蒙藥紅花清肝13 味丸治療CCl4 誘導小鼠腸道損傷的轉(zhuǎn)錄組測序分析研究

魏媛媛，紅 梅，王海生

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

腸道不僅發(fā)揮對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收功能，還對維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)起重要調(diào)節(jié)作用。 腸道黏膜屏障能夠阻止腸道內(nèi)致病菌、 外來抗原和內(nèi)毒素等的移位，防止機體受到侵襲，同時吸收機體所需的營養(yǎng)物質(zhì)［1-2］。 研究表明，缺血、缺氧、感染性疾病、缺血再灌注損傷、內(nèi)毒素水平增加、應激反應、膽汁、化學物質(zhì)、電離輻射、腸道微生態(tài)紊亂等均可引起腸道損傷［3-5］。

蒙藥紅花清肝13 味丸又名古日古木-13，由紅花、人工牛黃、麥冬、訶子、蓮子、銀朱、丁香、人工麝香、紫檀香、木香、川楝子、水牛角濃縮粉、梔子13 種藥材組成， 主要成分紅花具有活血化瘀、抗炎、抗氧化、止痛、鎮(zhèn)靜、清除氧自由基、調(diào)節(jié)血脂、保護腦組織、擴張小動脈、增加組織血流量、抗纖維化、保護神經(jīng)、改善機體微循環(huán)和提高免疫力等作用［6］。

筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)， 蒙藥紅花清肝13 味丸對肝損傷具有保護作用［7］。 炎癥、門靜脈高壓、 腸道微生物組成變化均可導致腸道通透性增加，致使內(nèi)毒素移位，引起肝臟中多種促炎基因和細胞因子的轉(zhuǎn)錄激活。由于腸道屏障受損，大量細菌及其代謝物如脂多糖（LPS）通過肝腸循環(huán)進入肝臟。蒙藥紅花清肝13 味丸經(jīng)肝腸軸進入體內(nèi)，是否能夠?qū)δc道損傷起到保護作用？該研究通過建立小鼠四氯化碳（CCl4）腸道損傷模型，利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，篩選CCl4引起小鼠腸道損傷及蒙藥紅花清肝13 味丸治療過程中涉及的重要信號通路及基因，以期為揭示紅花清肝13 味丸預防及治療腸道疾病的分子機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

6～8 周齡雄性C57BL/6 小鼠18 只，體重20～22 g，購自北京維生河實驗動物科技有限公司。 蒙藥紅花清肝13 味丸，購自內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院。 根據(jù)參考文獻［8］中的計算公式，小鼠給藥劑量根據(jù)該藥物的成人日劑量50 mg/（kg·BW）推算，確定為616.5 mg/（kg·BW）。 CCl4﹑橄欖油﹑PBS﹑生理鹽水購自上海阿拉丁公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 分組及處理

將18 只小鼠隨機分為3 組，每組6 只，分別為空白對照組、模型組和治療組?？瞻讓φ战M與模型組每天灌胃1 次生理鹽水，劑量為10mL/（kg·BW），連續(xù)7 d； 治療組小鼠每天灌胃1 次紅花清肝13味丸，劑量為616.5 mg/（kg·BW），連續(xù)14 d；最后一次灌胃4 h 后，對照組腹腔注射橄欖油，模型組和治療組腹腔注射CCl4橄欖油混合物（CCl4∶橄欖油=1∶4，V/V），劑量均為10 mL/（kg·BW）。 腸道損傷處理后第2 天， 將3 組小鼠用乙醚麻醉后安樂死（頸椎脫臼法）。 記錄所有小鼠體重并取十二指腸組織。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析

將十二指腸組織用RNase-free 水沖洗后吸干表面水分，放入液氮中速凍一段時間后置于-80 ℃冰箱中保存。 將組織樣品送諾禾致源公司進行全基因轉(zhuǎn)錄組測序。 RNA 提取及質(zhì)量檢測合格后，進行Illumina 測序。 對于有生物學重復的樣本，使用DESeq2 軟件（1.20.0）進行2 個比較組合之間的差異表達分析。采用clusterprofile 軟件對差異基因集進行KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。 KEGG 通路富集以padj小于0.05 作為顯著性富集的閾值。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠十二指腸組織的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

對小鼠十二指腸轉(zhuǎn)錄組測序， 差異表達基因聚類熱圖顯示（見圖1），空白對照組﹑模型組和治療組腸道組織均能較好地聚在一起，其中，治療組與空白對照組距離較近，而模型組與空白對照組距離較遠。差異表達基因柱狀圖及火山圖顯示，與空白對照組相比，模型組差異表達基因數(shù)量為1 419個， 其中， 上調(diào)表達基因744 個， 下調(diào)表達基因675 個（見圖2 及圖3A）；與空白對照組相比，治療組差異表達基因為2 875 個，其中，上調(diào)表達基因1 362 個， 下調(diào)表達基因1 513 個 （見圖2 及圖3B）；與模型組相比，治療組獲得了2 288 個差異表達基因，其中，上調(diào)表達基因1 139 個，下調(diào)表達基因1 149 個（見圖2 及圖3C）。

圖1 不同組別小鼠十二指腸組織差異表達基因聚類熱圖

圖2 不同組別小鼠十二指腸組織差異表達基因數(shù)量統(tǒng)計

圖3 差異表達基因火山圖

進一步對模型組差異表達基因進行KEGG 富集分析，發(fā)現(xiàn)B 細胞信號通路﹑破骨細胞分化信號通路﹑炎癥性腸病信號通路﹑趨化因子信號通路及JAK-STAT 信號通路等被激活（見圖4）。對治療組差異表達基因進行KEGG 富集分析， 發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路﹑FOXO 信號通路及長壽調(diào)節(jié)信號通路等被激活（見圖5）；破骨細胞分化信號通路﹑細胞凋亡信號通路等被抑制（見圖6）。

圖4 CCl4 損傷腸道后被激活的信號通路

圖5 紅花清肝13 味丸治療后被激活的信號通路

圖6 紅花清肝13 味丸治療后被抑制的信號通路

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與蒙藥紅花清肝13 味丸藥物靶點互交分析

為了尋找蒙藥紅花清肝13 味丸治療CCl4致腸道損傷中發(fā)揮重要作用的基因， 經(jīng)HERB 數(shù)據(jù)庫搜集紅花清肝13 味丸作用靶點基因，篩選出的靶點基因有143 個。對紅花清肝13 味丸治療后顯著差異表達基因進行生物信息學分析， 發(fā)現(xiàn)下調(diào)基因有155 個。 將分析得到的兩組基因群通過String 數(shù)據(jù)庫進行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）分析，結(jié)果如圖7、圖8 所示。 進一步對兩組關(guān)鍵蛋白互交分析， 得到藥物靶點基因和轉(zhuǎn)錄組靶點基因的共靶點基因，從中篩選出在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中表達量存在顯著差異的JUN﹑STAT1﹑NFKBIA、FOS 基因， 結(jié)果如圖9 所示。

圖7 紅花清肝13 味丸作用靶點基因

圖8 RNA-Seq 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖9 紅花清肝13 味丸作用靶點與轉(zhuǎn)錄組靶點互交分析結(jié)果

3 討論

腸道是機體重要的免疫系統(tǒng)之一， 人體免疫力與腸道密切相關(guān)。 腸道組織受損可引起多種疾病， 若不及時治療可能會引起機體多器官功能障礙［9］。 研究表明，蒙藥在腸道黏膜屏障損傷后的修復中有重要作用［10］。 目前蒙藥在臨床中的應用越來越廣泛，許多蒙藥能夠改善腸道菌群失調(diào)，增強腸道黏膜免疫屏障功能，減輕腸道炎癥反應，促進腸道黏膜損傷的修復［11］。 為了尋找更多的治療靶點，近年來腸道組學測序研究越來越受到關(guān)注。在一項黃水多糖對Caco-2 細胞腸道屏障損傷的保護作用機制研究中，經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，表達差異顯著的基因主要富集于MAPK﹑Toll 樣受體和NFκB 等信號通路［12］。在C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素致小鼠腸道損傷的轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)， 表達差異顯著的基因主要富集在TNF、IL-17、p53、FOXO、Toll樣受體和NF-κB 等信號通路［13］。

JAK-STAT 信號通路是真核細胞中重要的信號通路，當宿主發(fā)生細菌感染時，機體中IFN-γ 激活JAK，進一步磷酸化STAT1，活化的STAT1 轉(zhuǎn)移到細胞核中，促進多種靶基因的轉(zhuǎn)錄。 JAK-STAT信號通路參與抗炎作用， 阻止致病菌或內(nèi)毒素的入侵；同時也可以促進或加重機體炎癥反應［14-15］。

mTOR 信號通路受多種細胞信號的調(diào)控。 研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌可改善UC 小鼠的結(jié)腸損傷，增加腸道菌群的多樣性， 這可能與激活VIP/cAMP/PKA 信號通路、抑制mTOR 信號通路有關(guān)［16］。 研究表明， 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88 能夠激活mTOR信號通路， 而丁酸梭菌能夠通過介導mTOR 信號通路緩解產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88 感染IPEC-J2 細胞引起的炎癥反應， 并提高緊密連接蛋白的表達量，從而減輕細胞損傷［17］。

FOXO 信號通路的激活對腫瘤發(fā)生、 壽命調(diào)節(jié)、代謝調(diào)節(jié)等具有重要作用。 Cheng 等［18］利用黏膜蛋白質(zhì)組學技術(shù)和糞便微生物群移植方法研究了外源性微生物對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88 感染仔豬模型腸道功能的影響， 發(fā)現(xiàn)FOXO 信號通路顯著上調(diào)。 Zhang 等［19］研究表明，F(xiàn)OXO 信號通路主要參與模擬運輸應激誘導的鴨腸道損傷機制。

NF-κB 抑制因子α（NFKBIA）參與調(diào)節(jié)NFκB 信號通路， 靜息狀態(tài)下NFKBIA 位于細胞質(zhì)中， 當機體受到刺激時，NFKBIA 發(fā)生磷酸化，繼而使NF-κB 從三聚體中釋放出來并進入細胞核，調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄及炎癥因子的分泌。 改善腸道菌群的豐富度和組成比例， 可有效降低LPS 在腸道黏膜中的滲透， 使腸道組織中NF-κB 的表達水平下調(diào)，改善糖、脂代謝及炎性因子關(guān)鍵調(diào)控基因和調(diào)控蛋白的表達， 從而降低炎癥反應程度，同時可改善胰島素抵抗水平，最終調(diào)節(jié)機體物質(zhì)代謝和炎癥反應［20］。研究表明，CCl4可通過誘導MAPK/NF-κB 信號通路中相關(guān)基因的表達，促進炎癥發(fā)生發(fā)展［21］。 同時，CCl4可誘導JUN 表達上調(diào)［22］。

4 結(jié)論

篩選出了參與小鼠CCl4腸道損傷及蒙藥紅花清肝13 味丸治療過程的FOXO﹑mTOR﹑JAKSTAT 等重點信號通路和JUN﹑STAT1﹑NFKBIA、FOS 重點基因，為明晰紅花清肝13 味丸預防及治療腸道損傷的分子機制提供了參考。