雙貝糖漿和君藥板藍(lán)根的入血成分及抗炎活性成分

摘要：為了研究雙貝糖漿的抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)，利用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS識別鑒定雙貝糖漿與組方君藥板藍(lán)根的主要化學(xué)成分及入血成分。UHPLC-Q-Orbitrap HRMS結(jié)果顯示，板藍(lán)根提取物中含71個主要的化學(xué)成分、其中有46個成分可入血，以上化學(xué)成分在雙貝糖漿中被檢測到66個、其中42個成分可入血。進(jìn)一步通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討其君藥板藍(lán)根的抗炎活性成分及作用機(jī)制，通過Griess法結(jié)合MTT法驗證雙貝糖漿和板藍(lán)根二者共同入血成分的抗炎活性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果表明板藍(lán)根抗炎的關(guān)鍵化學(xué)成分有金合歡素、異牡荊素、半齒澤蘭素等。以LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞建立體外炎癥模型，5-羥甲基糠醛、胞苷、異牡荊素、丁香酸在100 μmol/L時，能夠顯著抑制炎癥介質(zhì)NO的釋放。在大鼠灌胃雙貝糖漿與板藍(lán)根提取物的血清樣品中均能夠檢測到異牡荊素，抗炎活性實驗結(jié)果表明，其對炎癥介質(zhì)NO的抑制作用最強，為雙貝糖漿及其君藥板藍(lán)根的關(guān)鍵抗炎活性成分。

關(guān)鍵詞：雙貝糖漿;板藍(lán)根;UHPLC-Q-Orbitrap HRMS;入血成分;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);抗炎作用

中圖分類號：R917;R96

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

雙貝糖漿（原名消炎靈糖漿）為煙臺市中醫(yī)醫(yī)院臨床使用幾十年的協(xié)定處方，因安全有效，知名度高收載于煙臺市制劑規(guī)范第一版，為煙臺市中醫(yī)醫(yī)院傳統(tǒng)、特色醫(yī)院制劑^［1］。它是由板藍(lán)根、金銀花、黃芩、甘草等9味中藥組成的復(fù)方制劑，主要用于治療風(fēng)熱感冒，證見咽候腫痛、咳嗽等。雙貝糖漿的臨床應(yīng)用歷史悠久，療效確切，但是其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)并未完全闡明，對其有效成分的研究甚少，僅有文獻(xiàn)報道利用高效液相色譜法可測定不同批次雙貝糖漿中黃芩苷的含量^［2］。板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.的干燥根，性寒、味苦，具有抗菌^［3］、抗腫瘤^［4］、抗內(nèi)毒素^［5］、抗炎^［6］及免疫調(diào)節(jié)^［7］等多種藥理作用，板藍(lán)根清熱解毒，涼血利咽，為雙貝糖漿復(fù)方中的君藥。

雙貝糖漿的主要化學(xué)成分與入血成分未曾見報道，本研究基于超高效液相質(zhì)譜與雜化四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）技術(shù)對雙貝糖漿與其君藥板藍(lán)根的主要化學(xué)成分及入血成分進(jìn)行分析，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法^［8-9］研究板藍(lán)根的抗炎活性成分及作用機(jī)制，并通過Griess法結(jié)合MTT法驗證雙貝糖漿和板藍(lán)根二者共同的入血成分的抗炎活性。

1 材 料

雙貝糖漿、板藍(lán)根由煙臺市中醫(yī)醫(yī)院提供。小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7（ATCC TIB-71）購自中科院上海細(xì)胞庫，RPMI 1640培養(yǎng)基購自Invitrogen，LPS和DMSO購自Sigma-Aldrich， Inc （St. Louis， MO， USA）。3111型CO₂培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）。超高效液相色譜與雜化四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），5810R臺式高速大容量冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），水為娃哈哈純凈水，甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，乙酸乙酯為分析純。

SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量160～200 g，購自濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（魯）20190003。實驗前在12 h晝夜循環(huán)的動物房內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，自由獲得飼料和飲用水。

2 方 法

2.1 板藍(lán)根水提取物的制備

稱取板藍(lán)根粉末，加8倍量水煎煮1 h，放置至室溫，過濾，殘渣加6倍量水煎煮40 min，放置至室溫，過濾，合并以上濾液，濃縮，干燥，制得板藍(lán)根干燥粉末。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 將雙貝糖漿稀釋一倍，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，得到雙貝糖漿供試品溶液，用于定性分析。精密稱取0.054 g板藍(lán)根干燥粉末，置于5 mL容量瓶，超聲60 min，放置至室溫，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，上清通過0.45 μm微孔濾膜濾過，得板藍(lán)根供試品溶液。

2.2.2 灌胃溶液的制備 精確稱取適量的板藍(lán)根干燥粉末，加適量水，超聲30 min使其溶解，配置成濃度約為0.135 g/mL板藍(lán)根水提取物溶液（即每1 mL含生藥0.41 g）。

2.3 動物分組給藥與血清樣品采集

2.3.1 動物分組給藥 SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白組、雙貝糖漿組及板藍(lán)根給藥組，每組6只。實驗前禁食不禁水12 h，給藥組灌胃給予3倍量板藍(lán)根水提取物溶液及雙貝糖漿1 mL/100 g，空白組給予等量生理鹽水。在給藥后0.5、1、2、4、6、8 h，采用眼眶取血的方式各取250 μL于肝素管中，4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，分離血漿，取上清液，備用。本研究動物實驗經(jīng)過煙臺大學(xué)動物倫理委員會審查批準(zhǔn)。

2.3.2 血清樣品處理 200 μL血清加入800 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋混勻1 min后，4 ℃、12"" 000 r·min^-1離心10 min，取上清液于40 ℃下氮氣吹干，加入200 μL甲醇復(fù)溶，渦旋1 min后，4 ℃、12 000 r·min^-1離心10 min，取上清液進(jìn)樣。

2.4 UHPLC-Q-Orbitrap HRMS檢測條件

2.4.1 色譜條件 Agilent TC-C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫40 ℃，流動相0.1%甲酸水溶液（A）、0.1%甲酸乙腈溶液（B），流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量3 μL，梯度洗脫0～4 min，2%～10%B;4～10 min，10%～15%B;10～14 min，15%～24%B;14～16 min，24%～30%B;16～25 min，30%～45%B;25～34 min，45%～100%B;34～41 min，100%～2%B;41～43 min，2%B。

2.4.2 質(zhì)譜條件 ESI電離源，正、負(fù)離子模式掃描，噴霧電壓+3.5 kV/-2.5 kV，掃描范圍100～1500 m/z，毛細(xì)管溫度263 ℃，鞘氣流速50 arbs，輔助氣流速13 arbs，離子源溫度425 ℃。

2.5 板藍(lán)根活性成分及靶點篩選

經(jīng)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP）檢索板藍(lán)根的活性成分信息。以口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18為條件，篩選板藍(lán)根中主要的有效成分。進(jìn)一步通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取與活性成分相對應(yīng)的蛋白靶點，去除重復(fù)項，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫規(guī)范蛋白靶點信息，獲得對應(yīng)的基因名。

2.6 炎癥相關(guān)靶點的篩選

運用GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索炎癥相關(guān)基因，以“inflammation”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，得到炎癥相關(guān)基因。將收集到的活性成分預(yù)測基因與炎癥基因取對應(yīng)的交集，繪制韋恩圖，得到共同靶基因，即為板藍(lán)根潛在的抗炎靶點基因。

2.7 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析

將交集靶點輸入到String數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1中構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，并進(jìn)行拓?fù)浞治?，獲取板藍(lán)根抗炎的關(guān)鍵靶蛋白。

2.8 “板藍(lán)根活性成分-預(yù)測靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將板藍(lán)根的活性成分及預(yù)測靶點上傳至Cytoscape 3.7.1軟件中構(gòu)建“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，以探討板藍(lán)根的藥理作用機(jī)制。節(jié)點代表板藍(lán)根有效活性成分和作用靶點，邊分別代表活性成分與靶點之間的相互關(guān)系。

2.9 KEGG信號通路與GO生物過程富集分析

將交集蛋白導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG信號通路富集分析和GO生物過程富集分析，設(shè)置Plt;0.05進(jìn)行篩選，得到KEGG信號通路氣泡圖和GO富集柱狀圖，并構(gòu)建“活性成分-核心靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

2.10 噻唑藍(lán)（MTT）比色法檢測細(xì)胞毒性

采用MTT法檢測細(xì)胞活力，評價細(xì)胞毒性。RAW 264.7細(xì)胞以1×10⁶個/mL的細(xì)胞密度接種于96孔板中（200 μL/孔）。培養(yǎng)1 h，待細(xì)胞貼壁后加入不同的單體化合物，設(shè)置空白組、模型組（加入1 μg/mL的LPS）、給藥組（終濃度100 μmol/L），孵育24 h之后，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)孵育4 h。棄掉上清液，每孔加入150 μL DMSO，以630 nm為參比波長，570 nm為檢測波長測定吸光度。

2.11 Griess法檢測炎癥介質(zhì)NO水平

RAW 264.7細(xì)胞以1×10⁶個/mL接種于96孔板中，每孔200 μL細(xì)胞液，于37 ℃，5% CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。設(shè)置空白組、模型組（加入1 μg/mL的LPS）、給藥組（終濃度100 μmol/L），孵育24 h，吸取100 μL上清液，加入預(yù)先混合均勻的Griess試劑（100 μL/孔），振搖10 min，540 nm處測吸光度，計算不同化合物對炎癥介質(zhì)NO的抑制率。

3 實驗結(jié)果

3.1 體外化學(xué)成分鑒定

雙貝糖漿與板藍(lán)根正、負(fù)離子模式下的總離子流圖如圖1所示。基于文獻(xiàn)調(diào)研并運用Xcalibur 4.0軟件對總離子流上的峰進(jìn)行精確質(zhì)量數(shù)識別。雙貝糖漿中共鑒定出66個化學(xué)成分，包括31個生物堿類（25個吲哚類、4個喹唑酮類、2個其他類生物堿），13個有機(jī)酸類，7個氨基酸類，5個核苷類，4個黃酮類，6個其他類化合物。板藍(lán)根水提取物中共鑒定出71個化學(xué)成分，包括32個生物堿類（26個吲哚類、4個喹唑酮類、2個其他類生物堿），16個有機(jī)酸類，7個氨基酸類，5個核苷類，4個黃酮類，7個其他類化合物。詳見表1。

3.2 體內(nèi)入血成分鑒定

基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析技術(shù)，對雙貝糖漿和板藍(lán)根水提取物灌胃大鼠后的含藥血清與空白血清進(jìn)行成分辨識，并對比分析雙貝糖漿和板藍(lán)根水提取物樣品成分，根據(jù)色譜峰保留時間及質(zhì)譜裂解規(guī)律，結(jié)合文獻(xiàn)相關(guān)信息，推斷出雙貝糖漿血清中含有42種入血成分，板藍(lán)根水提取物血清中含有46種入血成分。通過比較兩組含藥血清發(fā)現(xiàn)，8種化學(xué)成分僅存在于板藍(lán)根血清樣品，4種化學(xué)成分僅存在于雙貝糖漿血清樣品，38種為共同的入血成分，詳見表2。

3.3 君藥板藍(lán)根的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

3.3.1 活性成分及靶點篩選 運用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索獲得板藍(lán)根中含有169個化學(xué)成分，通過OB≥30%，DL≥0.18進(jìn)行篩選，得到35個活性成分（表3），包括12個生物堿類、9個黃酮類、2個核苷類、1個有機(jī)酸類、11個其他類化合物。檢索活性成分所對應(yīng)的蛋白靶點，共得到67個靶標(biāo)基因。

3.3.2 疾病相關(guān)靶點篩選 運用篩選的活性成分靶點與疾病靶點進(jìn)行對照，得到潛在抗炎靶點基因，檢索的67個活性成分靶點與1363個炎癥靶點取交集，得到33個板藍(lán)根發(fā)揮抗炎作用的潛在靶點。

3.3.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 取交集靶點上傳至String數(shù)據(jù)庫，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖，運用Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行分析，該網(wǎng)絡(luò)圖包含節(jié)點30個，邊151條。根據(jù)String數(shù)據(jù)庫中度值（Degree）的大小，對節(jié)點及邊的大小與顏色進(jìn)行設(shè)置，度值越大，節(jié)點越大，顏色越深，表示該點在PPI網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用;邊越粗，表示蛋白質(zhì)之間的相互作用越大。由圖3所見，TNF、TP53、CASP3、PTGS2、NOS3、MAPK14等靶點在該PPI網(wǎng)絡(luò)中位于核心位置，提示在抗炎作用中起關(guān)鍵調(diào)控作用。

3.3.4 “活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，如圖4所示，該網(wǎng)絡(luò)圖包含103個節(jié)點和301條邊，體現(xiàn)了板藍(lán)根多成分、多靶點的作用機(jī)制。

3.3.5 GO分析與KEGG信號通路分析 GO分析（圖5）表明，板藍(lán)根參與的生物學(xué)過程主要有細(xì)胞對氧水平的反應(yīng)、細(xì)胞對氮化合物的反應(yīng)和凋亡信號通路等過程，細(xì)胞組成有內(nèi)吞囊泡、細(xì)胞器外膜和受體復(fù)合體等，抗炎靶點功能主要有泛素蛋白連接酶結(jié)合、蛋白酶結(jié)合和蛋白激酶活性等。

KEGG通路分析結(jié)果（圖6）顯示，板藍(lán)根抗炎靶點涉及多條與炎癥密切相關(guān)的信號通路，包含癌癥信號通路，雌激素信號通路，甲狀腺激素信號通路和神經(jīng)活性配體-受體相互作用等。

3.3.6 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 如圖7所示，由于活性成分BLG11，BLG14，BLG15，BLG20，BLG24，BLG26，BLG33和BLG35與炎癥相關(guān)的靶點沒有相互作用，故不在圖中顯示。該網(wǎng)絡(luò)中有73個節(jié)點，202條邊，根據(jù)度值的大小對活性成分，關(guān)鍵靶點與信號通路進(jìn)行設(shè)置，度值越大，靶點顏色越深，該點在該網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用;節(jié)點越大，該成分為主要活性成分，或該通路為主要通路。結(jié)果顯示，板藍(lán)根的主要活性成分為金合歡素、澤蘭黃素、異牡荊素、半齒澤蘭素等，作用靶點主要為PTGS2，TNF，NOS2，MAPK14等，符合中藥多成分，多靶點，多通路的作用特點。

3.4 主要化學(xué)成分對細(xì)胞活力的影響

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析結(jié)果，選取了11個雙貝糖漿中可入血的主要化學(xué)成分，通過MTT法初步評價了它們對RAW 264.7巨噬細(xì)胞增殖的影響。如圖8所示，實驗結(jié)果表明，鳥苷、蒙花苷、香草乙酮、半齒澤蘭素和色胺酮5個單體化合物在終濃度100 μmol/L時有輕微的細(xì)胞毒性。5-羥甲基糠醛、尿苷、鄰氨基苯甲醛、胞苷、異牡荊素、丁香酸在100 μmol/L時，對RAW 264.7細(xì)胞正常增殖無影響。

3.5 雙貝糖漿主要入血活性成分對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)NO的抑制活性

如圖9所示，5-羥甲基糠醛、胞苷、異牡荊素、丁香酸在100 μmol/L時，能夠顯著抑制炎癥介質(zhì)NO的釋放。

4 討 論

雙貝糖漿由板藍(lán)根等9味中藥組成，化學(xué)成分復(fù)雜多樣，臨床發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)不清楚。UHPLC-Q-Orbitrap HRMS具有高分辨，高靈敏度和分析速度快等特點^［10］，在中藥復(fù)雜體系物質(zhì)基礎(chǔ)研究中具有顯著優(yōu)勢^［11］。本研究運用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)鑒定雙貝糖漿與君藥板藍(lán)根的化學(xué)成分，以期發(fā)現(xiàn)能夠入血的重要成分，實驗結(jié)果表明板藍(lán)根提取物含71個化學(xué)成分、46個入血成分，以上成分在雙貝糖漿中僅檢測出66個、42個成分可入血。其中，38個共同的入血成分可能是入血發(fā)揮藥效的關(guān)鍵成分。

黃酮類成分具有抗炎、抗氧化等一系列藥理活性，異牡荊素已被證明具有多種生物學(xué)特性，在體內(nèi)外均能有效地保護(hù)LPS誘導(dǎo)的損傷、氧化應(yīng)激和炎癥^［12］。本研究結(jié)果表明，入血成分5-羥甲基糠醛、胞苷、異牡荊素、丁香酸在100 μmol/L時，不影響細(xì)胞的正常增殖，能夠顯著抑制炎癥介質(zhì)NO的釋放，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的關(guān)鍵成分異牡荊素對炎癥介質(zhì)NO的抑制效果最強，為雙貝糖漿發(fā)揮抗炎作用的主要活性成分，可為雙貝糖漿后續(xù)抗炎機(jī)制的深入研究提供依據(jù)。本研究對提升雙貝糖漿的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)、完善其藥效機(jī)制研究及指導(dǎo)其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用具有一定的意義。

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Constituents Absorbed into Blood and Anti-inflammatory Active Constituents of Shuang Bei Tang Jiang and Isatidis Radix

XU Yaoyao¹， JIN Xin²， YU Xiangtao²， GAO Yinhe¹， ZHAO Feng¹

（1. School of Pharmacy， Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation of Ministry of Education （Yantai University）， Collaborative Innovation Center for Novel Preparations and Biotechnology Drugs of Shandong Province， Yantai University， Yantai 264005， China; 2. Yantai Hospital of Traditional Chinese Medicine， Yantai 264000， China）

Abstract：In order to study the anti-inflammatory substance basis of “Shuang Bei Tang Jiang”， UHPLC-Q-Orbitrap HRMS is used to identify the chemical components and constituents can be absorbed into blood of Shuang Bei Tang Jiang and Isatidis Radix. The results of UHPLC-Q-Orbitrap HRMS show that the extract of Isatidis Radix contains 71 main chemical components， 46 among of them could enter the blood， while 66 of the above chemical components are detected in Shuang Bei Tang Jiang， 42 of them could enter the blood. Further， the anti-inflammatory active ingredients and the mechanism of action of its main drug Isatidis Radix are discussed through network pharmacology， and the anti-inflammatory activity of the main active components are verified by Griess method combined with MTT method. The results of network pharmacologic analysis showed that the key anti-inflammatory components are acacia， isovitexin and eupatorin. 5-hydroxymethylfurfural， cytidine， isovitexin and syringic acid significantly inhibite NO release induced by LPS at 100 μmol/L in RAW 264.7 cells. Isovitexin can be detected in serum samples of Shuang Bei Tang Jiang and Isatidis Radix. The results of anti-inflammatory activity experiment show that isovitexin has the strongest inhibitory effect on NO production， and maybe the key anti-inflammatory active component of Shuang Bei Tang Jiang and Isatidis Radix.

Keywords：Shuang Bei Tang Jiang; Isatidis Radix; UHPLC-Q-Orbitrap HRMS; constituents absorbed into blood; network pharmacology; anti-inflammatory effect

（責(zé)任編輯 周雪瑩）