巖藻多糖納米硒的制備及其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的研究

陳博文,陳建平,2*,黃文浩,鐘賽意,2,李 瑞,2,宋兵兵,2,劉曉菲,2,汪 卓,2

1廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湛江 524088;2大連工業(yè)大學(xué)海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,大連 116034

目前,除心血管疾病外,癌癥已成為第二大人類死亡的誘因,由于其治療難度大、周期長(zhǎng)和治療費(fèi)用高,為人民的生活帶來沉重的負(fù)擔(dān)[1]?；熓乾F(xiàn)代西方醫(yī)學(xué)治療癌癥的主要方法之一,但由于化療藥物往往存在嚴(yán)重的副作用和耐藥性等原因,導(dǎo)致治療效果不理想。因此,研發(fā)一種廣譜的具有高效無毒副作用的抗腫瘤藥物仍是目前亟待解決的問題。

硒(selenium,Se)是一種人體必需的微量元素,在合成谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧還蛋白還原酶等過程中扮演著重要角色,參與人體的多種生命活動(dòng),對(duì)人體健康具有重要意義[2]。同時(shí),硒還具有抗氧化、抗腫瘤等多種功能活性[3]。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤患者體內(nèi)硒含量缺乏,攝入足夠的Se 能夠保護(hù)正常細(xì)胞,減少癌癥的發(fā)生[4]。然而,Se在生物體內(nèi)能夠使用的安全劑量范圍很窄,很容易因使用過量而造成中毒,因此,探究與研發(fā)安全的Se形態(tài),降低Se的毒性至關(guān)重要[5]。研究發(fā)現(xiàn),與傳統(tǒng)的Se形式相比,納米硒(selenium nanoparticles,SeNPs)由于其獨(dú)特的尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)具有更低的毒性和較好的生物利用度[6]。然而,SeNPs因其表面缺少鄰近配位的原子導(dǎo)致活性較高,在常溫下極不穩(wěn)定,易聚集形成毒性更大的單質(zhì)Se[7,8]。因此,在制備SeNPs的過程中一般會(huì)使用分散劑來增加SeNPs的分散性。多糖類分子結(jié)構(gòu)中具有羥基,能通過分子間氫鍵與Se結(jié)合,防止SeNPs聚集,因此多糖常被用于分散SeNPs[9]。目前,已經(jīng)報(bào)道的用于納米硒修飾劑的多糖包括黃芪多糖、魔芋葡聚糖等[10,11]。

巖藻多糖(fucoidan,FD)是來源于褐藻的天然水溶性多糖,由硫酸化的巖藻糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸等單糖組成[12]。研究人員發(fā)現(xiàn),巖藻多糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多種功能活性[13]。然而,目前還未見巖藻多糖修飾納米硒的相關(guān)報(bào)道。因此,本文以FD作為穩(wěn)定劑,通過氧化還原反應(yīng)制備巖藻多糖納米硒(fucoidan-selenium nanoparticles,FD-SeNPs),利用單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化其制備工藝參數(shù),并進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和抑制腫瘤細(xì)胞增殖的研究,為FD-SeNPs作為腫瘤細(xì)胞抑制劑的開發(fā)應(yīng)用提供理論數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巖藻多糖(來源于墨角藻,批號(hào):F8190,純度為95%)和亞硒酸鈉(批號(hào):S5261,純度≥98%)購于Sigma公司;抗壞血酸(批號(hào):S13001,純度為99%)購于上海源葉生物技術(shù)有限公司;胎牛血清(批號(hào):10270-106)、Dulbecco′s modified eagle medium(DMEM)高糖培養(yǎng)基(批號(hào):8123270)、0.25%胰蛋白酶溶液(批號(hào):25200072)和雙抗溶液(批號(hào):15140122)購于美國(guó)Gibco公司;二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO),(批號(hào):R012316,純度99.17%,上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司);HepG2人肝癌細(xì)胞、A549人肺癌細(xì)胞(美國(guó)ATCC細(xì)胞庫);LO2人正常肝細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫)。

1.2 儀器與設(shè)備

Zetasizer Nano ZSE馬爾文納米粒度電位儀(上海馬爾文帕納科公司);Varioskan Flash 全自動(dòng)酶標(biāo)儀、Talos F200X G2透射電子顯微鏡(美國(guó)Thermo Scientific公司);Bruker Tensor-2傅里葉變換紅外光譜儀(德國(guó) Bruker公司);FD8508真空冷凍干燥機(jī)(韓國(guó)ILSHIN公司);N-4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本Tokyo Rikakikai公司);Agilent 7500CX電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司);蔡司Sigma 300掃描電子顯微鏡、Smartedx能量色散X射線能譜儀(德國(guó)Zeiss公司);Rigaku SmartLab 9 kW X射線衍射儀(日本Rigaku理學(xué)公司)。

1.3 方法

1.3.1 FD-SeNPs的制備

參考Zhang等[5]的方法制備FD-SeNPs。具體制備過程如下:將一定量的FD溶于蒸餾水中得到不同濃度的FD溶液。將Vc溶液與Na2SeO3溶液加入FD溶液中,Na2SeO3溶液、Vc溶液和FD溶液的體積比為4∶4∶1,在不同溫度下攪拌不同時(shí)間后,將反應(yīng)液經(jīng)透析袋(截留分子量為8 000～14 000)透析48 h。通過粒徑分析,確定了FD-SeNPs的最佳制備工藝,最終的溶液經(jīng)旋蒸后凍干,得到FD-SeNPs。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

在FD濃度為0.6 mg/mL、反應(yīng)溫度為45 ℃和Vc與Na2SeO3摩爾比為8∶1的條件下,采用馬爾文納米粒度電位儀考察不同時(shí)間(1、2、3、4和5 h)對(duì)FD-SeNPs粒徑的影響;在FD濃度為0.6 mg/mL、反應(yīng)時(shí)間為2 h和Vc與Na2SeO3摩爾比為8∶1的條件下,采用馬爾文納米粒度電位儀考察不同溫度(25、35、45、55和65 ℃)對(duì)FD-SeNPs粒徑的影響;在FD濃度為0.6 mg/mL、反應(yīng)溫度為45 ℃和反應(yīng)時(shí)間為2 h的條件下,采用馬爾文納米粒度電位儀考察不同Vc與Na2SeO3摩爾比(Vc∶Na2SeO3=2∶1、4∶1、8∶1、16∶1、32∶1)對(duì)FD-SeNPs粒徑的影響;在反應(yīng)溫度為45 ℃、反應(yīng)時(shí)間為2 h和Vc與Na2SeO3摩爾比為16∶1的條件下,采用馬爾文納米粒度電位儀考察不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL)的FD對(duì)FD-SeNPs粒徑的影響。

1.3.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上,以巖藻多糖濃度、摩爾比、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度為因素,FD-SeNPs的粒徑為評(píng)價(jià)指標(biāo),設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.3.4 FD-SeNPs的結(jié)構(gòu)鑒定

1.3.4.1 硒含量的測(cè)定

參照Chen等[14]的方法進(jìn)行測(cè)定。具體過程如下:凍干的樣品在雙氧水和硝酸的作用下進(jìn)行微波消解,然后采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測(cè)定樣品中的硒含量,具體參數(shù)如下:入射功率為1 550 W,等離子氣體流量為15 L/min,氦流量為4.0 mL/min,霧化室溫度為2 ℃。

1.3.4.2 粒徑及電位的測(cè)定

采用馬爾文納米粒度電位儀對(duì)樣品的粒徑及電位進(jìn)行檢測(cè)。具體過程如下:取適量透析后的反應(yīng)液置于樣品池中,在檢測(cè)溫度為25 ℃,平衡時(shí)間為120 s的條件下進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4.3 掃描電子顯微鏡及能量色散X射線譜儀測(cè)定

取少量樣品置于導(dǎo)電膠上固定,經(jīng)噴金處理后,在掃描電子顯微鏡中進(jìn)行不同放大倍數(shù)觀察,并使用Smartedx能量色散X射線譜儀對(duì)樣品的表面元素進(jìn)行分析。

1.3.4.4 透射電子顯微鏡測(cè)定

采用透射電子顯微鏡觀察樣品的形態(tài)大小。將樣品溶液滴入銅膜網(wǎng)格上,用去離子水洗滌,待干燥后,觀察其形態(tài)。

1.3.4.5 傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定

將溴化鉀置于紅外燈下干燥4 h,然后將溴化鉀與樣品以100∶1的比例進(jìn)行研磨,混合均勻后,在油壓機(jī)上進(jìn)行壓片,在4 000～400 cm-1的波數(shù)下對(duì)樣品進(jìn)行掃描。

1.3.4.6 X射線衍射儀測(cè)定

取適量樣品裝進(jìn)樣品池,采用銅靶作為測(cè)試靶材,設(shè)定X射線衍射儀的波長(zhǎng)為0.154 nm,電壓40 kV,電流40 mA,掃描范圍為5°～90°,掃描速度為5°/min對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)量。

1.3.5 FD-SeNPs抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性測(cè)定

1.3.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將復(fù)蘇后的A549細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和LO2細(xì)胞置于含10%胎牛血清和1%雙抗溶液的DMEM高糖完全培養(yǎng)基中,然后放置在5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),經(jīng)換液、傳代穩(wěn)定后,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于MTT實(shí)驗(yàn)。

1.3.5.2 FD-SeNPs對(duì)HepG2細(xì)胞和A549細(xì)胞存活率的影響

將細(xì)胞密度為4 × 104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液接種于96孔板,每孔100 μL,并將其放入37 ℃、濃度5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)組中往96孔板加入不同濃度(250、500 μg/mL)的SeNPs、FD和FD-SeNPs溶液,每孔100 μL。而空白組和對(duì)照組中每孔分別加入100 μL高糖DMEM培養(yǎng)基和100 μL的細(xì)胞懸液。經(jīng)不同方式處理的細(xì)胞繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,加入20 μL MTT(5 mg/mL) 避光孵育4 h,去除上清液,加入150 μL DMSO,震蕩10 min后,在570 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)樣品的OD值。設(shè)陰性對(duì)照組的OD值為100 %,計(jì)算公式如下:

細(xì)胞存活率=

(OD處理組-OD空白組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)×100%

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 制備FD-SeNPs的單因素實(shí)驗(yàn)

固定FD濃度為0.6 mg/mL,反應(yīng)溫度為45 ℃,Vc與Na2SeO3摩爾比為8∶1,考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)FD-SeNPs粒徑的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1A所示。由圖1A可知,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為2 h時(shí),FD-SeNPs的粒徑最小。進(jìn)一步延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間,FD-SeNPs粒徑反而增大,這可能是由于SeNPs的聚集導(dǎo)致粒徑增大,故選擇2 h作為最佳的反應(yīng)時(shí)間。固定FD濃度為0.6 mg/mL,反應(yīng)時(shí)間為2 h,Vc與Na2SeO3摩爾比為8∶1,考察反應(yīng)溫度對(duì)FD-SeNPs粒徑的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1B所示。由圖1B可知,當(dāng)反應(yīng)溫度從25 ℃升高到45 ℃時(shí),FD-SeNPs粒徑呈逐漸下降的趨勢(shì),隨后,進(jìn)一步提高溫度到55 ℃和65 ℃時(shí),其粒徑呈上升趨勢(shì),這可能是溫度過高導(dǎo)致體系中粒子運(yùn)動(dòng)加快,使產(chǎn)物更易聚集和沉淀,從而使粒徑變大,該結(jié)果與Song等[15]的研究結(jié)果一致。因此,選擇45 ℃作為最佳反應(yīng)溫度。固定FD濃度為0.6 mg/mL,反應(yīng)溫度為45 ℃,反應(yīng)時(shí)間為2 h,考察Vc與Na2SeO3的摩爾比對(duì)FD-SeNPs粒徑的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1C所示。由圖1C可知,當(dāng)摩爾比從2∶1增加到16∶1時(shí),FD-SeNPs的粒徑呈逐漸下降趨勢(shì),這可能是一定范圍內(nèi)過量Vc可以增加反應(yīng)的接觸面積,加快反應(yīng)速度,從而形成較小尺寸的納米顆粒[16]。然而,當(dāng)進(jìn)一步增加摩爾比,其粒徑顯著增大,這可能是過量的Vc附著在SeNPs表面,導(dǎo)致SeNPs互相集聚,從而使粒徑增大,故選擇16∶1作為最佳反應(yīng)摩爾比。固定反應(yīng)溫度為45 ℃,反應(yīng)時(shí)間為2 h,摩爾比為16∶1,考察FD濃度對(duì)FD-SeNPs粒徑的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1D所示,當(dāng)FD濃度從0.2 mg/mL 增加至0.6 mg/mL時(shí),FD-SeNPs的粒徑呈逐漸下降趨勢(shì),但當(dāng)FD濃度大于0.6 mg/mL時(shí),體系中的納米硒的粒徑會(huì)顯著增大,這可能是過量的FD集聚在納米硒表面,導(dǎo)致其顆粒尺寸變大[17]。因此,選擇0.6 mg/mL的FD作為最佳制備濃度。根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)得到最佳的制備工藝參數(shù)為反應(yīng)時(shí)間為2 h、反應(yīng)溫度為45 ℃、反應(yīng)摩爾比為16∶1和FD濃度為0.6 mg/mL。

圖1 不同反應(yīng)條件對(duì)FD-SeNPs粒徑的影響Fig.1 Effect of different reaction conditions on particle size of FD-SeNPs注:不同字母代表差異顯著(P<0.05)。Note:Different letters represent significant differences (P<0.05).

2.2 制備FD-SeNPs的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析

根據(jù)表1開展實(shí)驗(yàn),得到響應(yīng)面結(jié)果如表2所示。利用Design Expert 13軟件對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行回歸分析,建立了FD-SeNPs粒徑(Y)與巖藻多糖濃度(A)、反應(yīng)溫度(B)、反應(yīng)時(shí)間(C)、摩爾比(D)與的二次回歸方程:Y=93.65+0.085A+6.50B+6.86C+3.94D-1.75AB+6.73AC-3.50AD-4.92BC+0.095BD-4.71CD-0.4452A2+0.7048B2+7.59C2+8.54D2。方差分析結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@著,失擬項(xiàng)不顯著,因素B、C、D的P<0.01,表明反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、摩爾比對(duì)粒徑的影響較顯著,各因素對(duì)粒徑的影響順序?yàn)榉磻?yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間>摩爾比>FD濃度。

表2 回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance of regression model

2.2.2 各因素響應(yīng)面圖分析

各因素交互作用結(jié)果如圖2所示,反應(yīng)時(shí)間與FD濃度對(duì)粒徑交互影響中,在濃度一定時(shí),響應(yīng)面圖中的粒徑隨著時(shí)間的增大而先減小后增大,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間一定時(shí),粒徑隨著FD濃度的增大而減小;在反應(yīng)溫度或時(shí)間一定的條件下,粒徑隨著另一個(gè)因素的增大而增大;在反應(yīng)時(shí)間與摩爾比對(duì)粒徑的交互影響中,在反應(yīng)時(shí)間一定的條件下,粒徑隨著摩爾比的增大先減小后增大,當(dāng)摩爾比一定時(shí),粒徑隨著時(shí)間的增大而增大。各因素間的等高線圖趨向橢圓,表明因素間的交互影響較大。分析響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,FD-SeNPs的最佳工藝參數(shù)如下:反應(yīng)溫度為35 ℃、反應(yīng)時(shí)間為1 h、抗壞血酸與亞硒酸鈉的摩爾比為13.64∶1、FD濃度為0.8 mg/mL,此時(shí)的粒徑的理論值為77.58 nm。

圖2 不同因素間交互作用對(duì)FD-SeNPs粒徑影響的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.2 Response surface and contour diagrams of the effects of interactions between different factors on the particle size of FD-SeNPs

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了實(shí)際實(shí)驗(yàn)的可操作性,設(shè)置反應(yīng)溫度為35 ℃、反應(yīng)時(shí)間為1 h、抗壞血酸與亞硒酸鈉的摩爾比為14∶1、FD濃度為0.8 mg/mL,在此條件下進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示FD-SeNPs粒徑為(83.40 ±0.55)nm,該值與理論預(yù)測(cè)值(77.58 nm)接近,表明建立的該響應(yīng)面模型能較好地優(yōu)化各因素對(duì)其粒徑的影響。在此條件下,制備得到的FD-SeNPs電位為(-31.89 ± 0.47)mV,經(jīng)ICP-MS檢測(cè)硒含量為29.93%,該結(jié)果相比Jiao等[10]得到的黃芪多糖納米硒復(fù)合物中的硒含量更高。

2.3 FD-SeNPs的結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 FD-SeNPs的粒徑與電位分布

FD-SeNPs和SeNPs的粒徑與電位分布如圖3所示。由圖3A可知,SeNPs的粒徑分布出現(xiàn)在68～142 nm和255～712 nm范圍內(nèi),說明其粒徑大小分布較寬且不均一。而FD-SeNPs的粒徑分布只在44～190 nm出現(xiàn),說明其粒徑分布比較集中且大小比較均一。同時(shí),SeNPs的平均粒徑為848.90 nm,經(jīng)過FD修飾之后,SeNPs的平均粒徑從848.90 nm降低到83.45 nm,表明FD能夠阻止SeNPs的聚集從而降低其粒徑。而且,FD-SeNPs的電位(-32.80 mV)絕對(duì)值大于SeNPs的電位(-24.40 mV)絕對(duì)值(見圖3B),表明FD修飾SeNPs后能顯著提高SeNPs的穩(wěn)定性。

圖3 FD-SeNPs和SeNPs的粒徑(A)與電位(B)分布圖Fig.3 Particle size(A) and Zeta potential(B) distributions of FD-SeNPs and SeNPs

2.3.2 SEM分析FD-SeNPs的表面形貌

采用SEM對(duì)FD-SeNPs的表面形貌進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。由圖4A可知,SeNPs呈現(xiàn)不規(guī)則的棒狀聚集體,表明SeNPs易聚集,分散性差,與Mu[8]報(bào)道的結(jié)果相符。而FD呈現(xiàn)出表面疏松的片狀結(jié)構(gòu)(見圖4B),經(jīng)FD修飾SeNPs之后呈現(xiàn)出單個(gè)完整分散的球形納米粒(見圖4C),表明FD能夠有效阻止SeNPs聚集。

圖4 SeNPs(A)、FD(B) 和FD-SeNPs(C)的掃描電鏡圖Fig.4 SEM photographs of SeNPs(A),FD(B) and FD-SeNPs(C)

2.3.3 TEM分析FD-SeNPs的微觀形態(tài)

采用TEM對(duì)FD-SeNPs的微觀形態(tài)進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。由圖5A可知,SeNPs呈現(xiàn)不規(guī)則的棒條狀結(jié)構(gòu),且粒子之間相互黏連,這與SEM的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖4A)相一致。而FD呈現(xiàn)出不規(guī)則的片狀結(jié)構(gòu)(見圖5B)。SeNPs經(jīng)FD修飾后呈現(xiàn)出分散性較好的均一球形顆粒(見圖5C),表明FD的加入能阻止SeNPs聚集并提高其分散性。

圖5 SeNPs(A)、FD(B)和FD-SeNPs(C)的透射電鏡圖Fig.5 TEM photographs of SeNPs(A),FD(B) and FD-SeNPs(C)

2.3.4 FD-SeNPs的表面元素分析

對(duì)FD-SeNPs的表面元素進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。由圖6A可知,SeNPs中C、O和Se百分比分別為8.52%、0.43%和90.99%。FD-SeNPs中C、O和Se元素百分比分別為17.70%、3.41%和77.59%(見圖6B),表明添加FD修飾SeNPs之后升高了C和O元素的百分比,進(jìn)一步證實(shí)了FD成功地結(jié)合在SeNPs的表面上[18]。

圖6 SeNPs(A)和FD-SeNPs(B)的元素分析Fig.6 EDX spectra of SeNPs(A) and FD-SeNPs(B)

2.3.5 FT-IR分析FD與SeNPs的結(jié)合形式

由圖7可知,FD在3450 cm-1處出現(xiàn)了羥基O-H的伸縮振動(dòng)峰,在1 637和1 394 cm-1附近出現(xiàn)了羰基C=O和羧基COO-的伸縮振動(dòng)峰,表明FD存在糖醛酸[14,19]。在1 254、842和581 cm-1附近分別出現(xiàn)了S=O的伸縮振動(dòng)峰、C-4軸向位置硫酸鹽引起的特征吸收峰和O=S=O的彎曲振動(dòng)峰,表明FD含有硫酸基團(tuán)[20-22]。FD-SeNPs在3 418、1 614、1 393、1 225、824和587 cm-1出現(xiàn)了與FD相似的吸收峰,表明FD與SeNPs之間沒有形成新的共價(jià)鍵。然而,FD-SeNPs中有部分峰出現(xiàn)了紅移,O-H的伸縮振動(dòng)峰從3 450 cm-1移至3 418 cm-1,推測(cè)FD的O-H通過共軛效應(yīng)與硒結(jié)合,穩(wěn)定分散納米硒。

圖7 SeNPs、FD和FD-SeNPs的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.7 FT-IR diagrams of SeNPs,FD and FD-SeNPs

2.3.6 XRD分析FD-SeNPs的晶型

X射線衍射峰的強(qiáng)度和銳度可在一定程度上反映樣品的結(jié)晶性質(zhì),因此在紅外光譜的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步采用XRD表征FD-SeNPs的形成,實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖8所示。由圖8可知,SeNPs的X射線衍射圖在20～40°和40～60°的范圍內(nèi)出現(xiàn)兩個(gè)峰形較寬的衍射峰,表明SeNPs以無定形的形式存在,這結(jié)果與Chen等[14]的研究結(jié)果一致。同時(shí),FD在15～30°范圍內(nèi)出現(xiàn)一個(gè)寬的衍射峰,表明FD也是無定形結(jié)構(gòu),這與其他植物多糖的研究結(jié)果一致[23]。而FD-SeNPs的峰形與FD類似,說明FD-SeNPs也主要以無定形的形式存在,但是相比FD和SeNPs,其衍射峰的位置和強(qiáng)度都發(fā)生了變化,這表明FD與SeNPs結(jié)合后形成了FD-SeNPs。

圖8 FD-SeNPs、SeNPs、FD的X射線衍射圖Fig.8 X-ray diffraction patterns of FD-SeNPs,SeNPs and FD

2.4 FD-SeNPs的體外抗腫瘤活性測(cè)定

采用MTT法考察不同濃度的FD、SeNPs和FD-SeNPs對(duì)HepG2細(xì)胞和A549細(xì)胞存活率的影響,以LO2正常肝細(xì)胞做對(duì)照,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示。由圖9A和9B可知,在250～500 μg/mL范圍內(nèi),SeNPs抑制A549細(xì)胞和HepG2細(xì)胞增殖的效果不佳。然而,FD-SeNPs能夠顯著抑制A549細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的增殖。當(dāng)FD-SeNPs濃度為500 μg/mL時(shí),A549細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的存活率分別從對(duì)照組的100%降低為(46.91 ± 1.41)%和(27.53 ± 2.77)%。上述結(jié)果表明,FD修飾SeNPs之后能夠顯著提高SeNPs的抗腫瘤活性。同時(shí),FD-SeNPs對(duì)LO2正常肝細(xì)胞的存活率為(71.00 ± 3.16)%,顯著高于腫瘤細(xì)胞的存活率(見圖9C),說明FD-SeNPs具有較好的細(xì)胞選擇性。

圖9 不同濃度FD、SeNPs和FD-SeNPs對(duì)不同細(xì)胞存活率的影響Fig.9 Effects of different concentrations of FD,SeNPs and FD-SeNPs on the cell viability of different cells注:不同字母代表差異顯著(P<0.05)Note:Different letters represent significant differences (P<0.05)

3 討論與結(jié)論

本文通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到了FD-SeNPs的最佳制備工藝參數(shù)為反應(yīng)溫度為35 ℃、反應(yīng)時(shí)間為1 h、抗壞血酸與亞硒酸鈉的摩爾比為14∶1、FD濃度為0.8 mg/mL,在此條件下,測(cè)得其粒徑最小為(83.40±0.55)nm,電位為(-31.89±0.47)mV,硒含量達(dá)29.93%。進(jìn)一步對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn),FD通過羥基吸附在SeNPs表面形成均一球形的納米粒子,說明多糖的極性基團(tuán)可以有效的抑制SeNPs的聚集[17,24]。

目前研究發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤機(jī)理主要包括抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移或侵襲、增強(qiáng)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)能力等途徑實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用[25,26]。研究表明,以多糖為模板的SeNPs能夠促進(jìn)相關(guān)凋亡蛋白和自噬標(biāo)志性蛋白的表達(dá),從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬[27]。本研究的體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),FD修飾SeNPs能顯著提高SeNPs抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力,且具有較好的細(xì)胞選擇性,但其具體作用機(jī)理有待深入研究。