UPLC-Q-Orbitrap HRMS法結合分子網(wǎng)絡分析吳茱萸湯的化學成分

摘要：采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術結合分子網(wǎng)絡，全面快速地分析和鑒定吳茱萸湯中的化學成分。使用Waters Acquity UPLC HSS T3型色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）進行色譜分離，離子源為HESI，在正、負離子模式下進行數(shù)據(jù)采集。隨后，將質譜數(shù)據(jù)導入GNPS平臺生成分子網(wǎng)絡對化合物進行分類，再將質譜數(shù)據(jù)導入Compound Discover 3.2軟件進一步對化合物進行鑒定。最終在吳茱萸湯中共鑒定出100個化合物，其中以黃酮類、生物堿類、有機酸類、萜類、糖類化合物為主，還有少量的苯丙素類、苯酚類、苷類化合物。其分析方法和結果對中藥復雜體系的成分表征具有借鑒價值。

關鍵詞：吳茱萸湯;高分辨質譜;分子網(wǎng)絡;成分表征

中圖分類號：R917.2

文獻標志碼：A

吳茱萸湯為經(jīng)典中醫(yī)方劑，配方以吳茱萸為主，生姜助之，人參、大棗為輔，四味藥為該方的君臣佐使^［1］，現(xiàn)代常用于治療偏頭痛、嘔吐、消化不良、高血壓、抑郁、心血管等疾病^［2-7］。目前，方中吳茱萸、生姜、人參和大棗各自的化學成分研究均已有報道^［3-7］，但關于吳茱萸湯整方的化學成分研究鮮有報道，為了闡明吳茱萸湯中的化學成分，有必要建立一種可靠有效的分析方法。

中藥的化學成分結構復雜、極性相差大且難揮發(fā)，用常規(guī)的分析方法較難實現(xiàn)對其化學成分的全面表征。超高效液相色譜四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜（UPLC-Q-Orbitrap HRMS）技術可以快速地分析出中藥復雜體系中化學成分的結構，現(xiàn)已被廣泛應用。

分子網(wǎng)絡在全球天然產(chǎn)物社會分子網(wǎng)絡（Global natural products social molecular networking， GNPS）數(shù)據(jù)庫平臺建立，依據(jù)結構相似的化合物能產(chǎn)生相似的碎片，通過算法獲得二級質譜的相似程度，按照相似程度的大小整合在可視化的網(wǎng)絡中，通過比較節(jié)點間二級質譜的異同，推導結構類似化合物^［8］。分子網(wǎng)絡策略在化學成分定性、定量表征及質量控制，指導活性化合物的分離、提取工藝的優(yōu)化以及疾病診斷和個性化治療等方面具有廣泛應用^［9］。因此，本研究采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術結合分子網(wǎng)絡，對吳茱萸湯的化學成分進行分析，為吳茱萸湯的藥效物質研究奠定基礎。

1 儀器與材料

Waters Acquity I-class UPLC系統(tǒng)（美國Waters公司），Q-Exactive^TM Orbitrap HRMS系統(tǒng)（美國Thermo Fisher Scientific公司），臺式離心機（ST8R型，美國Thermo Fisher Scientific公司），超聲波清洗器（SK250HP型，上?？茖С晝x器有限公司），萬分之一天平（XPE204型，瑞士Mettler-Toledo公司），甲酸（色譜級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），乙腈、甲醇（色譜級，德國默克公司），吳茱萸、生姜、人參、大棗，均購于北京同仁堂煙臺分店。

2 方 法

2.1 供試品溶液制備

將4味藥材（吳茱萸-生姜-人參-大棗，質量比1∶2∶1∶1）的粉末放入具塞錐形瓶中，加入10倍體積的75%甲醇，在室溫下超聲（240 W，25 Hz）30 min，離心（13 000 r/min，10 min），上清液過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2 色譜及質譜條件

2.2.1 色譜條件 采用Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相是體積分數(shù)為0.05%的甲酸水溶液（A相），乙腈∶甲醇（4∶1）（B相），流速0.4 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量2 μL，梯度洗脫條件：0～2 min，4% B;2～8 min，4%→10% B;8～12 min，10%→20% B;12～18 min，20%→30% B;18～25 min，30% B→50% B;25～32 min，50% B→70% B;30～35 min，70% B→90% B;35～38 min，90% B。

2.2.2 質譜條件 采用加熱型電噴霧離子源（HESI），掃描方式為Full MS/dd-MS²（Top 5），正負離子模式分別進行，分辨率為70 000 FWHM（Full MS）、17 500 FWHM（dd-MS²），掃描范圍80～1200 m/z，噴霧電壓+3.8 /-2.8 kV，鞘氣流速35 arbs，輔助氣流速10 arbs，毛細管溫度325 ℃，離子源溫度350 ℃，歸一化碰撞能量：20、40、60 eV。

2.3 數(shù)據(jù)分析

2.3.1 分子網(wǎng)絡 將采集到的質譜數(shù)據(jù)先進行格式轉換，隨后臺進行數(shù)據(jù)處理后上傳至GPNS數(shù)據(jù)庫平臺。將處理后的結果上傳至Cytoscape軟件上進行可視化，對比相關節(jié)點相似程度，對其進行分類，推測出與已知化合物結構相似的類似物或其他未知物。

2.3.2 化合物鑒定 將UPLC-Q-Orbitrap HRMS采集的原始數(shù)據(jù)導入Compound Discover 3.2軟件進行初步分析，定制相應的工作流程，結合mzCloud、mzVault、Chemspider數(shù)據(jù)庫進行碎片匹配，設置化合物匹配打分大于80，相對分子質量理論值和實際值誤差在5×10^-6以內(nèi)為條件，篩選出吳茱萸湯中存在的化合物。

3 結 果

3.1 吳茱萸湯分子網(wǎng)絡分析

分子網(wǎng)絡可以依據(jù)化合物的二級質譜，將同類化合物聚集成簇，從而將吳茱萸湯中的成分類別清晰展現(xiàn)。因此，本研究首先按照“2.2”項下的色譜和質譜條件對吳茱萸湯提取物進行分析，采集其在正、負離子模式下的基峰色譜圖（圖1）。

將采集到的數(shù)據(jù)導入GPNS平臺，再經(jīng)Cytoscape軟件處理，得到其分子網(wǎng)絡（圖2）。其中，每個節(jié)點代表1個化合物，不同顏色節(jié)點分別代表不同化合物類別，灰色代表未知化合物，節(jié)點之間連線表示2個化合物具有相似的碎片離子，距離越近代表碎片離子相似性越高，同一類化合物分子會在一個分子網(wǎng)絡中聚集成簇^［10］。最后對每個節(jié)點的保留時間、精確相對分子質量以及二級碎片進行分析，確定了六類化合物，包括糖類、萜類、生物堿類、黃酮類、有機酸類和苯酚類。

正離子模式下主要得到萜類化合物簇，從中解析了一系列萜類化合物。以m/z 605.439 2、785.503 5、471.201 2三個化合物為例，通過對比其精確相對分子質量和保留時間，以及吳茱萸湯質譜分析提取到的化合物的二級碎片信息，推斷m/z 605.439 2為人參皂苷Rk2， m/z 785.503 5為人參皂苷Rg3，m/z 471.201 2為檸檬苦素。其中人參皂苷Rk2與人參皂苷Rg3的母核結構均為人參三醇，僅僅在側鏈以及與苷元相連的糖上有細小差別，因此二者在分子網(wǎng)絡中的位置十分接近;而檸檬苦素屬于三萜衍生物，在結構上與前兩者差別較大，被聚集到相距較遠的萜類簇中。由此可知，分子網(wǎng)絡對于識別同類化合物在結構上的差異具有高靈敏度的特點。

負離子模式下主要得到糖類化合物簇，從中解析了一系列糖類化合物。以m/z 341.096 0、281.095 0、341.116 2三個化合物為例，結合保留時間與質譜數(shù)據(jù)，推斷其分別為海藻糖、木二塘、纖維二糖。對它們的結構進行對比分析，發(fā)現(xiàn)其均為兩個單糖分子組成的二糖，結構相似，因此它們在分子網(wǎng)絡中的位置十分接近。此外，黃酮類化合物在分子網(wǎng)絡中也聚集成簇，簇中心的m/z 609.189 3被推斷為新橙皮苷，含有C6-C3-C6的基本結構。

3.2 化合物鑒定

在分子網(wǎng)絡的分類結果指導下，進一步通過Compound Discover 3.2對質譜數(shù)據(jù)進行分析，最終從吳茱萸湯中鑒定出共計100個化合物∶黃酮類33個、生物堿類22個、萜類9個、有機酸類21個、糖類6個、苯丙素類4個、苯酚類3個、苷類2個，結果見表1。

3.3 化合物裂解規(guī)律分析

3.3.1 黃酮類化合物裂解途徑分析 結合二級質譜圖，共鑒別出黃酮類化合物33個，以生姜的主要活性成分6-姜酚（圖3）和四味藥材中的共有成分蘆丁（圖4）兩個化合物為例，對其裂解途徑進行分析。

6-姜酚的分子式為C₁₇H₂₆O₄，正離子模式下，得到m/z 295.168 5的準分子離子［C₁₇H₂₆O₄］⁺，二級質譜中的碎片離子主要有m/z 179.069 8，m/z "177.090 6，m/z 145.064 6，m/z 137.059 5。結合文獻^［11］，推測6-姜酚有三種裂解方式：第一種，碰撞誘導解離，失去一個—CH₃和一個—C₈H₁₅O₂形成m/z 137.059 5的碎片離子［C₈H₉O₂］⁺;第二種，失去一個—C₇H₁₆O形成m/z 179.069 8的碎片離子［C₁₀H₁₁O₃］⁺;第三種，先失去一個—C₆H₁₄O₂形成m/z 177.090 6的碎片離子［C₁₁H₁₃O₂］⁺，隨后失去一個—CH₃O形成m/z 145.064 6的碎片離子［C₁₀H₉O］⁺，裂解過程見圖3。

蘆丁的分子式為C₂₇H₃₀O₁₆，負離子模式下，得到m/z 609.153 1的準分子離子［C₂₇H₂₉O₁₆］^-，在二級質譜中的碎片離子主要有m/z 301.034 2，m/z 151.002 6。結合一級、二級質譜與文獻^［12-13］，推測蘆丁經(jīng)過碰撞誘導解離，失去一個—C₁₂H₂₀O₉形成m/z 301.034 2的碎片離子［C₁₅H₉O₇］^-。隨后通過逆狄爾斯-阿爾德裂解，失去一個—C₈H₅O₃形成m/z 151.002 6的特征碎片［C₇H₃O₄］^-，裂解途徑見圖4。

3.3.2 生物堿類化合物裂解途徑分析 結合二級質譜圖，共鑒別出生物堿類化合物22個，以吳茱萸的主要活性成分吳茱萸堿（圖5）為例，對其裂解途徑進行分析。

吳茱萸堿的分子式為C₁₉H₁₇N₃O，正離子模式下，得到m/z 304.146 9的準分子離子［C₁₉H₁₈N₃O］⁺。二級質譜中的離子碎片主要有m/z" 171.091 5，m/z 161.070 7，m/z 144.080 8，m/z 134.059 9，推測吳茱萸堿有兩種裂解方式：第一種，在碰撞誘導解離后被裂解為兩部分，形成m/z 134.059 9的［C₈H₈NO］⁺和m/z 171.091 5的［C₁₁H₁₁N₂］⁺的產(chǎn)物離子;第二種，斷裂后形成m/z 161.070 7的［C₉H₉N₂O］⁺和m/z 144.080 8的［C₁₀H₁₀N］⁺的產(chǎn)物離子，這與文獻報道一致^［14-16］，裂解過程見圖5。

3.3.3 萜類化合物裂解途徑分析 結合二級質譜圖，共鑒定出萜類化合物9個，在此以人參中的代表成分人參皂苷Rg2（圖6）為例，對其裂解途徑進行分析。

人參皂苷Rg2屬于原人參三醇型人參皂苷，分子式為C₄₂H₇₂O₁₃，在負離子模式下，得到m/z783.494 9的準分子離子［C₄₂H₇₁O₁₃］^-。在二級質譜中的碎片離子主要有m/z 637.431 5，m/z 475.381 0。結合文獻^［17-18］，推測人參皂苷Rg2裂解方式為—C₆H₁₀O₄、—C₆H₁₀O₅的葡萄糖殘基分步中性丟失，分別生成m/z "637.431 5［C₃₆H₆₁O₉］^-和m/z 475.381 9的特征碎片［C₃₀H₅₁O₄］^-。具體裂解過程見圖6。

4 討 論

本研究在優(yōu)化色譜條件時，分類考察了三種有機相種類：甲醇、乙腈、乙腈∶甲醇（4∶1），最終發(fā)現(xiàn)有機相為乙腈∶甲醇（4∶1）時的色譜峰形與出峰時間較好;此外，發(fā)現(xiàn)在基峰色譜圖中2～8 min時間段內(nèi)出峰密集，因此需要適當?shù)胤啪徧荻鹊淖兓?最后，還在流動相中加入體積分數(shù)為0.05%的甲酸溶液改善峰形。在優(yōu)化質譜條件時，考察了歸一化碰撞能量，文獻中常用15、30、45 eV，但在這個能量下，吳茱萸湯成分的二級質譜碎片并不豐富，鑒定出的化合物種類也較少，因此，將其適當加大到20、40、60 eV，成功地鑒定出更多種類的化合物。

由于糖類化合物結構相似，難以分辨，而分子網(wǎng)絡可以根據(jù)結構的相似性將化合物聚集成簇，本研究利用分子網(wǎng)絡首次發(fā)現(xiàn)吳茱萸湯的分子網(wǎng)絡中集聚了大量糖類化合物，對吳茱萸湯中糖類化合物的分析具有指導意義。此外，該技術對吳茱萸湯中的生物堿類、黃酮類、萜類、苯酚類等化合物信息的收集也比較全面。

5 小 結

采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術結合分子網(wǎng)絡，對吳茱萸湯的化學成分進行系統(tǒng)分析，成功鑒定出該方中的100個化合物組分，其中包括：黃酮類33個、生物堿類22個、有機酸類21個、萜類9個、糖類6個、苯丙素類4個、苯酚類3個和苷類2個，為闡明其藥效物質基礎提供了依據(jù)。

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Analysis of Chemical Constituents of Wu-Zhu-Yu Decoction by UPLC-Q-Orbitrap HRMS Method Combined with Molecular Network

CHI Chenglin， LI Caihong， LI Wenjing， LI Zongchao， LIU Rongxia

（School of Pharmacy， Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation（Yantai University）， Ministry of Education， Collaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of Shandong， Yantai University， Yantai 264005， China）

Abstract：The ultra performance liquid chromatography-quadrupole-electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry （UPLC-Q-Orbitrap HRMS） technique combined with molecular network is used for the comprehensive and rapid analysis and identification of the chemical components in Wu-Zhu-Yu decoction. Waters Acquity UPLC HSS T3 column （150 mm×2.1 mm， 1.8 μm） is performed for chromatographic separation. Heated electrospray ionization source （HESI） is applied for data acquisition in positive and negative ion modes. The acquired mass spectrometry data are imported into the GNPS platform to generate a molecular network. Meanwhile the data are imported into Compound Discover 3.2 software for further compound identification. In this research， the components of Wu-Zhu-Yu decoction are quickly classified and a total of 100 compounds are finally identified in Wu-Zhu-Yu decoction， including flavonoids， alkaloids， organic acids， terpenoids， sugars， phenylpropanoids， phenols， and glycosides. In this study， molecular network combined with HRMS technique is utilized for the rapid classification and characterization of the chemical components of Wu-Zhu-Yu decoction， which is valuable for the characterization of complex systems of Traditional Chinese Medicine.

Keywords： Wu-Zhu-Yu decoction; high-resolution mass spectrometry; molecular network; component characterization

（責任編輯 周雪瑩）