假蒟根中一個新的酰胺類生物堿

邵金華,徐 拓,呂敬崑,陳小明,*

1湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院;2湖南省銀杏工程技術(shù)研究中心;3湖南恒偉藥業(yè)股份有限公司,永州 425100

假蒟(Pipersarmentosum)系胡椒科胡椒屬多年生、匍匐、逐節(jié)生根草本,常生于林下或路旁濕地,主產(chǎn)于我國云南、福建和貴州等省,在印度、越南、菲律賓以及馬來西亞等地也有分布[1]。假蒟不僅具有豐富的藥用價值,還具有較高的觀賞、食用和經(jīng)濟價值。據(jù)《中華本草》等典籍記載,假蒟性溫、味苦辛,其根、葉和果實均可入藥,具有溫中散寒、祛風(fēng)利濕和消腫止痛的功效,常用于胃寒痛、風(fēng)濕腰痛、妊娠水腫及外傷出血等癥的治療,療效顯著[2,3]。假蒟葉因具有獨特的辛香氣味,在中國南方江浙、兩廣地區(qū)作為一種調(diào)味品被廣泛使用和種植[4,5]。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,假蒟提取物具有廣泛的生物活性,如抗氧化[3]、抗炎[6]、抗菌[7]、殺蟲[8]、降血糖[9,10]和神經(jīng)保護[11]。目前,國內(nèi)外對假蒟化學(xué)成分的研究主要集中在葉和地上部分,對其地下根的研究相對較少,從假蒟中分離鑒定的化學(xué)成分有生物堿、木脂素、黃酮和甾醇等[12]。本課題組前期從假蒟葉中分離得到7個生物堿類化合物,其中部分化合物對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出良好的抑菌活性[5]。在對假蒟化學(xué)成分和生物活性的持續(xù)研究中發(fā)現(xiàn),假蒟根的95%乙醇提取物可減輕由角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠足腫脹癥狀并具有劑量依賴性,據(jù)此推測該提取物中含有抗炎活性成分。相關(guān)研究顯示,生物堿類化合物是假蒟根的主要活性成分[13,14]。本實驗對假蒟根的95%乙醇提取物進行化學(xué)成分研究,并采用LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7體外細胞炎癥模型對所得單體化合物進行抗炎活性篩選,旨在明確假蒟根的化學(xué)成分和相關(guān)藥效物質(zhì)基礎(chǔ),以期為進一步合理開發(fā)利用假蒟植物資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Bruker 400和600 MHz核磁共振譜儀(德國Bruker公司);Agilent 6545 Q-TOF液質(zhì)聯(lián)用儀(美國安捷倫公司);依利特P3700半制備液相色譜儀,UV3100紫外可見光檢測器(大連依利特分析儀器有限公司);200～300目柱層析硅膠及硅膠GF254薄層板(青島海洋化工有限公司);RP-18反相柱色譜硅膠和YMC-Pack Pro C18色譜柱(5 μm,250 mm × 10 mm,日本YMC公司);Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(德國Merck公司);色譜乙腈、甲醇(美國Tedia公司);二氯甲烷等分析純試劑均為天津市康科德科技有限公司產(chǎn)品;水為實驗室自制超純水。

1.2 植物材料

假蒟于2021年6月采自云南省西雙版納,經(jīng)湖南科技學(xué)院姜紅宇副教授鑒定為胡椒科胡椒屬假蒟(Pipersarmentosum)的地下根,憑證標本(2021-PS-0613)保存于湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取與分離

稱取假蒟的新鮮地下根8 kg,洗凈表面泥沙后切段,并置于陰涼處風(fēng)干水分,隨后使用95%的乙醇加熱回流提取3次,每次4 h,提取液經(jīng)減壓濃縮得到提取物0.95 kg。提取物中加入適量蒸餾水混懸,再依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,濃縮萃取液分別得到石油醚萃取部位(158.6 g)、乙酸乙酯萃取部位(316.8 g)和正丁醇萃取部位(304.6 g)。

乙酸乙酯萃取部位經(jīng)硅膠柱層析,用二氯甲烷-甲醇(100∶0→1∶1)梯度洗脫,分離得到8個流分(Fr.A～Fr.H)。Fr.D經(jīng)中壓ODS柱層析,甲醇-水(30∶70→100∶0)梯度洗脫得到Fr.D-1～Fr.D-6。其中,Fr.D-3經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱(甲醇)和半制備HPLC(甲醇∶水=48∶52,2 mL/min)得到化合物3(tR= 42.5 min,6.4 mg)、4(tR= 30.7 min,10.8 mg)和10(tR= 55.2 min,8.7 mg),Fr.D-5經(jīng)半制備HPLC(甲醇∶水=50∶50,2 mL/min)得到化合物7(tR= 54.4 min,21.5 mg)、8(tR= 41.8 min,12.8 mg)和9(tR= 59.0 min,6.6 mg)。Fr.G經(jīng)硅膠柱層析,二氯甲烷-甲醇(40∶0→1∶1)梯度洗脫得到Fr.G-1～Fr.G-9。Fr.G-4經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱(甲醇)和半制備型HPLC(甲醇∶水=60∶40,2 mL/min)分離純化得到化合物1(tR= 56.8 min,11.7 mg)和2(tR= 67.5 min,8.3 mg),Fr.G-6經(jīng)半制備型HPLC(甲醇∶水=25∶75,2 mL/min)分離純化得到化合物5(tR= 41.3 min,4.4 mg)和6(tR= 29.5 min,13.2 mg)。

1.3.2 抗炎活性篩選

以吲哚美辛為陽性對照,采用脂多糖(LPS)刺激的RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型測試各化合物對NO生成抑制作用,從而評價其抗炎活性[15,16]。取對數(shù)生長周期的RAW 264.7細胞株,以5 × 104個/mL密度接種于96孔板中,將其置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。再分別加入50 μL的LPS溶液(終濃度為0.5 μg/mL)和50 μL的待測化合物溶液,每個化合物設(shè)5個濃度(100、50、25、12.5、6.25 μmol/L),每個濃度設(shè)3個平行孔,另設(shè)正常對照孔。加藥后,培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振蕩混勻,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔吸取上清液100 μL置于新的96孔板中,之后按照試劑盒說明書進行NO含量檢測,用酶標儀于540 nm處測定吸光度值,繪制標準曲線,計算NO的抑制率。同時,采用MTT法測試各化合物對同一批次細胞的毒性。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1淡黃色油狀液體;HR-EI-MS:m/z343.165 1 [M+H]+(calcd for C19H23N2O4,343.165 2),結(jié)合1D NMR數(shù)據(jù)確定其分子式為C19H22N2O4,不飽和度為10;UV(MeOH)λmax(logε)208(3.40),296(2.71)nm;IR(KBr)νmax3 340、3 168、2 923、2 821、1 653、1 595、1 520、1 491、1 278、1 210 cm-1,提示化合物結(jié)構(gòu)中存在羥基、氨基和醛基等官能團;在1H NMR譜(見表1)中,可以觀察到1個醛基質(zhì)子信號δH9.42(1H,s),1個1,4-二取代苯環(huán)質(zhì)子信號δH7.40(2H,br d,J=8.4 Hz)、6.79(2H,br d,J= 8.4 Hz),1組反式烯烴質(zhì)子信號δH7.44(1H,d,J=15.6 Hz)、6.40(1H,d,J=15.6 Hz),2個環(huán)內(nèi)烯烴質(zhì)子信號δH6.98(1H,d,J=4.2 Hz)、6.26(1H,d,J=4.2 Hz)和5個亞甲基質(zhì)子信號δH4.64(2H,s)、4.39(2H,m)、3.34(2H,m)、1.81(2H,m)、1.61(2H,m);13C NMR譜(見表1)共顯示存在19個碳信號,結(jié)合HSQC譜將其分別歸屬為2個羰基碳信號(δC180.9、169.3),12個烯烴或芳香碳信號(δC160.5、144.5、141.8、133.5、130.6、130.6、127.7、126.4、118.4、116.7、116.7、111.5)和5個亞甲基碳信號(δC56.5、46.3、40.0、29.8、27.7)。

表1 化合物1的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)(600和150 MHz,CD3OD)Table 1 1H and 13C NMR data of compound 1 (600 and 150 MHz,CD3OD)

通過對比發(fā)現(xiàn),化合物1和2(magnolamide)的核磁數(shù)據(jù)[17]十分相似,兩者相對分子質(zhì)量的差值為30,且在1的核磁譜圖中未觀察到甲氧基信號。結(jié)合1H-1H COSY譜中δH7.40(H-5/9)與6.79(H-6/8)的相關(guān)信號和HMBC譜中的相關(guān)信號可以確定化合物1的結(jié)構(gòu)(見圖1),化合物1的關(guān)鍵2D NMR相關(guān)如圖2所示。經(jīng)SciFinder檢索,確定化合物1為新的酰胺類生物堿,并將其命名為chaplupyrrolidone D?；衔?的詳細結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)原始圖譜可從本刊官網(wǎng)免費下載(www.trcw.ac.cn)。

圖1 化合物1～10的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1-10

圖2 化合物1的關(guān)鍵1H-1H COSY和HMBC相關(guān)Fig.2 Key 1H-1H COSY and HMBC correlations of compound 1

化合物2黃色油狀液體;HR-EI-MS:m/z373.175 2 [M+H]+(calcd for C20H25N2O5,373.175 8);1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:9.36(1H,s,CHO),7.43(1H,d,J=15.6 Hz,H-3),7.10(1H,d,J=2.0 Hz,H-5),7.04(1H,dd,J=8.0,2.0 Hz,H-9),6.94(1H,d,J=4.0 Hz,H-6′),6.79(1H,d,J=8.0 Hz,H-8),6.40(1H,d,J=15.6 Hz,H-2),6.22(1H,d,J=4.0 Hz,H-7′),4.60(2H,s,H-9′),4.34(2H,t,J=7.2 Hz,H-4′),3.86(3H,s,6-OCH3),3.32(2H,t,J=7.2 Hz,H-1′),1.80(2H,m,H-3′),1.58(2H,m,H-2′);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:169.1(C-1),118.8(C-2),142.0(C-3),128.2(C-4),111.4(C-5),149.2(C-6),149.7(C-7),116.4(C-8),123.1(C-9),40.0(C-1′),27.6(C-2′),29.8(C-3′),46.2(C-4′),133.4(C-5′),126.3(C-6′),111.6(C-7′),144.4(C-8′),56.4(C-9′),180.8(CHO),56.4(6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道基本一致,故鑒定化合物2為magnolamide。

化合物3白色粉末;HR-EI-MS:m/z268.134 0 [M+H]+(calcd for C17H18NO2,268.133 2);1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.54(2H,m,H-2′,H-6′),7.52(1H,d,J=15.6 Hz,H-7′),7.37(2H,H-3′,H-5′),7.04(2H,d,J=8.4 Hz,H-2,H-6),6.72(2H,d,J=8.4 Hz,H-3,H-5),6.58(1H,d,J=15.6 Hz,H-8′),3.48(2H,t,J=7.2 Hz,H-8),2.96(2H,t,J=7.2 Hz,H-7);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:131.2(C-1),130.8(C-2/6),116.3(C-3/5),157.2(C-4),35.8(C-7),42.6(C-8),168.6(C-9),136.4(C-1′),128.8(C-2′/6′),129.9(C-3′/5′),130.7(C-4′),141.7(C-7′),121.9(C-8′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道基本一致,故鑒定化合物3為N-反式桂皮酰對羥基苯乙胺。

化合物4白色粉末;HR-EI-MS:m/z284.128 8 [M+H]+(calcd for C17H18NO3,284.128 1);1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.45(1H,d,J=15.6 Hz,H-7),7.40(2H,d,J=8.4 Hz,H-2,H-6),6.80(2H,d,J=8.4 Hz,H-3,H-5),7.04(2H,d,J=8.4 Hz,H-2′,H-6′),6.70(2H,d,J=8.4 Hz,H-3′,H-5′),6.39(1H,d,J=15.6 Hz,H-8),3.45(2H,t,J=7.2 Hz,H-8′),2.74(2H,t,J=7.2 Hz,H-7′);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:127.8(C-1),130.7(C-2/6),116.8(C-3/5),160.5(C-4),141.8(C-7),118.5(C-8),169.2(C-9),131.2(C-1′),130.5(C-2′/6′),116.3(C-3′/5′),156.8(C-4′),35.8(C-7′),42.6(C-8′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道基本一致,故鑒定化合物4為N-反式對香豆酰酪胺。

化合物5淡黃色粉末;HR-EI-MS:m/z146.061 5 [M+H]+(calcd for C9H8NO,146.060 0);1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:8.30(1H,s,H-2),8.10(1H,d,J=7.6 Hz,H-4),7.52(1H,d,J=7.6 Hz,H-7),7.24(2H,m,H-5,H-6);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:138.5(C-2),118.2(C-3),123.4(C-4),122.0(C-5),120.8(C-6),112.5(C-7),137.2(C-8),124.1(C-9),184.9(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]報道基本一致,故鑒定化合物5為吲哚-3-甲醛。

化合物6淡黃色粉末;HR-EI-MS:m/z162.055 4 [M+H]+(calcd for C9H8NO2,162.055 0);1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:8.02(1H,d,J=7.2 Hz,H-8),7.95(1H,s,H-2),7.45(1H,d,J=7.2 Hz,H-5),7.16(2H,m,H-6,H-7);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:132.0(C-2),108.2(C-3),126.2(C-4),120.8(C-5),121.9(C-6),120.8(C-7),112.0(C-8),136.4(C-9),166.5(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]報道基本一致,故鑒定化合物6為吲哚-3-甲酸。

化合物7白色粉末;HR-EI-MS:m/z226.123 0 [M+H]+(calcd for C15H16NO,226.122 6);1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.69～7.21(10H,m,Ar-H),6.28(1H,br s,NH),3.73(2H,dd,J= 12.8,6.8 Hz,H-8),2.92(2H,dd,J= 13.6,6.4 Hz,H-7);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:134.7(C-1),128.5(C-2),128.5(C-3),126.7(C-4),128.6(C-5),128.6(C-6),35.6(C-7),41.2(C-8),167.6(C-9),139.0(C-1′),128.8(C-2′),128.6(C-3′),131.4(C-4′),128.6(C-5′),128.8(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[21]報道基本一致,故鑒定化合物7為N-苯甲?；?2-苯基乙胺。

化合物8白色粉末;HR-EI-MS:m/z242.119 0 [M+H]+(calcd for C15H16NO2,242.117 6);1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.76(2H,dd,J=8.0,0.8 Hz,H-3′,H-7′),7.48(1H,m,H-5′),7.40(2H,m,H-4′,H-6′),7.06(2H,d,J=8.4 Hz,H-4,H-8),6.70(2H,d,J=8.4 Hz,H-5,H-7),3.53(2H,t,J=7.6 Hz,H-1),2.80(2H,t,J=7.6 Hz,H-2);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:43.0(C-1),35.7(C-2),135.8(C-3),130.8(C-4/8),116.2(C-5/7),157.0(C-6),170.2(C-1′),131.2(C-2′),128.2(C-3′/7′),129.5(C-4′/6′),132.6(C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[22]報道基本一致,故鑒定化合物8為N-苯甲酰酪胺。

化合物9白色粉末;HR-EI-MS:m/z256.133 8 [M+H]+(calcd for C16H18NO2,256.133 2);1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.70(2H,d,J=8.4 Hz,H-3,H-7),7.50(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),7.42(2H,m,H-4,H-6),7.18(2H,d,J=7.6 Hz,H-13,H-15),6.88(2H,d,J=7.6 Hz,H-12,H-16),6.15(1H,br s,NH),3.81(3H,s,-OCH3),3.70(2H,m,H-9),2.89(2H,t,J=6.8 Hz,H-10);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:167.5(C-1),134.7(C-2),129.8(C-3/7),128.5(C-4/6),131.4(C-5),41.3(C-9),34.8(C-10),130.8(C-11),126.8(C-12/16),114.0(C-13/15),158.2(C-14),55.2(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[23]報道基本一致,故鑒定化合物9為N-benzoyltyramine methyl ether。

化合物10白色粉末;HR-EI-MS:m/z310.181 2 [M+H]+(calcd for C20H24NO2,310.180 2);1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.70(2H,d,J=8.0 Hz,H-2″,H-6″),7.48(1H,t,J=7.6 Hz,H-4″),7.40(2H,t,J=7.6 Hz,H-3″,H-5″),7.15(2H,d,J=8.4 Hz,H-2′,H-6′),6.90(2H,d,J=8.4 Hz,H-3′,H-5′),6.18(1H,br s,NH),5.50(1H,t,J=6.8 Hz,H-8′),4.52(2H,d,J=6.8 Hz,H-7′),3.70(2H,m,H-1),2.88(2H,t,J=6.8 Hz,H-2),1.81(3H,s,H-10′),1.74(3H,s,H-11′);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:41.4(C-1),34.8(C-2),130.8(C-1′),129.8(C-2′/6′),114.9(C-3′/5′),157.7(C-4′),64.8(C-7′),119.7(C-8′),138.4(C-9′),26.0(C-10′),18.3(C-11′)134.7(C-1″),126.9(C-2″/6″),128.6(C-3″/5″),131.5(C-4″),167.5(C-7″)。以上數(shù)據(jù)與文獻[24,25]報道基本一致,故鑒定化合物10為荷蒂蕓香酰胺。

2.2 抗炎活性篩選

抗炎活性測試結(jié)果表明,化合物4能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7炎癥細胞產(chǎn)生NO,其IC50值為15.27 ± 0.82 μmol/L,活性強度與陽性對照吲哚美辛(IC50= 18.36 ± 1.03 μmol/L)基本相當?；衔?、2和10表現(xiàn)出中等程度的抗炎活性,IC50值分別為34.65 ± 1.78、25.41 ± 0.94和39.57 ± 2.10 μmol/L。其余化合物均未顯示出明顯的抗炎活性(IC50>100 μmol/L)。此外,所有化合物在6.25至100 μmol/L濃度范圍內(nèi)均未表現(xiàn)出明顯的細胞毒性。

3 結(jié)論

本實驗通過現(xiàn)代色譜分離技術(shù)和波譜學(xué)方法,從假蒟根中分離鑒定了10個生物堿類化合物。其中,化合物1為新的酰胺類生物堿,除化合物5之外其余化合物均為首次從該植物中分離得到。采用LPS刺激的RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型評價分離所得化合物的抗炎活性,結(jié)果顯示化合物1、2、4和10對NO的產(chǎn)生具有抑制作用,且在測試濃度下均未表現(xiàn)出明顯的細胞毒性。本研究結(jié)果進一步豐富了假蒟根的化學(xué)成分,并初步明確了假蒟根中部分抗炎活性物質(zhì)基礎(chǔ),為該植物資源今后的開發(fā)和利用提供一定的參考和理論依據(jù)。