜中,在放入廣口瓶超聲提取時,濾紙包全部浸泡在提取溶劑中,濾紙包浮在液體中上部,超聲提取效果有所改善,但仍未達(dá)到預(yù)期目標(biāo),且易污染,操作不簡便。 受水分測定時海砂使用的啟發(fā),將飼料樣品和海砂混合,疊成濾紙包,放入廣口瓶超聲提取, 一方面濾紙包中的飼料樣品通透性增加,與提取溶劑接觸更充分,另一方面濾紙包沉于瓶底,不翻轉(zhuǎn)、不移動,更接近超聲波聲源,從而使超聲提取效果大大增強。

    3.2 濾紙包的稱量

    濾紙包經(jīng)溶劑超聲提取、 干燥后很容易吸潮,稱量過程中,在分析天平上很難平衡,讀數(shù)不準(zhǔn),會對實驗結(jié)果造成影響。本實驗將濾紙包放入40 mm×70 mm 規(guī)格的高型稱樣瓶中進(jìn)行稱量,很好地解決了濾紙包在分析天平上讀數(shù)不準(zhǔn)的問題。 稱樣瓶規(guī)格不宜過小,否則濾紙包不便放入稱樣瓶中,即使放入后,多次拿取也易造成濾紙包破損。

    3.3 超聲提取后沖洗濾紙包

    試驗過程中發(fā)現(xiàn),超聲提取結(jié)束后,直接將濾紙包裝入稱樣瓶中干燥稱重, 超聲提取法測得的粗脂肪含量值比索氏提取法測得值低。分析原因,是飼料中超聲提出的少量粗脂肪吸附在濾紙包上,必須進(jìn)行清洗。 超聲提取結(jié)束后,用適量石油醚沖洗濾紙包, 再將濾紙包裝入稱樣瓶中干燥稱重, 所測得的粗脂肪含量值與索氏提取法測得值接近。

    3.4 超聲波清洗器的選擇

    目前超聲提取方面的文獻(xiàn)大多對超聲功率、頻率進(jìn)行了優(yōu)化,最佳超聲功率多在250~540 W[18-27],而實驗室常用超聲波清洗器的功率大多在200 W、40~60 kHz,為確保研發(fā)的飼料中粗脂肪超聲提取快速測定方法可以用實驗室常用的儀器設(shè)備自行組配檢測, 在研發(fā)過程中就使用實驗室常用功率的超聲波清洗器進(jìn)行試驗。

    3.5 超聲提取法應(yīng)用范圍廣

    本實驗中, 選用脂肪含量高的草魚膨化配合飼料為試驗材料,進(jìn)行單因素和正交試驗,確定出超聲提取粗脂肪的最佳工藝條件。 再選用市場上常見的飼料原料(玉米、豆粕)及豬、雞等動物性飼料產(chǎn)品用超聲提取法測定粗脂肪含量, 并與索氏提取法進(jìn)行比較, 結(jié)果顯示超聲提取法和索氏提取法測定飼料粗脂肪含量差異不顯著 (P>0.05),表明本實驗研發(fā)的超聲提取法可用于飼料原料和常見動物性飼料產(chǎn)品的粗脂肪含量測定, 適用范圍廣。超聲提取法所用設(shè)備可用超聲波清洗器、廣口瓶、冷凝管(球形效果更好)自行組配,1 次可測30 余個樣品, 提取時間僅需1 h, 具有前處理簡便、準(zhǔn)確度高、速度快、成本低和溶劑損耗小等優(yōu)點,適用于大批量樣品的檢測。而脂肪測定儀采用的是索氏提取法,需要專門的儀器設(shè)備,該儀器結(jié)構(gòu)復(fù)雜,造價高,1 次只能測定6 個樣品,提取時間至少需2 h[8-9]。

    4 結(jié)論

    本研究首次將超聲提取技術(shù)應(yīng)用于飼料原料和常見動物性飼料產(chǎn)品粗脂肪含量測定中, 采用正交試驗優(yōu)化飼料粗脂肪超聲提取工藝, 其最佳提取工藝條件為液料比37.5 mL/g, 浸泡0 min,超聲時間30 min,超聲提取2 次。 研究表明,超聲提取法與脂肪測定儀索氏提取法相比,1 次可多測5倍飼料樣品,提取時間縮短1 半,成本低,測定結(jié)果差異不顯著(P>0.05),適用于大批量樣品的檢測。

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