表達(dá)抗PD-1抗體的溶瘤病毒在結(jié)腸癌腹腔移植瘤模型中的抗腫瘤作用

摘要：為了研究表達(dá)小鼠抗PD-1抗體（VT1093M）的溶瘤病毒對結(jié)腸癌腹腔移植瘤模型的抗腫瘤作用，利用BALB/c小鼠成瘤的小鼠結(jié)腸癌CT26-luc細(xì)胞株建立了結(jié)腸癌腹腔移植瘤模型。接種后第8天進(jìn)行分組，設(shè)置生理鹽水（normal saline，NS）組、病毒VT09X組和VT1093M組，每組5只，注射劑量為2.5×10⁷ pfu/250 μL，NS注射250 μL，每隔一天注射一次，共注射5次。末次注射后6 d，脫頸處死小鼠，提取外周血中CD45⁺細(xì)胞和腹水細(xì)胞，進(jìn)行體外殺傷實(shí)驗(yàn)。治療組初次出現(xiàn)熒光消失后第13天，進(jìn)行再挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，造模實(shí)驗(yàn)確定最佳接種條件為200 μL的2.5×10⁶ 個(gè)/mL細(xì)胞懸液；藥效實(shí)驗(yàn)中，VT09X組和VT1093M組較NS組具有明顯的腫瘤抑制效果，VT1093M組治療期間出現(xiàn)腫瘤消失情況，較VT09X組抑瘤效果明顯，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；再挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)中，VT1093M組均未出現(xiàn)腫瘤再次生長；在體外殺傷實(shí)驗(yàn)中，注射病毒組的外周血CD45⁺細(xì)胞在靶效比為1∶40時(shí)對CT26-luc殺傷效果明顯，對4T1細(xì)胞，各組殺傷效果較差。因此，重組溶瘤病毒VT1093M在結(jié)腸癌腹腔轉(zhuǎn)移瘤模型中具有顯著的抗腫瘤作用，且能激發(fā)小鼠產(chǎn)生較為持久的特異性免疫反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：結(jié)腸癌；腹腔移植瘤；溶瘤病毒；生物發(fā)光；特異性免疫

中圖分類號：R735.3+5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

結(jié)腸癌占全球所有癌癥的10.2%，是世界上發(fā)病率排名第三、死亡率第二高的惡性腫瘤^［1］。結(jié)腸癌晚期常出現(xiàn)腹腔轉(zhuǎn)移，在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者中腹膜轉(zhuǎn)移發(fā)生率高達(dá)25% ～ 30%^［2-3］，國內(nèi)已有關(guān)于應(yīng)用GFP/luc標(biāo)記技術(shù)建立胃癌、肝癌等動物模型的報(bào)道^［4-5］，且目前的研究多集中于結(jié)直腸癌皮下移植瘤模型或原位模型，針對于結(jié)腸癌晚期轉(zhuǎn)移的研究較少^［6-7］。本研究利用小鼠結(jié)腸癌腹腔移植瘤模擬結(jié)腸癌晚期腹腔轉(zhuǎn)移后腹腔內(nèi)多發(fā)腫瘤以及產(chǎn)生血性腹水的癥狀。

完全根治性手術(shù)切除是延長結(jié)腸癌患者生存時(shí)間的主要方式，但由于轉(zhuǎn)移以及腫瘤分期不同，導(dǎo)致單一手術(shù)治療的效果并不理想^［9］。術(shù)前放療或化療也對轉(zhuǎn)移性疾病或總生存期沒有很大影響^［10］。因此，研究更加有效的治療策略勢在必行。溶瘤病毒選擇性地感染并在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞裂解，并且可以作為載體攜帶外源基因進(jìn)入腫瘤，從而改變腫瘤微環(huán)境^［11］。臨床前研究表明溶瘤病毒通過多種系統(tǒng)運(yùn)作，包括腫瘤環(huán)境的突變和免疫效應(yīng)分子活性的復(fù)合變化，從而將腫瘤環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤環(huán)境^［12］。有研究表明表達(dá)小鼠抗PD-1抗體的溶瘤病毒小鼠在CT26結(jié)腸癌皮下模型中顯示出顯著的抗腫瘤作用^［13］。本研究摸索生物熒光標(biāo)記的小鼠結(jié)腸癌腹腔移植瘤造模條件，探究表達(dá)小鼠抗PD-1抗體（VT1093M）的溶瘤病毒在CT26-luc結(jié)腸癌腹腔移植瘤模型上的抗腫瘤作用。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞-熒光素酶標(biāo)記，CT26-luc，購自上海南方模式生物科技股份有限公司；小鼠乳腺癌細(xì)胞，4T1，購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 試劑

CFSE試劑盒、PI染料均購自美國Thermo Fisher公司，CD45（TIL）Microbeads、Dead Cell Removal Kit均購自德國美天旎公司，IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt Bioluminescent Substrate購自珀金埃爾默股份有限公司。

1.3 病毒

VT09X，以野生型單純皰疹病毒1型（HSV1）病毒株為基礎(chǔ)，通過同源重組刪除了基因組中γ34.5基因和α47基因的拷貝。VT1093M，以VT09X為載體構(gòu)建的表達(dá)小鼠抗PD-1抗體的重組溶瘤病毒。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級健康5～6周雌性BALB/c小鼠，體重18～20 g，購自濟(jì)南朋悅動物繁殖有限公司。所有動物實(shí)驗(yàn)方案操作均遵守《煙臺大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物使用管理規(guī)范》。

1.5 儀器

磁場（德國美天旎），小動物活體成像系統(tǒng)（珀金埃爾默），F(xiàn)ACSCelesta流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

2 方 法

2.1 細(xì)胞體外發(fā)光效率檢測

CT26-luc細(xì)胞培養(yǎng)在含有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，收集指數(shù)生長期的細(xì)胞，將細(xì)胞數(shù)按照0、31 250、62 500、125 000、250 000、500 000，1 000 000個(gè)/孔分別接種到96孔黑板中，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μL D-Luciferin使其終濃度為150 μg/mL，另設(shè)置只有細(xì)胞不加D-Luciferin的對照組。暗室反應(yīng)5～10 min用活體成像系統(tǒng)檢測，分析發(fā)光強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)之間的相關(guān)性。

2.2 結(jié)腸癌腹腔移植瘤造模實(shí)驗(yàn)

收集生長旺盛的CT26-luc細(xì)胞，離心，計(jì)數(shù)，用PBS或不含血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，置于冰上備用。設(shè)置四個(gè)造模條件：分別接種200 μL的5×10⁶ 個(gè)/mL細(xì)胞懸液，400 μL的2.5×10⁶ 個(gè)/mL細(xì)胞懸液，200 μL的2.5×10⁶ 個(gè)/mL細(xì)胞懸液和400 μL的1.25×10⁶ 個(gè)/mL細(xì)胞懸液，消毒小鼠左下腹壁，將細(xì)胞懸液注射入左下腹腔。在接瘤第4天開始通過動物活體成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察，隔天測量一次小鼠腹腔的腫瘤熒光變化和體重變化，待小鼠腰圍發(fā)生變化后記錄小鼠腰圍。在實(shí)驗(yàn)過程中注意觀察小鼠的生理狀況，包括攝食，飲水，排泄情況，豎毛情況和荷瘤小鼠活動性等異?，F(xiàn)象。

2.3 溶瘤病毒在腹腔CT26-luc結(jié)腸癌腹腔移植瘤模型中的藥效評價(jià)

參照“2.2”結(jié)果，確定CT26-luc細(xì)胞接種濃度建立結(jié)腸癌晚期轉(zhuǎn)移模型，將CT26-luc細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中重懸，腹腔注射200 μL的2.5×10⁶ 個(gè)/mL細(xì)胞懸液，接瘤后待體內(nèi)光子通量值達(dá)到1×10⁹ p/s以上，將小鼠隨機(jī)分為3組（n = 5），分組當(dāng)天記作治療第1天。所用溶瘤病毒通過空斑法測定滴度為2×10⁸ pfu/mL，參照實(shí)驗(yàn)室前期動物實(shí)驗(yàn)中針對病毒的安全性和有效性評估，確定注射體積為250 μL/只，腹腔注射時(shí)一次進(jìn)針，分3～4點(diǎn)進(jìn)行注射，盡可能地使溶瘤病毒能夠均勻地分布到腹腔中。具體治療方案如表1，每隔一天用動物活體成像系統(tǒng)觀察小鼠腹腔熒光變化。在注射病毒組初次出現(xiàn)熒光消失后第13天，進(jìn)行再挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)，腹腔注射200 μL的2.5×10⁶ 個(gè)/mL細(xì)胞懸液，并記錄熒光變化情況。

2.4 小鼠外周血CD45⁺細(xì)胞及腹水對腫瘤細(xì)胞殺傷作用的檢測

末次注射病毒后6 d處死小鼠，取外周血和腹水，再利用磁珠分離小鼠外周血中的CD45⁺細(xì)胞，并計(jì)數(shù)。為檢測小鼠外周血CD45⁺細(xì)胞和腹水細(xì)胞是否會對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性殺傷，選取CT26-luc和4T1細(xì)胞為靶細(xì)胞，以相同種屬的腫瘤細(xì)胞4T1為對照靶細(xì)胞，確定靶效比為1∶10和1∶40，用CFSE對靶細(xì)胞進(jìn)行預(yù)先染色，隨后根據(jù)不同的效靶比在24孔板中加入適量的CD45⁺細(xì)胞懸液，每個(gè)比例做3個(gè)平行對照。再加入1 mL 1640完全培養(yǎng)基，搖勻后放入37 ℃，5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。將細(xì)胞消化后，加入適量1640完全培養(yǎng)基，1500 r/min離心5 min，加入200 μL PBS重懸，向其中加入2.5 μL PI染料，加入后反應(yīng)40 s上機(jī)檢測。殺傷效率 = CFSE+/PI⁺÷（CFSE⁺/PI⁺+CFSE⁺/PI^-）×100%。

2.5 數(shù)據(jù)處理

以GraphPad Prism 9.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所得數(shù)據(jù)以 ± s表示。數(shù)據(jù)分析采用雙尾、非配對T檢驗(yàn)或雙因素方差分析，用Kaplan-Meier生存曲線評價(jià)動物存活率，用Mantel-Cox檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P lt; 0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 鑒定CT26-luc細(xì)胞體外生物發(fā)光效率

將細(xì)胞數(shù)按照0、31 250、62 500、125 000、250 000、500 000和1 000 000個(gè)/孔分別接種到96孔黑板中，加入熒光素底物進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖1顯示，生物發(fā)光強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)成正比，R² = 0.958 4且在較低細(xì)胞數(shù)時(shí)達(dá)到較高的光子通量，說明細(xì)胞發(fā)光效率較高，可進(jìn)行下一步動物造模和藥效學(xué)評價(jià)實(shí)驗(yàn)。

3.2 CT26-luc細(xì)胞造模接種條件確定

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置四個(gè)不同接種條件建立動物模型，結(jié)果如圖2所示。

根據(jù)圖2中小鼠腹腔光通量變化、小鼠腰圍變化和小鼠生存期提示，發(fā)現(xiàn)相同的接種細(xì)胞數(shù)并沒有出現(xiàn)預(yù)期中接種體積越大、造模效果越好的情況，結(jié)合相同接瘤濃度但體積不同（接種條件為400 μL的2.5×10⁶ 個(gè)/mL和200 μL的2.5×10⁶ 個(gè)/mL細(xì)胞懸液）的造模效果類似，而相同接瘤細(xì)胞數(shù)但濃度不同（接種條件為200 μL的2.5×10⁶ 個(gè)/mL和400 μL的1.25×10⁶ 個(gè)/mL細(xì)胞懸液）的造模效果相差較大，推測腹腔接瘤效果與接種細(xì)胞濃度有較大的關(guān)系，可能是由于高體積低濃度細(xì)胞液稀釋了動物體內(nèi)局部組織液，導(dǎo)致細(xì)胞在體內(nèi)環(huán)境生長所需營養(yǎng)交換效率降低，限制并影響了細(xì)胞周期，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生長。在接種條件為400 μL的2.5×10⁶ 個(gè)/mL和200 μL的2.5×10⁶ 個(gè)/mL細(xì)胞懸液時(shí)，光子通量和腰圍變化趨勢較大，200 μL的2.5×10⁶ 個(gè)/mL的接種條件時(shí)，生存期略長。以200 μL的2.5×10⁶ 個(gè)/mL的細(xì)胞接種條件建立小鼠CT26-luc腹腔移植瘤模型，在接種18 d時(shí)解剖該模型小鼠，發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)已形成血性腹水，且腸系膜和肝臟組織出現(xiàn)多發(fā)的轉(zhuǎn)移灶，呈現(xiàn)腹腔內(nèi)的廣泛轉(zhuǎn)移，說明小鼠CT26-luc腹腔移植瘤模型構(gòu)建成功（圖3）。因此選擇200 μL的2.5×10⁶ 個(gè)/mL的細(xì)胞接種量為小鼠腹腔移植瘤模型建模條件。

3.3 溶瘤病毒對結(jié)腸癌腹腔移植瘤的抗腫瘤活性

為評價(jià)溶瘤病毒VT1093M對小鼠CT26-luc腹腔移植瘤的治療效果，本實(shí)驗(yàn)選擇200 μL的2.5×10⁶ 個(gè)/mL細(xì)胞懸液的接種條件建立了小鼠CT26-luc腹腔移植瘤模型，并檢測溶瘤病毒T1093M在該模型中的抑瘤效果，實(shí)驗(yàn)方案如圖4所示。治療過程中，NS組較其他注射病毒組體重增加（圖5（a）），NS組小鼠腰圍在接瘤第14天后明顯增大，而其他注射病毒組腰圍無明顯變化（圖5（b）），可能是腹腔移植腫瘤增長和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生腹水引起腰圍增長。在給藥起始階段，各組小鼠光子通量相似，給藥后VT1093M組的腫瘤負(fù)荷顯著小于NS組，且明顯小于起始負(fù)荷。VT09X組的腫瘤負(fù)荷也明顯降低，但略高于VT1093M組（圖6）。

在熒光消失后13天（即初始接瘤后第30天）進(jìn)行再挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)，此階段NS組小鼠全部死亡，選擇VT1093M組熒光消退小鼠、VT09X組熒光量最小的小鼠和未處理小鼠，接種200 μL的2.5×10⁶ 個(gè)/mL細(xì)胞懸液，再次接種后第5天開始進(jìn)行熒光觀測，結(jié)果顯示，未處理小鼠自接種第5天出現(xiàn)熒光，且光子通量持續(xù)增長，直到再接種后第11天，VT1093M組均未出現(xiàn)腫瘤生長情況，VT09X組小鼠腫瘤生長較再次接種前熒光緩慢增長（圖7），說明腹腔注射溶瘤病毒VT1093M可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對CT26-luc的特異性免疫反應(yīng)。

3.4 體外殺傷實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證VT1093M病毒的抗腫瘤免疫反應(yīng)

為進(jìn)一步證明VT1093M病毒提高了小鼠免疫反應(yīng)，末次注射病毒后處死小鼠，取腹水中的細(xì)胞以及利用磁珠分離小鼠外周血中的CD45⁺細(xì)胞，將其在體外與CT26-luc和4T1細(xì)胞共培養(yǎng)4 h，通過比較共培養(yǎng)前后靶細(xì)胞死亡比例來反映小鼠體內(nèi)的免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱及其特異性。圖8顯示，各注射病毒組的外周血CD45⁺細(xì)胞對CT26-luc的殺傷作用明顯，且隨著靶效比例的增加而增大，但對4T1細(xì)胞的殺傷效果較差，各比例之間無顯著性差異；腹水中的細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果均不明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明注射VT1093M組外周血中的白細(xì)胞對于腫瘤細(xì)胞的殺傷以特異性殺傷為主。

4 討 論

本研究以CT26-luc為實(shí)驗(yàn)材料成功建立了結(jié)腸癌腹腔移植瘤模型，并利用動物活體成像進(jìn)行長期的觀測，較普通造模更加直觀靈敏且結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。隨后利用該模型探究了重組溶瘤病毒的抗腫瘤作用，結(jié)果顯示VT1093M在結(jié)腸癌腹腔移植瘤模型中展示出較好的抑瘤效果，腹部熒光顯著弱于NS組，在外周血分離的CD45⁺細(xì)胞與CT26-luc和4T1細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，VT1093M表現(xiàn)出對CT26-luc更明顯的殺傷，并且對4T1無明顯作用，這說明血液中的白細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷屬于特異性殺傷，因此在再挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)中無腫瘤生長和復(fù)發(fā)的現(xiàn)象，從而達(dá)到持久且良好的抑瘤作用。

已有研究表明，腹腔注射溶瘤病毒在小鼠腹腔腫瘤模型中顯示出良好的治療效果。LAMBRIGHT等報(bào)道在h-ras轉(zhuǎn)化的小鼠成纖維細(xì)胞衍生的腫瘤細(xì)胞系EJ-6-2-Bam-6a腹腔腫瘤模型上，溶瘤病毒HSV-1716以每次4×10⁶ pfu進(jìn)行腹腔注射。多次注射后小鼠的生存期得到顯著的提高，達(dá)到40%的治愈率，且HSV1免疫過的腹腔腫瘤模型小鼠對比未免疫過的小鼠生存率沒有明顯的下降，這表明了腹腔注射HSV1溶瘤病毒的有效性和安全性^［14］。本研究中，VT09X實(shí)驗(yàn)組的抑制效果進(jìn)一步證實(shí)了該實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并且VT1093M在VT09X的基礎(chǔ)上表達(dá)PD-1抗體，顯著提高了腹腔腫瘤的治愈率。本研究第一次報(bào)道攜帶免疫檢查點(diǎn)抑制劑的HSV1溶瘤病毒在小鼠腹腔移植瘤中的顯著抑瘤效果。臨床上利用溶瘤重組腺5型病毒H101（Oncorine）治療腫瘤腹腔轉(zhuǎn)移后產(chǎn)生腹水的病人，證明了H101具有良好的安全性和有效性，腹腔注射H101可以促進(jìn)腹腔腫瘤細(xì)胞消退以及樹突狀細(xì)胞、CD8⁺ T細(xì)胞的水平上升，且腹水控制率達(dá)到75%，顯示出H101的溶瘤活性以及激活腹腔內(nèi)殺傷腫瘤的免疫活性^［15］。攜帶免疫檢查點(diǎn)抑制劑的HSV1溶瘤病毒在臨床上針對腹腔轉(zhuǎn)移病人的治療具有較大的潛力，探究在腹腔移植瘤小鼠中腹腔注射VT1093M所引起免疫環(huán)境的改變是我們下一步的研究目標(biāo)。

總之，通過熒光標(biāo)記的細(xì)胞建立可在動物活體成像系統(tǒng)下直接觀測的結(jié)腸癌腹腔移植瘤模型，來模擬結(jié)腸癌晚期腹腔轉(zhuǎn)移后腹腔多發(fā)轉(zhuǎn)移且產(chǎn)生血性腹水的現(xiàn)象，重組溶瘤病毒VT1093M展現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用，且激發(fā)了小鼠較為持久的特異性免疫反應(yīng)，為結(jié)腸癌晚期腹腔轉(zhuǎn)移腫瘤的臨床治療提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ " SUNG H， FERLAY J， SIEGEL R L， et al. Global cancer

statistics 2020： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries［J］. CA： A Cancer Journal for Clinicians， 2021， 71（3）： 209-249.

［2］ ARNOLD M， SIERRA M S， LAVERSANNE M， et al. Global patterns and trends in colorectal cancer incidence and mortality［J］. Gut， 2017， 66（4）： 683-691.

［3］ " 中國醫(yī)師協(xié)會結(jié)直腸腫瘤專業(yè)委員會腹膜腫瘤專業(yè)委員會. 結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移預(yù)防和治療腹腔用藥中國專家共識（Ⅴ2019）［J］. 中華結(jié)直腸疾病電子雜志， 2019， 8（4）： 329-335.

［4］ " CEELEN W P， FLESSNER M F. Intraperitoneal therapy for peritoneal tumors： biophysics and clinical evidence［J］. Nature Reviews Clinical Oncology， 2010， 7（2）： 108-115.

［5］ " 葉雨辰， 趙俊龍， 王琳， 等. EGFP-Luc-Hepa1-6細(xì)胞系的構(gòu)建及其在小鼠肝癌模型中的應(yīng)用［J］. 中國生物工程雜志， 2015， 35（5）： 1-7.

［6］ " 閆明霞， 劉蕾， 朱淼鑫， 等. 人肝癌原位移植瘤的活體動態(tài)觀察［J］. 實(shí)驗(yàn)動物與比較醫(yī)學(xué)， 2010， 30（6）： 401-405.

［7］ " 趙永江， 朱淼鑫， 袁立新， 等. 人結(jié)腸癌原位移植瘤裸小鼠模型的活體成像觀察［J］. 實(shí)驗(yàn)動物與比較醫(yī)學(xué)， 2016， 36（3）： 174-179.

［8］ " NG Y Y， TAY J C K， WANG S. CXCR1 expression to improve anti-cancer efficacy of intravenously injected CAR-NK cells in mice with peritoneal xenografts［J］. Molecular Therapy-Oncolytics， 2020， 16： 75-85.

［9］ " 孔慶利， 梁志鵬. 結(jié)腸癌新輔助化療方案的研究現(xiàn)狀［J］. 醫(yī)療裝備， 2021， 34（20）： 193-194.

［10］ """""""" BHUDIA J， GLYNNE-JONES R， SMITH T， et al. Neoadjuvant chemotherapy without radiation in colorectal cancer［J］. Clinics in Colon and Rectal Surgery， 2020， 33（5）： 287-297.

［11］ """""""" PIDELASERRA-MARTí G， ENGELAND C E. Mechanisms of measles virus oncolytic immunotherapy［J］. Cytokine amp; Growth Factor Reviews， 2020， 56： 28-38.

［12］ """""""" INNAO V， RIZZO V， ALLEGRA A G， et al. Oncolytic viruses and hematological malignancies： a new class of immunotherapy drugs［J］. Current Oncology， 2020， 28（1）： 159-183.

［13］ """"""" 于洪妤， 楊鵬輝， 孫芳， 等. 溶瘤流感病毒聯(lián)合PD-1抗體增強(qiáng)對肝癌的抗腫瘤活性研究［J］. 免疫學(xué)雜志， 2023， 39（3）： 240-247.

［14］ """""""" LAMBRIGHT E S， KANG E H， FORCE S， et al. Effect of preexisting anti-herpes immunity on the efficacy of herpes simplex viral therapy in a murine intraperitoneal tumor model［J］. Molecular Therapy， 2000， 2（4）： 387-393.

［15］ """""""" ZHANG Y L， QIAN L， CHEN K， et al. Intraperitoneal oncolytic virotherapy for patients with malignant ascites： Characterization of clinical efficacy and antitumor immune response［J］. Molecular Therapy-Oncolytics， 2022， 25： 31-42.

Anti-Tumor Effects of Oncolytic Viruses Engineered with Anti-PD-1 Antibody in Celiac Graft Tumor Model of Colon Cancer

LIU Wenqi， HU Zongfeng， LI Shuzhen， LI Jinfeng， LI Xiaopeng

（School of Pharmacy， Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation （Yantai University）， Ministry of Education， Collaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of Shandong， Yantai University， Yantai 264005， China）

Abstract： To investigate the anti-tumor effects of oncolytic viruses that express a mouse anti-PD-1 antibody （VT1093M） on a celiac graft tumor model of colon cancer， the peritoneal graft model using CT26-luc cells is established in BALB/c mice. On day 8 after inoculation， mice are randomly divided into three groups （n = 5）：normal saline （NS） group， VT09X virus group and VT1093M virus group. A dose of 2.5×10⁷pfu/250 μL is administered once every other day for a total of five viral injections. On day 6 after the last injection， mice are sacrificed， ascites cells and CD45⁺ cells from peripheral blood are extracted for in vitro killing experiments. The rechallenge experiment is performed on day 13 after the initial disappearance of fluorescence in the injected virus group. Modeling experiments determine that the optimal seeding condition is 200 μL 2.5×10⁶ cells/mL cell suspension. The results indicate the potential efficacy of VT1093M oncolytic viruses in treating colon cancer. In the drug efficacy experiment， both the VT09X and VT1093M groups exhibit significant tumor suppression compared with the NS group. The VT1093M group shows complete tumor disappearance during the treatment period with a more pronounced tumor-suppressive effect than the VT09X group， though no significant difference is observed between the two groups. In the rechallenge experiment， no tumor regrowth is observed in the VT1093M group. In the in vitro killing experiment， the peripheral blood CD45⁺ cells in the injected virus group exhibit obvious killing effect on CT26-luc when the target effect ratio is 1∶40， while the killing effect on 4T1 cells is poor. These findings demonstrate that the recombinant oncolytic virus VT1093M has a significant antitumor effect in the colon cancer abdominal metastasis model and it stimulates a relatively durable specific immune response in mice.

Key words ：Keywords：colon cancer; celiac graft tumor; oncolytic virus; bioluminescence; specific immunity

（責(zé)任編輯 周雪瑩）