基于16S rDNA 高通量測(cè)序方法檢測(cè)豬舍環(huán)境微生物群落多樣性

樊梅娜，張 修，王麗榮

（山東碧藍(lán)生物科技有限公司/山東省農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)創(chuàng)新中心，山東 泰安 271000）

我國是世界上最大的生豬生產(chǎn)和豬肉消費(fèi)國［1］，豬肉生產(chǎn)和消費(fèi)需求旺盛。 在當(dāng)前非洲豬瘟疫情防控背景下，如何保障生豬養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展成為亟須解決的重大問題［2］。2021 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部印發(fā)《非洲豬瘟等重大動(dòng)物疫病分區(qū)防控工作方案》，提出“推動(dòng)大區(qū)內(nèi)非洲豬瘟等重大動(dòng)物疫病無疫區(qū)、無疫小區(qū)和凈化示范場(chǎng)創(chuàng)建， 鼓勵(lì)連片建設(shè)無疫區(qū)，全面提升區(qū)域動(dòng)物疫病防控能力和水平”。作為非洲豬瘟疫情防控中的重要一環(huán)， 維持良好的豬舍環(huán)境能夠有效減少病原菌滋生和疫病傳播［3］，因此，系統(tǒng)研究豬舍環(huán)境微生物多樣性至關(guān)重要。

傳統(tǒng)豬舍環(huán)境微生物的研究多采用空氣沉降、菌落平板計(jì)數(shù)等方法［4］，這些方法檢測(cè)精準(zhǔn)度較低，往往只能進(jìn)行特定病原微生物的檢測(cè)，無法全面、 系統(tǒng)地反映豬舍環(huán)境微生物群落組成及多樣性，更無法滿足高通量的檢測(cè)需求［5-6］。 隨著高通量測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展， 其成功解決了傳統(tǒng)方法檢測(cè)通量低、操作復(fù)雜等問題，廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物的檢測(cè)當(dāng)中［7］。 本研究基于16S rDNA 高通量測(cè)序技術(shù)， 通過分析不同類型豬舍的環(huán)境微生物多樣性，了解豬舍環(huán)境微生物的多樣性、相對(duì)豐度及主要病原菌屬的特性， 為提升豬舍疫病綜合防控能力提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑

Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer、GeneJET 凝膠回收試劑盒， 美國Thermo Fisher Scientific 公 司 產(chǎn) 品；TruSeq DNA Nano Kit，美國Illumina 公司產(chǎn)品；PowerSoilRDNA Isolation Kit，美國MIBIO 公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器

SimpliAmp PCR 儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品；Microplate reader FLx800 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)，美國Bio-Tek 公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)豬舍的選取及基本情況

從山東省某農(nóng)業(yè)科技公司規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)選取保育豬舍（編號(hào)：BZ）、分娩豬舍（編號(hào)：RZ）和妊娠豬舍（編號(hào)：PM）3 種類型的豬舍，均為半封閉式結(jié)構(gòu)，東西走向，自然通風(fēng)為主，輔以機(jī)械通風(fēng)，南北墻上均裝有窗戶，西墻裝有風(fēng)機(jī)，東墻裝有濕簾。

保育豬舍共14 棟， 舍長(zhǎng)25 m， 寬10 m，高2.5 m，面積為250 m2，舍內(nèi)縱向有2 個(gè)飼養(yǎng)區(qū)，3個(gè)走道，共計(jì)24 個(gè)飼養(yǎng)單元，每單元安排15 頭4周齡左右的保育豬，共計(jì)360 頭。

分娩豬舍共8 棟， 舍長(zhǎng)30 m， 寬20 m，高2.5 m，面積為600 m2，舍內(nèi)縱向有4 個(gè)飼養(yǎng)區(qū)，5個(gè)走道，共有40 個(gè)飼養(yǎng)單元，每單元飼養(yǎng)1 頭分娩母豬以及10～15 頭15 日齡左右的哺乳仔豬。

妊娠豬舍共4 棟，舍長(zhǎng)50 m，寬16 m，高2.5 m，面積為800 m2，舍內(nèi)縱向有4 個(gè)飼養(yǎng)區(qū)，5 個(gè)走道，每列有65 個(gè)限位欄，共260 個(gè)限位欄，舍內(nèi)共飼養(yǎng)妊娠母豬240 頭左右。

1.2.2 豬舍日常飼養(yǎng)管理

保育豬舍每日定時(shí)喂料4 次，清理糞便1 次，飼喂顆粒飼料，適量人工添加；分娩豬舍每日定時(shí)投料3 次，清理糞便2 次，飼喂粉狀飼料并根據(jù)飼喂情況人工適量添加； 妊娠豬舍每日定時(shí)投料1次，清理糞便1 次，采用自動(dòng)料筒飼喂顆粒飼料。采樣期間保育豬舍、分娩豬舍、妊娠豬舍內(nèi)平均溫度分別為25、24、21 ℃， 相對(duì)濕度分別為54%、68%、50%。

1.2.3 樣品采集

采樣時(shí)間為2021 年8 月，采樣位置設(shè)在每個(gè)豬舍的中央距離地面60 cm 處， 采用空氣沉降法采樣，每種類型的豬舍選取3 棟豬舍采樣，共9 個(gè)樣 本（BZ1、BZ2、BZ3、PM1、PM2、PM3、RZ1、RZ2、RZ3）。 采樣時(shí)， 采樣人員與豬舍人員均遠(yuǎn)離培養(yǎng)皿，同時(shí)對(duì)采樣時(shí)間、溫度和濕度、光照以及風(fēng)速進(jìn)行記錄。 采樣完成后， 將培養(yǎng)皿裝入無菌封口袋，做好標(biāo)記，帶回實(shí)驗(yàn)室［8］。

圖1 97%相似度閾值下各樣品的稀釋性曲線

1.2.4 總DNA 提取與16S rDNA 高通量測(cè)序

采用PBS 緩沖液稀釋并溶解樣品，用Power-Soil DNA Isolation Kit 提取總DNA， 隨后送至山東開億基因科技有限公司，進(jìn)行16S rDNA 高通量測(cè)序操作。

1.2.5 測(cè)序結(jié)果分析

將低質(zhì)量測(cè)序序列排除， 在97%閾值下采用QIIME2 軟件將9 個(gè)樣品的有效序列聚類為不同操作分類單元（OTU），統(tǒng)計(jì)不同豬舍每個(gè)OTU 中的豐度信息。 計(jì)算α 多樣性指數(shù)， 包括Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、 譜系多樣性指數(shù)； 分析樣品β多樣性， 利用Bray curtis 算法比較不同類型豬舍間物種群落結(jié)構(gòu)差異。 利用QIIME2 軟件對(duì)豬舍環(huán)境樣品在門和屬分類水平上細(xì)菌群落的組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬舍環(huán)境樣品測(cè)序結(jié)果及稀釋曲線

在過濾掉低質(zhì)量序列后，9 個(gè)樣品的有效序列總數(shù)為948 595 個(gè)，平均測(cè)序讀長(zhǎng)在463～473 bp。在97%相似度閾值下將其聚類為不同OTU， 統(tǒng)計(jì)得到不同豬舍樣本在不同OTU 中的豐度信息。 9個(gè)樣品共產(chǎn)生29 126 個(gè)OTU（見表1），涵蓋了31門66 綱160 目320 科899 屬1 831 種的細(xì)菌。 9個(gè)樣品的稀釋曲線如圖1 所示， 隨著取樣數(shù)量的增加， 曲線已趨于平緩， 提示所采集樣品的OTU的覆蓋度已經(jīng)基本飽和，表明取樣深度合理。

表1 豬舍環(huán)境樣本的序列信息

2.2 豬舍環(huán)境樣品的微生物多樣性分析

2.2.1 α 多樣性分析

α 多 樣 性 指 數(shù) 包 含Chao1 指 數(shù)、Shannon 指數(shù)、譜系多樣性指數(shù)等，通過綜合分析OTU 豐度等信息反映物種多樣性信息。 由表1、表2 綜合分析可知，不同豬舍的物種多樣性存在差異，分娩豬舍以及保育豬舍的Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)及譜系多樣性指數(shù)整體高于妊娠豬舍。

表2 豬舍環(huán)境樣品微生物α 多樣性指數(shù)

2.2.2 β 多樣性分析

β 多樣性分析可以衡量樣品在菌群結(jié)構(gòu)多樣性方面的差異大小。Bray curtis 的計(jì)算結(jié)果將系統(tǒng)進(jìn)化距離的差異顯示在三維空間中， 可以作為β多樣性的參照。以不同豬舍環(huán)境微生物為樣品，對(duì)各樣品的距離矩陣進(jìn)行主成分分析， 得到β 多樣性的主坐標(biāo)分析（PCoA）結(jié)果，如圖2 所示，3 個(gè)類型豬舍空間距離相隔較遠(yuǎn)， 表明菌群結(jié)構(gòu)差異較大；與保育豬舍相比，妊娠豬舍和分娩豬舍各樣品之間菌群結(jié)構(gòu)差異較小。

圖2 不同類型豬舍環(huán)境樣品微生物β 多樣性的主坐標(biāo)分析（PCoA）圖

2.3 豬舍環(huán)境樣品微生物群落組成分析

2.3.1 細(xì)菌門分類水平的比較

如圖3 所示，變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteriota）為四大優(yōu)勢(shì)菌群，但在不同豬舍中相對(duì)豐度各有不同：妊娠豬舍中，變形菌門相對(duì)豐度最高，平均達(dá)到43%，厚壁菌門和放線菌門的平均相對(duì)豐度分別為32%和20%， 擬桿菌門平均相對(duì)豐度為4%；分娩豬舍中，變形菌門平均相對(duì)豐度達(dá)到93%，擬桿菌門、厚壁菌門和放線菌門平均相對(duì)豐度相差不大，分別為3%、2%、0.6%；保育豬舍中，變形菌門平均相對(duì)豐度為67%，厚壁菌門和擬桿菌門平均相對(duì)豐度分別為21%和9%，放線菌門平均相對(duì)豐度僅為1%。 結(jié)果表明，變形菌門在3 個(gè)類型的豬舍中相對(duì)豐度均最高， 厚壁菌門、 放線菌門以及擬桿菌門相對(duì)豐度在不同類型豬舍中差異較大。

圖3 不同類型豬舍環(huán)境樣品細(xì)菌門分類水平的比較

2.3.2 細(xì)菌屬分類水平的比較

如圖4 所示，9 個(gè)樣品共得到47 種細(xì)菌類群，其中，不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）和假單胞桿菌屬（Pseudomonas）在3 個(gè)類型的豬舍相對(duì)豐度均較高， 平均達(dá)5%以上； 寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas） 在保育豬舍中相對(duì)豐度最高，平均達(dá)到12%；棒桿菌屬（Corynebacterium）在妊娠豬舍中相對(duì)豐度最高，平均達(dá)到14%；叢毛單胞菌屬（Comamonas）和苯基單胞菌屬（Phenylobacterium）在分娩豬舍平均相對(duì)豐度都為10%，僅次于平均相對(duì)豐度為19%的不動(dòng)桿菌屬； 其余各菌屬相對(duì)豐度較低。

圖4 不同類型豬舍環(huán)境樣品細(xì)菌屬分類水平的比較

2.4 豬舍環(huán)境群落結(jié)構(gòu)的差異分析

為了探究不同豬舍環(huán)境樣本與微生物群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系， 本研究在31 個(gè)不同門類水平上，構(gòu)建了樣品聚類關(guān)系樹，并以熱圖（heatmap）的形式展現(xiàn)。如圖5 所示，放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門在分支上相近， 且大多為紅色或黃色方塊，進(jìn)一步表明這四個(gè)菌門豐度相對(duì)較高。

圖5 熱圖分析（門水平）

2.5 豬舍空氣中病原菌的分布

通過對(duì)豬舍環(huán)境空氣樣本進(jìn)行屬水平上的細(xì)菌多樣性分析發(fā)現(xiàn)（見圖4），采樣豬舍空氣中存在一些潛在的動(dòng)物致病菌屬， 主要包括假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、寡養(yǎng) 單 胞 菌 屬 （Stenotrophomonas）、 嚴(yán) 格 梭 菌（Clostridium_sensu_stricto_1）、 棒 桿 菌 屬（Corynebacterium）、 短 波 單 胞 菌 屬（Brevundimonas）、特呂佩爾菌屬（Trueperella）、創(chuàng)傷球菌屬（Helcococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、軍團(tuán)菌屬（Legionella）、沙雷菌屬（Serratia）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）。 上述動(dòng)物潛在致病菌的臨床意義見表3。

表3 豬舍環(huán)境微生物中潛在動(dòng)物病原菌的臨床意義

3 討論

目前，非洲豬瘟疫情防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻，該病對(duì)我國生豬養(yǎng)殖業(yè)的影響還在繼續(xù)。 本研究基于16S rDNA 高通量測(cè)序方法，系統(tǒng)分析了規(guī)?；i場(chǎng)不同類型豬舍環(huán)境微生物的多樣性， 基于97%的相似規(guī)律共得到OTU 29 126 個(gè)， 涵蓋了31 門66 綱160 目320 科899 屬1 831 種的細(xì)菌。 李紅梅等［23］利用16S rDNA 高通量測(cè)序方法研究了四川省大型規(guī)模化豬場(chǎng)環(huán)境微生物多樣性， 基于97%的相似規(guī)律共得到OTU 27 276 個(gè)， 有16 門115 科217 屬被鑒定， 本研究揭示的豬舍環(huán)境微生物多樣性更加豐富。

本研究樣品采集自規(guī)模化豬場(chǎng)3 種不同類型的豬舍， 樣品16S rDNA 高通量測(cè)序結(jié)果表明，不同類型豬舍的環(huán)境微生物多樣性存在差異， 分娩豬舍以及保育豬舍在微生物種類、系統(tǒng)進(jìn)化多樣性以及豐富程度上高于妊娠豬舍； 樣品群落組成分析也表明，厚壁菌門、放線菌門以及擬桿菌門的相對(duì)豐度在3 個(gè)類型的豬舍間差異較大， 這可能與養(yǎng)殖密度、豬只營養(yǎng)條件及腸道微生物組成［24-25］、舍內(nèi)空氣流通方式等多種因素相關(guān)。

具體到屬水平， 不同豬舍在菌群組成和結(jié)構(gòu)上也有所不同。本研究結(jié)果表明，寡養(yǎng)單胞菌屬在保育豬舍中相對(duì)豐度最高，平均達(dá)到12%。張鵬飛等［26］研究表明，該屬典型菌嗜麥芽窄食單胞菌可導(dǎo)致豬只出現(xiàn)呼吸困難、氣喘急促等癥狀；李超等［27］對(duì)豬舍環(huán)境微生物氣溶膠含量與構(gòu)成進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)， 該屬細(xì)菌在研究的5 個(gè)不同養(yǎng)豬環(huán)境中均能檢測(cè)到，含量高達(dá)45.5%～81.9%。 本研究結(jié)果表明，棒桿菌屬在妊娠豬舍中豐度可達(dá)14%。張永燦［28］研究表明，棒桿菌屬細(xì)菌存在于公豬包皮中，可通過配種感染妊娠母豬，嚴(yán)重影響豬只生長(zhǎng)速度和生產(chǎn)性能。本研究結(jié)果表明，分娩豬舍中不動(dòng)桿菌屬豐度最高。 邱立等［29］在研究陜西省某規(guī)?；i場(chǎng)仔豬腹瀉病原菌時(shí)分離到該菌屬內(nèi)的鮑曼不動(dòng)桿菌，該菌可寄生于仔豬體內(nèi)，感染后并不能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致長(zhǎng)期慢性感染。 上述3個(gè)屬的細(xì)菌均為條件致病菌， 在養(yǎng)殖環(huán)境惡化以及豬只營養(yǎng)不良、免疫力低下時(shí)可能會(huì)感染宿主，從而造成疫病暴發(fā)，養(yǎng)殖效益下降［30］。

本研究表明，豬舍環(huán)境微生物種類繁多，在發(fā)現(xiàn)的潛在動(dòng)物致病菌中，有些致病力比較強(qiáng)，如假單胞菌屬 （Pseudomonas）、 鏈球菌屬（Streptococcus）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）等，值得注意的是，軍團(tuán)菌屬（Legionella）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等的致病性在人上亦有報(bào)道［31-32］。 另有研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門中的大腸桿菌能傳播到距離豬舍100 m以外的居民住宅區(qū)和養(yǎng)殖場(chǎng)［33］。因此，規(guī)?；i場(chǎng)的養(yǎng)殖環(huán)境不僅影響動(dòng)物健康狀況， 而且也會(huì)對(duì)豬場(chǎng)工人和周邊居民的健康造成嚴(yán)重威脅。 研究豬舍環(huán)境微生物的組成、豐度以及病原菌差異，對(duì)于規(guī)模化豬場(chǎng)防止病原滋生、 阻斷疫病傳播方面具有重要作用。

4 結(jié)論

規(guī)模化豬場(chǎng)不同類型豬舍環(huán)境微生物多樣性豐富，變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和放線菌門為四大優(yōu)勢(shì)菌群。 分娩豬舍以及保育豬舍在細(xì)菌種類、 系統(tǒng)進(jìn)化多樣性以及豐富程度上高于妊娠豬舍。 研究發(fā)現(xiàn)的豬舍環(huán)境中潛在動(dòng)物致病菌屬為豬舍環(huán)境消毒的藥物選擇提供了依據(jù)。