山藥中尿囊素對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)卵巢功能早衰的保護(hù)作用

王小蘭,李 方,孫 墨,王笑陽(yáng),馮衛(wèi)生,3*

1河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院;2河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院;3河南省中藥開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心,鄭州 450046

卵巢功能早衰(premature ovarian failure,POF)是婦科內(nèi)分泌系統(tǒng)的常見(jiàn)疾病。近年來(lái),育齡婦女POF發(fā)病率上升,卵巢功能下降嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量,并且顯著增加心血管疾病、骨質(zhì)疏松及代謝紊亂等相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。在癌癥和系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中,POF與環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CP)在臨床上的應(yīng)用密切相關(guān)[1,2],CP可通過(guò)氧化應(yīng)激[3]、激素[4]的分泌和炎癥[5]來(lái)干擾卵巢功能,尋找一種安全有效的卵巢功能保護(hù)劑是后續(xù)臨床藥物研發(fā)的關(guān)鍵。

山藥作為傳統(tǒng)藥食同源的中藥材之一,含有豐富的甾體皂苷類、多糖、尿囊素、黃酮類和酚苷類等活性成分,其化學(xué)成分的多樣性使其擁有多種藥理作用,如抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、降尿酸、抗腫瘤和在腎病方面的治療作用等。研究顯示,開(kāi)發(fā)利用藥食同源的中藥材與天然產(chǎn)物,在保護(hù)卵巢方面具有重要意義[6]。尿囊素(allantoin,ALL)是山藥中的主要活性成分[7],具有抗應(yīng)激[8]、抗炎[9]、調(diào)節(jié)腸道菌群[10]、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)[11]等作用。在前期研究中,課題組通過(guò)子宮組織中雌激素受體α和G蛋白偶聯(lián)雌激素受體的表達(dá)發(fā)現(xiàn)山藥和ALL具有雌激素樣作用[12,13],天然植物雌激素對(duì)大鼠卵巢卵泡發(fā)育有積極作用[14,15],因此,本研究采用CP誘導(dǎo)的卵巢功能早衰大鼠模型,探討ALL改善POF大鼠體內(nèi)激素水平、卵泡發(fā)育與成熟水平,并從氧化應(yīng)激的角度探討其改善POF的作用機(jī)制,為山藥及其活性成分ALL在女性生殖保護(hù)方面的開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

懷山藥(鐵棍山藥的無(wú)硫飲片)購(gòu)自焦作市藥材生產(chǎn)基地(批號(hào):20190415),經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳隨清教授鑒定為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositaThunb.的干燥根莖。

環(huán)磷酰胺注射劑(江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司,純度:95.0%～105.0%,批號(hào):18092626);柱層析填料Diaion HP-20(日本三菱化學(xué)公司,批號(hào):6L507);MCI Gel CHP-20(日本三菱化學(xué)公司,批號(hào):8H801);Toyopearl HW-40(日本TOSOH公司,批號(hào):40HWFD001FA),Sephadex LH-20(瑞典GE Healthcare公司,批號(hào):10265067);柱層析所用硅膠H(160～200目)、薄層層析硅膠(顆粒范圍10～40 (m)(青島海洋化工廠,批號(hào):0190168,0190221);戊酸雌二醇(仙靈藥業(yè)有限公司,批號(hào):19050721);雌二醇(estradiol,E2)、黃體生成素(luteinizing hormone,LH)與促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone,FSH)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,批號(hào)分別為:E-EL-0152c、E-EL-R0391c、E-EL-R0026c);超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)與丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號(hào)分別為:20200620、20200421、20200514);兔多克隆抗體Nrf2、NQO1(美國(guó)Abcam公司,批號(hào):ab137550、ab80588)和小鼠多克隆抗體HO-1(美國(guó)Thermofisher公司,批號(hào):MA1-112);β-actin兔多克隆抗體(武漢三鷹生物科技有限公司,批號(hào):22915-1-AP);實(shí)驗(yàn)大小鼠配合顆粒飼料(北京華阜康生物科技有限公司,批號(hào):2010220410)

1.1.2 動(dòng)物

SD大鼠(雌性,8周齡,體重200±10 g),北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證:SCXK(京)-2016-011,動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):114007002 01620,動(dòng)物飼養(yǎng)于IVC獨(dú)立通風(fēng)設(shè)備,溫度22±2 ℃,濕度(60±5)%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合相關(guān)倫理要求,已通過(guò)河南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審核,倫理審批號(hào):DWLL2018080003

1.1.3 儀器

萬(wàn)分之一天平(Mettler Toledo公司,型號(hào):AB204-N);蛋白快速轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD 公司,型號(hào):Trans-Blot?Turbo);超靈敏多功能成像儀(GE公司,型號(hào):Amersham Imager 600 );酶標(biāo)儀(BIO-RAD公司,型號(hào):iMarkTM);核磁共振儀(Bruker公司,型號(hào):AVANCE Ⅲ 500);紫外分光光度計(jì)(美國(guó)熱電公司,型號(hào):EVO300);高速低溫冷凍離心機(jī)(美國(guó)熱電公司,型號(hào):ST16R)。

1.2 方法

1.2.1 山藥中的尿囊素分離及鑒定

懷山藥(10 kg),采用75%含水乙醇組織破碎提取,過(guò)濾,合并濾液后減壓濃縮,加以1∶1比例加適量水分散溶解后,離心除去不溶物,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇經(jīng)過(guò)5次萃取,分別得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。乙酸乙酯部位和正丁醇部位通過(guò)Diaion HP-20大孔吸附樹(shù)脂、硅膠、Sephadex LH-20、Toyopearl HW-40、MCI Gel CHP-20、ODS色譜柱,并結(jié)合制備液相和重結(jié)晶的方法得到單體化合物尿囊素19.7 mg,利用波譜學(xué)方法(NMR)和化合物的理化性質(zhì)鑒定其結(jié)構(gòu)。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及分組

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照體重均衡原則隨機(jī)分為5組,每組10只,分別為正常對(duì)照組(NC),卵巢功能早衰模型組(POF):采用腹腔注射環(huán)磷酰胺 75 mg/kg誘導(dǎo)大鼠POF模型。戊酸雌二醇(estradiol valerate,EV)陽(yáng)性對(duì)照組給予EV 0.08 mg/kg,ALL高劑量(ALL-H)組給予ALL 140 mg/kg,ALL低劑量(ALL-L)組給予ALL 70 mg/kg,NC組與POF組給予等體積的蒸餾水,大鼠連續(xù)灌胃給藥14 d,1次/d。

1.2.3 大鼠標(biāo)本取材與卵巢指數(shù)的測(cè)定

每周記錄大鼠體重變化,末次給藥后大鼠禁食12 h,異氟烷吸入麻醉后,采用負(fù)壓采血管腹主動(dòng)脈取血;于4 ℃條件下3 000 r/min,離心15 min,取上層血清,-80 ℃冰箱備用,打開(kāi)大鼠腹腔,找到Y(jié)型子宮,沿子宮找到花形形狀的卵巢,取出卵巢組織,剔除脂肪后稱重,計(jì)算卵巢指數(shù),卵巢指數(shù)的計(jì)算公式:卵巢指數(shù)=(單個(gè)卵巢重量/大鼠體重)× 100%。

1.2.4 大鼠生化指標(biāo)的測(cè)定

采用酶聯(lián)免疫吸附分析(Elisa)試劑盒測(cè)定血清中的E2、LH、FSH,所有實(shí)驗(yàn)操作均按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行;大鼠卵巢組織用生理鹽水清洗,濾紙擦干后,取卵巢組織50 mg,按試劑盒比例要求加入0.9%生理鹽水,組織勻漿后,3 500 r/min,4 ℃離心10min,取上清。按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定勻漿中SOD、MDA、GSH-Px含量。

1.2.5 大鼠卵巢組織病理學(xué)觀察

采用4%多聚甲醛固定的卵巢后,經(jīng)過(guò)脫水,石蠟包埋,連續(xù)切片,蘇木精伊紅(H&E)染色后,于光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢組織的形態(tài)學(xué)變化,觀察內(nèi)容包括卵巢的原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、成熟卵泡、閉鎖卵泡及黃體數(shù)的變化。

1.2.6 大鼠卵巢免疫組化的測(cè)定

樣本按照“1.2.5”項(xiàng)下在制成切片后,PBS中3% H2O2溶液中孵育以滅內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性后,滴加Ultra V Block后,用Nrf2一抗(1∶500)孵育2 h,然后在PBS中洗滌2次,每次5 min。然后,在37 ℃下將生物素化的二抗添加到切片中1 h,然后將載玻片暴露于鏈霉親和素過(guò)氧化物酶和顯色劑。每次處理后,將載玻片在PBS中清洗。然后用DAB試劑盒顯影切片,用電子顯微鏡觀察并拍照。利用Image Pro Plus 6.0軟件對(duì)照片進(jìn)行分析(每組取3張石蠟切片,每張切片6張照片)。

1.2.7 大鼠卵巢組織氧應(yīng)激蛋白的表達(dá)的測(cè)定

組織中提取蛋白質(zhì),并使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定濃度。等量的蛋白質(zhì)樣品通過(guò)SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜在5%(V/V)的脫脂牛奶中在TBST中室溫封閉2 h,然后用一抗HO-1(1∶1 000)、NQO1(1∶1 000)、β-actin(1∶3 000)在4 °C過(guò)夜。膜在TBST中洗滌后,室溫下用二抗孵育1 h。PBST洗膜3次,每次5 min,最后用PBS洗5 min,待膜干后用近紅外熒光顯影。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 山藥中尿囊素的分離與鑒定

白色粉末;mp.105 ℃;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:10.51(1H,s,H-1),8.02(1H,s,H-3),6.89(1H,t,J=6.5 Hz,NH-4),5.77(2H,s,H-8),5.23(1H,d,J=8.0 Hz,H-6);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:156.7(C-2),62.4(C-4),173.6(C-5),157.3(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致,故確定該化合物是尿囊素(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1),經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)純度98.10%。

圖1 尿囊素的結(jié)構(gòu) Fig.1 Structure of allantoin

2.2 尿囊素對(duì)卵巢功能早衰大鼠卵巢指數(shù)的影響

由圖2可知,與NC組相比,POF組卵巢指數(shù)顯著降低(P<0.05)。給藥14 d后,與POF組相比,EV可以顯著增加卵巢指數(shù)(P<0.05),ALL-H能顯著改善POF大鼠的卵巢萎縮(P<0.05)。ALL-L對(duì)卵巢指數(shù)也有影響,但無(wú)明顯差異(P> 0.05)。

圖2 尿囊素對(duì)大鼠卵巢指數(shù)的影響Fig.1 Effect of ALL on ovarian index in 注:與NC組比較,*P <0.05,**P<0.01;與POF組比較,#P <0.05,##P<0.01,下同。Note:Compared with NC group,*P <0.05,**P<0.01;Compared with POF group,#P<0.05,##P <0.01,the same below.

2.3 大鼠卵巢組織病理形態(tài)的影響

由圖3可知,POF組閉鎖卵泡數(shù)量較NC組明顯增加,成熟卵泡、原始卵泡和次生卵泡較少。經(jīng)過(guò)連續(xù)給藥14 d后,與POF組相比,EV組與ALL組閉鎖卵泡數(shù)量明顯減少,成熟卵泡、原始卵泡和次生卵泡明顯增加;其中ALL-H組的POF大鼠卵泡數(shù)量明顯比在劑量ALL-L組的較多,提示:ALL-H對(duì)POF大鼠的卵巢功能障礙的改善較佳。

圖3 大鼠卵巢病理學(xué)檢查Fig.3 Pathological examination of rat ovary注:CL:黃體;SF:次級(jí)卵泡;Pr:初級(jí)卵泡;AF:閉鎖卵泡Note:CL:Corpus luteum,SF:Secondary follicles,Pr:Primary follicle,AF:Atretic follicle.

2.4 對(duì)大鼠血清激素的影響

由圖4可知,POF大鼠血清E2水平較正常大鼠明顯降低(P<0.01),FSH水平與LH水平明顯高于正常大鼠(P<0.01)。連續(xù)給藥14 d后,與POF大鼠相比,ALL和EV可以顯著提高POF大鼠血清中E2水平,降低FSH和LH水平(P<0.01或P<0.05),ALL-H 對(duì)POF大鼠血清中激素的改善作用最佳。

圖4 ALL對(duì)POF大鼠血清激素水平的影響Fig.4 Effects of ALL on hormone levels in the serum of POF

2.5 對(duì)大鼠卵巢抗氧化能力的影響

由圖5可知,POF組大鼠與NC組比較,SOD、GSH-Px水平顯著降低(P<0.01), MDA水平顯著升高(P<0.01)。連續(xù)給藥14 d后,與POF組相比,ALL可以提高POF大鼠SOD、GSH-Px水平,抑制MDA水平(P<0.01或P<0.05)。

圖5 ALL對(duì)POF大鼠卵巢組織中SOD、GSH-Px與MDA含量的影響Fig.5 Effect of ALL on SOD,GSH-Px and MDA contents in ovarian tissue of POF

2.6 對(duì)大鼠卵巢Nrf2蛋白表達(dá)的影響

由圖6可知,在卵巢組織切片中免疫組化結(jié)果顯示,與NC組相比較,POF組大鼠卵巢組織中的Nrf2蛋白表達(dá)降低(P<0.01);連續(xù)給藥14 d后,與POF組相比較EV組和ALL-H組Nrf2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01),而ALL-L組無(wú)明顯差異(P> 0.05)。

圖6 ALL 對(duì)POF大鼠卵巢組織中Nrf2蛋白表達(dá)水平的影響Fig.6 Effect of ALL on protein expression levels of Nrf2 in the ovarian tissues of POF

2.7 對(duì)大鼠卵巢組織中HO-1 與 NQO1蛋白表達(dá)的影響

由圖7可知,與NC組相比,POF組HO-1表達(dá)顯著降低(P<0.01),而NQO1的表達(dá)則沒(méi)有顯著性差異(P> 0.05);連續(xù)給藥14 d后,EV與ALL-L可以顯著升高POF大鼠卵巢組織中NQO1表達(dá)水平(P<0.01);而對(duì)HO-1的表達(dá),EV則沒(méi)有升高的作用(P> 0.05),ALL-H可以顯著升高HO-1水平(P<0.01)。提示,在CP誘導(dǎo)的大鼠卵巢損傷模型中,對(duì)NQO1影響不明顯,但是ALL在POF大鼠的卵巢組織NQO1與HO-1的表達(dá)均起到了一定的作用,并因其劑量不同所表達(dá)水平也是不同的。

3 討論與結(jié)論

環(huán)磷酰胺(CP)是一種廣泛用于治療惡性腫瘤和自身免疫性疾病的化療藥物,但其毒副作用強(qiáng),可對(duì)卵巢造成永久性損害[17]。在過(guò)去的幾十年里,在癌癥治療過(guò)程中,生殖能力的保護(hù)以及卵巢功能的恢復(fù)變得非常重要,因?yàn)檫@種方案的治療可以提高女性癌癥患者的生活質(zhì)量[18]。此外,CP還可以通過(guò)激活氧化應(yīng)激標(biāo)志物和過(guò)度消耗抗氧化防御機(jī)制影響心臟和腎臟等主要器官[19,20],因此,通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激改善CP對(duì)器官的損傷為本研究的關(guān)注點(diǎn)之一[21]。

CP的毒性與其代謝產(chǎn)物之一丙烯醛的產(chǎn)生有關(guān),而癌癥患者經(jīng)過(guò)CP治療后,谷胱甘肽(glutataione,GSH)則明顯降低,可能是因?yàn)楸┤┡c之相結(jié)合的結(jié)果,GSH是一種三肽,是體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑[22]。與此同時(shí),CP還改變健康卵巢組織中其他內(nèi)源性抗氧化劑的活性,如SOD,促進(jìn)卵巢細(xì)胞內(nèi)自由基損傷[23,24]。在本研究中,ALL可顯著保護(hù)大鼠卵巢免受CP引起的氧化應(yīng)激。ALL是嘌呤降解產(chǎn)生的代謝物,存在于動(dòng)植物體內(nèi),可促進(jìn)皮膚細(xì)胞生長(zhǎng)與傷口愈合,刺激成纖維細(xì)胞生長(zhǎng),并且具有雌激素樣作用,因此本研究在探究其保護(hù)器官損傷的同時(shí),也重點(diǎn)關(guān)注了其抗氧化作用以及作用途徑。在本研究中,70 mg/kg和140 mg/kg的尿囊素可以保持卵巢GSH-Px和SOD活性,并可以顯著抑制MDA,保護(hù)大鼠卵巢免受CP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激造成的卵巢損傷。

核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2屬于CNC亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活因子家族,通過(guò)誘導(dǎo)抗氧化活性保護(hù)蛋白編碼基因,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的氧化-脫氧反應(yīng)[25]。Nrf2通過(guò)結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)激活下游的抗氧化蛋白和酶,并保護(hù)抵御氧化應(yīng)激[26]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)POF大鼠卵巢中Nrf2的表達(dá)降低,氧化應(yīng)激增加;ALL則在一定劑量下調(diào)節(jié)Nrf2的水平。研究表明,下游靶基因(HO-1、NQO1等)的表達(dá)與Nrf2核易位一致,這不僅證實(shí)了Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Kelch-like associated protein 1,Keap1)-Nrf2-ARE通路的參與,也表明HO-1和NQO1在維持氧化還原穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用[27]。HO-1是血紅素加氧酶的一個(gè)亞型,容易被刺激誘導(dǎo),起間接抗氧化作用[28]。NQO1能清除超氧陰離子自由基,緩解氧化應(yīng)激[29]上調(diào)的活性氧(reactive oxygen species,ROS)過(guò)度積累。在我們的研究中,POF大鼠模型對(duì)其卵巢中NQO1的表達(dá)并不明顯,但是經(jīng)過(guò)連續(xù)給藥14 d后,陽(yáng)性藥EV與ALL在劑量70 mg/kg時(shí),可以顯著升高NQO1表達(dá)水平,提示其可能在卵巢損傷應(yīng)激中也起到了積極的作用,這種結(jié)果可能與NQO1的穩(wěn)定性、雙活性位點(diǎn)以及非酶活性相關(guān)[30],可能CP的刺激并沒(méi)有激活NQO1,而ALL在一定的劑量下可以與活性位點(diǎn)結(jié)合,因此還需要我們進(jìn)一步地去研究探討。POF大鼠模型對(duì)卵巢中HO-1的表達(dá)明顯降低,陽(yáng)性藥EV與ALL在劑量140 mg/kg時(shí)對(duì)HO-1的表達(dá)有明顯的改善作用。HO-1是一應(yīng)激反應(yīng)蛋白,能催化血紅素蛋白降解與轉(zhuǎn)化為膽紅素,分解代謝的產(chǎn)物具有抗氧化,抗凋亡以及免疫調(diào)節(jié)作用,因此,HO-1在應(yīng)激狀態(tài)下可以發(fā)揮保護(hù)作用,提示:ALL是可能通過(guò)調(diào)控HO-1發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用,改善POF大鼠卵巢損傷,本研究中氧化應(yīng)激對(duì)于NQO1途徑的影響,還需進(jìn)一步地研究。

ALL提高了POF大鼠卵巢組織中HO-1、Nrf2的表達(dá),緩解氧化應(yīng)激,調(diào)節(jié)激素水平,改善POF大鼠卵巢功能障礙,本研究為山藥及其活性成分ALL的開(kāi)發(fā)和利用提供參考依據(jù)。