基于多元計(jì)量法的川澤瀉藥材商品等級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)研究

趙璐璐,先 蕊,趙文琪,鄭 雯,蘭志瓊,潘曉麗,李 敏

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/現(xiàn)代中藥產(chǎn)業(yè)學(xué)院 西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 611137

澤瀉為澤瀉科植物東方澤瀉Alismaorientale(Sam.) Juzep.或澤瀉Alismaplantago-aquaticaLinn.的干燥塊莖。具有利水滲濕、泄熱、化濁降脂的功效[1]。按產(chǎn)地主要分為“建澤瀉”和“川澤瀉”。近年來(lái),川澤瀉年均產(chǎn)量約1.7萬(wàn)噸,占市場(chǎng)澤瀉藥材總量的80%以上[2],已成為我國(guó)澤瀉藥材的主流商品。且質(zhì)量上乘,為四川著名道地藥材[3]。

長(zhǎng)期以來(lái),無(wú)論是市場(chǎng)、相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)還是現(xiàn)代研究,均以“建澤瀉”為中心。2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》(簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)澤瀉基原已作修訂,川澤瀉基原澤瀉Alismaplantago-aquaticaLinn.正式收載入法定標(biāo)準(zhǔn)。但現(xiàn)行藥材商品標(biāo)準(zhǔn)包括1984年《76種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》[4]和2018年《中藥材商品規(guī)格等級(jí)》[5]中澤瀉藥材商品標(biāo)準(zhǔn)的來(lái)源項(xiàng)中仍僅收載了建澤瀉基原東方澤瀉Alismaorientate(Sam.) Juzep.,亟待修訂。據(jù)本草考證及現(xiàn)代研究[6,7],川澤瀉與建澤瀉在基原、產(chǎn)地及栽培、加工技術(shù)方面均不同,因此在藥材品質(zhì)上有顯著差異。故隨著澤瀉生產(chǎn)格局和藥材法定標(biāo)準(zhǔn)的修訂,按照藥材商品標(biāo)準(zhǔn)“基于藥典”“基于市場(chǎng)”原則,亟待加強(qiáng)川澤瀉藥材商品品質(zhì)研究,挖掘出能體現(xiàn)川澤瀉道地藥材品質(zhì)特征的等級(jí)劃分指標(biāo),并進(jìn)一步建立標(biāo)準(zhǔn)。

然而,現(xiàn)行澤瀉藥材商品標(biāo)準(zhǔn)仍僅以外觀性狀劃分等級(jí)?；瘜W(xué)成分是中藥發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[8]。故應(yīng)在藥材“辨狀論質(zhì)”研究基礎(chǔ)上,結(jié)合現(xiàn)代技術(shù)及成果,在藥材等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)中的應(yīng)用引入能體現(xiàn)中藥藥效的內(nèi)在品質(zhì)指標(biāo)及測(cè)定方法。但中藥材成分復(fù)雜,采用一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法往往難以全面評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量。現(xiàn)代統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)的高速發(fā)展為我們實(shí)現(xiàn)多元分析,挖掘中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了可靠方法。不同的方法因原理、適用范圍不同,綜合應(yīng)用可使分析結(jié)果更加系統(tǒng)、全面。因此,本文首次結(jié)合描述統(tǒng)計(jì)法、方差分析法篩選川澤瀉外觀性狀指標(biāo);選用熵權(quán)法計(jì)算內(nèi)在成分各指標(biāo)權(quán)重,以此權(quán)重作為灰色關(guān)聯(lián)度分辨系數(shù)的客觀賦值,進(jìn)而通過(guò)計(jì)算關(guān)聯(lián)度的大小對(duì)內(nèi)在成分各指標(biāo)進(jìn)行排序、篩選;采用相關(guān)性分析法分析川澤瀉藥材外觀性狀和內(nèi)在藥效成分的相關(guān)性,篩選出能綜合體現(xiàn)川澤瀉藥材質(zhì)量的等級(jí)劃分指標(biāo)。并進(jìn)一步通過(guò)K-均值聚類(lèi)分析法對(duì)川澤瀉藥材等級(jí)進(jìn)行劃分,擬定川澤瀉藥材商品等級(jí)標(biāo)準(zhǔn),為促進(jìn)澤瀉藥材“優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)”體系的形成及澤瀉產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展提供技術(shù)參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

于2021年和2022年收集川澤瀉藥材樣品共42批,其中,23批樣品采集于四川眉山、樂(lè)山等主要產(chǎn)地,19批樣品收集自中藥材專業(yè)市場(chǎng)。經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)蘭志瓊副教授鑒定為澤瀉科植物澤瀉Alismaplantago-aquaticaLinn.的干燥塊莖,樣品信息見(jiàn)表1,留樣樣品編號(hào)(20220701)存放于成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥標(biāo)本中心。

表1 川澤瀉樣品信息Table 1 Samples information of Alismatis Rhizoma

1.2 儀器與試藥

BT125D型萬(wàn)分之一分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國(guó)賽默飛公司);GB1214-85游標(biāo)卡尺(貴州西南工具有限公司);CM-5分光測(cè)色計(jì)(柯尼卡美能達(dá)有限公司);A580型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海翱藝儀器有限公司)。

澤瀉醇B(AB)、23-乙酰澤瀉醇B(23-AB)、23-乙酰澤瀉醇C(23-AC)、D(+)-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品(成都曼斯特生物科技有限公司,批號(hào)分別為MUST-21062305,MUST-22070411,MUST-22032321,MUST -22030214,純度均>98.0%);乙腈為色譜純;其他試劑均為分析純;水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 川澤瀉外觀性狀指標(biāo)選擇與測(cè)定

按1984年《76種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》澤瀉項(xiàng)下“川澤瀉”等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[4],將42批川澤瀉藥材樣品以單個(gè)重作初步等級(jí)劃分,共劃分為73組,其中一等品44組,二等品29組。

按照中藥“辨狀論質(zhì)”理論,川澤瀉以個(gè)大、色白者為佳[9]。結(jié)合產(chǎn)地和市場(chǎng)調(diào)研結(jié)果,選擇川澤瀉藥材單個(gè)重、長(zhǎng)度、直徑、粉末色度值L*、a*、b*作為潛在外觀性狀指標(biāo)進(jìn)行客觀測(cè)量。每組隨機(jī)選取10個(gè)樣品,其中,長(zhǎng)度、直徑用游標(biāo)卡尺測(cè)量,單個(gè)重用電子天平測(cè)量,重復(fù)3次,取其平均值。引入CIELAB色度空間技術(shù)測(cè)定粉末色度值L*、a*、b*,其中L*表示明度,a*表示紅綠方向,+a*表示紅方向,-a*為綠方向。b*表示黃藍(lán)方向,+b*為黃方向,-b*為藍(lán)方向。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 川澤瀉樣品性狀指標(biāo)量化測(cè)定結(jié)果Table 2 Quantitative determination results of appearance traits of Alismatis Rhizoma

2.2 川澤瀉藥材內(nèi)在品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

現(xiàn)代研究表明,三萜類(lèi)、多糖類(lèi)均為澤瀉藥材的藥效成分[10-12],三萜類(lèi)具有抗肝纖維化、抗炎作用,多糖類(lèi)具有抗氧化作用。川澤瀉藥材中AB含量較高,為建澤瀉的6倍[13],且AB在體外可有效抑制4T1乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,為川澤瀉潛在質(zhì)量標(biāo)志物。故在2020年《中國(guó)藥典》規(guī)定的浸出物及23-AB、23-AC的總含量測(cè)定的基礎(chǔ)上,結(jié)合川澤瀉藥材內(nèi)在品質(zhì)特征,增加AB、總?cè)?、總多糖含?首次將6個(gè)化學(xué)指標(biāo)作為川澤瀉內(nèi)在品質(zhì)的待篩選指標(biāo)。

2.2.1 浸出物測(cè)定

參照《中國(guó)藥典》四部通則2201浸出物測(cè)定法(熱浸法)及一部澤瀉項(xiàng)下規(guī)定方法,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 川澤瀉樣品內(nèi)在品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Table 3 Results of measurement of intrinsic quality index of Alismatis Rhizoma

2.2.2 23-AB、23-AC、AB的含量測(cè)定

參照課題組前期建立方法[14]對(duì)川澤瀉藥材3種三萜類(lèi)成分進(jìn)行含量測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2.2.1 色譜條件

色譜柱:Agilengt ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:水(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0～40 min,45%～100%B);流速:1 mL/min;柱溫:35 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):208、246 nm;進(jìn)樣量:20 μL。對(duì)照品、供試品溶液HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2.2.2 供試品溶液制備

取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約1.0 g,精密稱定,置150 mL具塞錐形瓶中,精密加入乙腈25 mL,密塞,稱定重量,超聲處理30 min(40 kHz,250 W),放冷,再稱定重量,用乙腈補(bǔ)足減失的重量,揺勻,濾過(guò),取續(xù)濾液過(guò)0.45 μm微孔濾膜,即得供試品溶液。

2.2.2.3 對(duì)照品溶液制備

精密稱定23-AB、23-AC、AB對(duì)照品適量,精密稱定,加乙腈制成濃度分別為0.202、0.051、0.252 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2.4 線性關(guān)系考察

依次梯度稀釋對(duì)照品溶液,按“2.2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以各對(duì)照品質(zhì)量濃度(X,mg/mL)為橫坐標(biāo),峰面積(Y,mAU*min)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 線性關(guān)系考察結(jié)果Table 4 Results of linear relationship investigation

2.2.3 總?cè)坪繙y(cè)定

參考課題組前期建立方法[14],以AB為對(duì)照品,測(cè)定川澤瀉樣品總?cè)坪?結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2.3.1 對(duì)照品溶液的制備

取AB對(duì)照品適量,精密稱定,加無(wú)水乙醇制成0.5 mg/mL的溶液,即得。

2.2.3.2 供試品溶液的制備

取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約0.5 g,精密稱定,置100 mL具塞錐形瓶中,精密加入無(wú)水乙醇20 mL,密塞,稱定重量,超聲提取15 min,冷卻,再次稱定重量,用無(wú)水乙醇補(bǔ)足失重,搖勻,濾過(guò),即得。

2.2.3.3 吸收波長(zhǎng)的選擇

精密吸取AB對(duì)照品溶液、川澤瀉樣品溶液300 μL,分別置于10 mL容量瓶中,加300 μL 5%香草醛冰乙酸溶液,800 μL高氯酸,50 ℃水浴5 min,立即冰水浴至室溫,置于10 mL容量瓶中,加冰乙酸稀釋至刻度,在410～700 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行掃描,發(fā)現(xiàn)對(duì)照品及樣品溶液均在555 nm左右吸光度最大(見(jiàn)圖2)。因此,選擇555 nm作為最大吸收波長(zhǎng)。

圖2 AB對(duì)照品(A)和川澤瀉總?cè)茦悠?B)紫外吸收光譜Fig.2 Ultraviolet absorption spectra of AB reference (A) and total triterpenoid samples (B) of Alismatis Rhizoma

2.2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密吸取對(duì)照品溶液1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 μL至5 mL容量瓶中,加無(wú)水乙醇至刻度,搖勻,以相應(yīng)的試劑為空白,按“2.2.3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行制備,在555 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A),以AB濃度c(mg/mL)為橫坐標(biāo),以吸光度為縱坐標(biāo),得線性方程A=0.314 3c+0.043 9(R2=0.999 3),線性范圍為0.104～0.467 mg/mL,表明AB在范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 總多糖含量測(cè)定

參照課題組前期建立方法[14],以D(+)-無(wú)水葡萄糖為對(duì)照品,測(cè)定川澤瀉樣品總多糖含量,結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2.4.1 對(duì)照品溶液的制備

取D(+)-無(wú)水葡萄糖適量,精密稱定,加水制成1 mg/mL的溶液,即得。

2.2.4.2 供試品溶液的制備

取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約1.0 g,精密稱定,置于250 mL具塞錐形瓶中,精密加入蒸餾水100 mL,加熱回流2 h,離心(10 000 r/min)5 min,過(guò)濾,精密量取濾液2 mL,置于50 mL離心管中,精密加入無(wú)水乙醇10 mL,置于4 ℃冰箱冷藏12 h,離心(10 000 r/min)5 min,過(guò)濾,沉淀加入5 mL蒸餾水溶解,溶液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,加蒸餾水定容,搖勻,即得。

2.2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密吸取對(duì)照品溶液1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 μL至5 mL容量瓶中,加蒸餾水稀釋至刻度,搖勻,以相應(yīng)的試劑為空白,分別吸取2 mL,置于具塞試管中,加5%苯酚溶液1 mL,搖勻,再加入濃硫酸5 mL,60 ℃水浴20 min,取出后立即冰水浴5 min,即得。在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A),以D(+)-無(wú)水葡萄糖濃度c(mg/mL)為橫坐標(biāo),以吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得線性方程A=6.825 4c+0.118 1(R2=0.999 3),線性范圍為0.141～0.454 mg/mL,表明D(+)-無(wú)水葡萄糖在范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 基于多元計(jì)量法篩選川澤瀉等級(jí)劃分指標(biāo)

測(cè)定結(jié)果顯示有4組川澤瀉藥材樣品(編號(hào)分別為7、11、53、70)浸出物及指標(biāo)成分23-AB、23-AC總含量不符合藥典規(guī)定,應(yīng)予剔除。故基于69組質(zhì)量合格樣品測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,篩選川澤瀉等級(jí)劃分指標(biāo)、建立等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

2.3.1 外觀性狀指標(biāo)的篩選

2.3.1.1 描述統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)川澤瀉藥材外觀性狀指標(biāo)進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)分析,并采用Origin繪圖軟件繪制小提琴圖,具體見(jiàn)圖3。

圖3 川澤瀉藥材外觀性狀小提琴圖Fig.3 Violin diagram of the appearance traits of Alismatis Rhizoma

小提琴圖中,長(zhǎng)度代表除異常點(diǎn)外指標(biāo)數(shù)值范圍,較寬部分代表觀測(cè)取值的概率較高。采用此圖可反映川澤瀉不同批次間外觀性狀各指標(biāo)的變化情況。由圖3可知,除異常點(diǎn)外,川澤瀉單個(gè)重10.00～45.00 g,長(zhǎng)度在2.00～7.00 cm,直徑在2.00～6.00 cm,L*值在65.00～85.00,a*值在0.00～9.00,b*值在10.00～30.00,概率最高處分別在20.00 g、5.00 cm、4.00 cm、80.00、2.00、20.00左右。且不同批次間川澤瀉單個(gè)重?cái)?shù)值范圍最大,表明不同批次單個(gè)重差異最大,故可考慮單個(gè)重作為川澤瀉外觀性狀等級(jí)劃分指標(biāo)。

2.3.1.2 方差分析

方差分析可用于研究一個(gè)或多個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)過(guò)程中某項(xiàng)指標(biāo)的影響,用于比較某項(xiàng)因素各個(gè)水平之間是否具有顯著性差異。本文利用SPSS21.0軟件,以川澤瀉外觀性狀作為因素進(jìn)行單因素方差分析,將其分為單個(gè)重、長(zhǎng)度、直徑、L*、a*、b*6個(gè)水平,以此對(duì)川澤瀉藥材外觀性狀指標(biāo)進(jìn)行顯著性差異分析,結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 川澤瀉藥材外觀性狀的方差分析Table 5 Analysis of variance of the appearance traits of Alismatis Rhizoma

由表5可知,單個(gè)重的F值最大,為467.55,其次為長(zhǎng)度和直徑,分別為134.92和72.74,且單個(gè)重、長(zhǎng)度、直徑均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。色度值L*、a*、b*的F值均較小,且無(wú)顯著性差異,不宜作為川澤瀉商品等級(jí)劃分的評(píng)價(jià)指標(biāo)。因此,可優(yōu)先選取單個(gè)重、長(zhǎng)度作為川澤瀉外觀性狀等級(jí)劃分指標(biāo)。

綜上,結(jié)合描述統(tǒng)計(jì)法、方差分析結(jié)果,基于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)用性原則考慮指標(biāo)測(cè)定方法的簡(jiǎn)易程度,選取單個(gè)重、長(zhǎng)度作為川澤瀉藥材商品等級(jí)劃分的外觀性狀指標(biāo)。

2.3.2 內(nèi)在化學(xué)指標(biāo)的篩選

2.3.2.1 熵權(quán)法計(jì)算化學(xué)指標(biāo)權(quán)重

熵權(quán)法是根據(jù)各指標(biāo)的熵值所提供的信息量來(lái)決定各指標(biāo)權(quán)重的客觀賦值方法,其賦值原理為根據(jù)某指標(biāo)的全體數(shù)據(jù)值之間的差異程度來(lái)反映指標(biāo)的重要程度。指標(biāo)的差異程度越大,表明該指標(biāo)在評(píng)價(jià)系統(tǒng)的作用越大。熵值是對(duì)系統(tǒng)無(wú)序程度的度量,用于表示某種能量在空間分布的均勻程度,分布越不均勻則熵值越小,指標(biāo)的離散程度越大,該指標(biāo)在綜合評(píng)價(jià)中所占權(quán)重越大,即該指標(biāo)越重要。由于川澤瀉藥材內(nèi)在指標(biāo)成分較多,且重要程度未知,故采用熵權(quán)法對(duì)其內(nèi)在各指標(biāo)成分權(quán)重進(jìn)行測(cè)定[15,16]。

2.3.2.1.1 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理

設(shè)定樣品數(shù)為m,每個(gè)樣品評(píng)價(jià)指標(biāo)為n,構(gòu)成{Xij}(i=1、2、3......m;j=1、2、3......n;其中m=69,n=6)的評(píng)價(jià)單元序列。利用公式(1)進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理,其中Yij為標(biāo)準(zhǔn)化處理后所得數(shù)據(jù),Xij為第i個(gè)樣品中第j個(gè)指標(biāo)值。

Yij=[Xij-(Xi)min]/[(Xi)max-(Xi)min]

(1)

2.3.2.1.2 確定各指標(biāo)信息熵及權(quán)重

根據(jù)信息熵的定義,按公式(2)和(3)計(jì)算各指標(biāo)的信息熵(E),Ej為樣品的第j個(gè)指標(biāo)的信息熵,若Pij=0,則定義lnPij=0,通過(guò)公式(4)計(jì)算各指標(biāo)的權(quán)重(Wj),結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 川澤瀉內(nèi)在成分多指標(biāo)權(quán)重Table 6 Multi-index weights of intrinsic components of Alismatis Rhizoma

(2)

(3)

(4)

由表6可見(jiàn),川澤瀉藥材各化學(xué)指標(biāo)按權(quán)重大小排列為:浸出物>AB>23-AB>23-AC>總?cè)?總多糖。

2.3.2.2 灰色關(guān)聯(lián)度計(jì)算化學(xué)指標(biāo)關(guān)聯(lián)度

灰色關(guān)聯(lián)度是分析多因素的一種經(jīng)典統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,以各指標(biāo)的樣本數(shù)據(jù)為依據(jù)來(lái)分析各因素間關(guān)聯(lián)度大小。主要包括定義參考序列和比較序列,處理和計(jì)算比較數(shù)列和參考數(shù)列數(shù)值進(jìn)而計(jì)算灰色關(guān)聯(lián)度。在本研究中以川澤瀉各組樣品為參考序列,各個(gè)內(nèi)在指標(biāo)數(shù)據(jù)值為比較序列。通過(guò)計(jì)算得到各指標(biāo)關(guān)聯(lián)度,其中關(guān)聯(lián)度越高,表明該項(xiàng)指標(biāo)與川澤瀉藥材質(zhì)量密切度越高。進(jìn)而根據(jù)關(guān)聯(lián)度大小對(duì)川澤瀉內(nèi)在各指標(biāo)進(jìn)行排序,初步篩選出川澤瀉藥材等級(jí)劃分的內(nèi)在成分指標(biāo)[17]。

(5)

(6)

采用公式⑦計(jì)算參考數(shù)列和比較數(shù)列的絕對(duì)差值(△ij)

(7)

灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)、關(guān)聯(lián)度的計(jì)算:Δmax、Δmin分別為絕對(duì)差值Δij的最大值和最小值,通過(guò)公式(8)、(9)計(jì)算灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)rij和灰色關(guān)聯(lián)度rj。其中ρ為分辨系數(shù),ρ取熵權(quán)法計(jì)算所得的各指標(biāo)權(quán)重,計(jì)算結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 川澤瀉藥材內(nèi)在成分各指標(biāo)含量灰色關(guān)聯(lián)度Fig.4 Grey correlation degree of intrinsic components of Alismatis Rhizoma

(8)

(9)

由圖4可知,川澤瀉藥材內(nèi)在各指標(biāo)關(guān)聯(lián)度大小排序?yàn)?23-AB>AB>23-AC>浸出物>總?cè)?總多糖。表明23-AB、AB、23-AC含量與川澤瀉藥材質(zhì)量密切度較高。

綜上,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)“實(shí)用性”原則考慮指標(biāo)測(cè)定方法的簡(jiǎn)易程度,擬以23-AB、AB、23-AC的總含量作為川澤瀉藥材等級(jí)劃分的內(nèi)在指標(biāo)。

2.3.3 川澤瀉外觀性狀與內(nèi)在品質(zhì)相關(guān)性分析

采用SPSS21.0軟件,對(duì)選取的川澤瀉藥材外觀性狀指標(biāo)單個(gè)重、長(zhǎng)度與內(nèi)在品質(zhì)各篩選指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 川澤瀉藥材外觀性狀指標(biāo)與內(nèi)在指標(biāo)相關(guān)性分析Table 7 Correlation analysis between appearance traits and intrinsic indicators of Alismatis Rhizoma

相關(guān)性分析結(jié)果表明:川澤瀉藥材單個(gè)重、長(zhǎng)度與總?cè)坪砍蕵O顯著負(fù)相關(guān)性。其他內(nèi)在質(zhì)量指標(biāo)23-AB、23-AC、AB、浸出物、總多糖含量與單個(gè)重、長(zhǎng)度無(wú)顯著性關(guān)系。

2.3.4 川澤瀉藥材商品等級(jí)指標(biāo)的確定

通過(guò)對(duì)69組川澤瀉藥材樣品的12個(gè)潛在指標(biāo)作量化測(cè)定,進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,篩選其等級(jí)劃分的表、里指標(biāo)。其中描述統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明不同批次間川澤瀉藥材單個(gè)重差異較為明顯;方差分析結(jié)果顯示單個(gè)重的F值(467.55)最大,其次為長(zhǎng)度(134.92)和直徑(72.74),且三者均達(dá)到極顯著水平;但色度值L*、a*、b*的F值均較小,且無(wú)顯著性差異,不宜作為川澤瀉商品等級(jí)劃分的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

綜上,并進(jìn)一步考慮指標(biāo)測(cè)定方法的簡(jiǎn)易程度,選取單個(gè)重、長(zhǎng)度作為川澤瀉藥材商品等級(jí)劃分的外觀性狀指標(biāo)。結(jié)合熵權(quán)法和灰色關(guān)聯(lián)度法作綜合分析,發(fā)現(xiàn)23-AB、AB、23-AC所占權(quán)重較大(分別為0.156、0.187、0.153),與川澤瀉藥材質(zhì)量密切度(0.538、0.527、0.489)較高,因此選取23-AB、AB、23-AC的含量作為川澤瀉藥材內(nèi)在質(zhì)量指標(biāo)。

綜上,基于《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn),結(jié)合川澤瀉品質(zhì)特點(diǎn)和實(shí)際操作的簡(jiǎn)便性,最終選取單個(gè)重、長(zhǎng)度,23-AB、AB、23-AC的總含量作為川澤瀉藥材商品的等級(jí)劃分指標(biāo)。

2.3.5 川澤瀉商品規(guī)格等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(草案)的制定

以篩選出的單個(gè)重、長(zhǎng)度及3種三萜類(lèi)成分總含量為指標(biāo)對(duì)69批樣品的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析和K-均值聚類(lèi)分析,系統(tǒng)聚類(lèi)分析結(jié)果見(jiàn)圖5,其中距離代表相似度,距離越遠(yuǎn)差異越大,在25的標(biāo)度下,69批川澤瀉藥材被分為兩類(lèi)。K-均值聚類(lèi)分析將川澤瀉藥材初步分為2類(lèi),分類(lèi)結(jié)果見(jiàn)表8。在符合2020年版《中國(guó)藥典》的基礎(chǔ)上,結(jié)合川澤瀉市場(chǎng)流通現(xiàn)狀,將川澤瀉藥材商品劃分為2個(gè)等級(jí)及統(tǒng)貨。其中,一等品含測(cè)指標(biāo)規(guī)定為高于平均值10%,二等品規(guī)定為高于平均值-20%。統(tǒng)貨含測(cè)指標(biāo)規(guī)定為所測(cè)數(shù)據(jù)最小值。川澤瀉樣品具體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表9,各批次樣品等級(jí)分類(lèi)結(jié)果見(jiàn)表10。

圖5 69批樣品聚類(lèi)樹(shù)狀圖Fig.5 Clustering dendrogram of 69 batches of samples

表8 川澤瀉藥材K-均值聚類(lèi)分析Table 8 K-means cluster analysis of Alismatis Rhizoma

表9 川澤瀉商品等級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(草案)Table 9 Alismatis Rhizoma commodity grading standards(draft)

表10 川澤瀉樣品等級(jí)分類(lèi)Table 10 Grade classification of Alismatis Rhizoma samples

3 結(jié)論

中藥在漫長(zhǎng)的發(fā)展過(guò)程中,逐步形成了“看貨評(píng)級(jí)、分檔議價(jià)”的質(zhì)量評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn),即中藥材商品規(guī)格等級(jí)。近年來(lái),學(xué)者們基于傳統(tǒng)外觀性狀,在中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究成果的基礎(chǔ)上,不斷探索兩者關(guān)聯(lián)性,篩選能綜合反映藥材商品質(zhì)量的評(píng)價(jià)指標(biāo)和方法,以建立更加科學(xué)、實(shí)用的中藥材商品標(biāo)準(zhǔn)體系[18,19],擬以“高標(biāo)準(zhǔn)”從源頭把控和提升我國(guó)中藥產(chǎn)品質(zhì)量,實(shí)現(xiàn)我國(guó)中藥產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展目標(biāo)。

澤瀉是一味大宗商品藥材,產(chǎn)銷(xiāo)量大;川澤瀉是四川著名道地藥材,涉及規(guī)范化栽培、精深加工、現(xiàn)代倉(cāng)儲(chǔ)、高質(zhì)量品牌化飲片及中成藥生產(chǎn)等系列產(chǎn)業(yè)。但現(xiàn)有的澤瀉商品等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)僅以外觀性狀單個(gè)重作為劃分指標(biāo),以“個(gè)大”為內(nèi)核劃分等級(jí),缺乏具體的形態(tài)刻畫(huà),不同市場(chǎng)間及相同市場(chǎng)不同商家間等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一。因此,本文首次引入現(xiàn)代多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,聚焦?jié)蔀a藥效成分與川澤瀉標(biāo)志物,篩選出既傳承傳統(tǒng)性狀評(píng)價(jià),又應(yīng)用現(xiàn)代中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究成果[10-12,20]的等級(jí)劃分指標(biāo),將外觀性狀與內(nèi)在藥效成分23-AB、23-AC、AB聯(lián)系起來(lái),制定從外在到內(nèi)在、從主觀到客觀的川澤瀉等級(jí)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)。此標(biāo)準(zhǔn)在傳承澤瀉傳統(tǒng)商品等級(jí)外觀性狀劃分方式的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)方法補(bǔ)充及完善劃分指標(biāo)及檢測(cè)方法,擬更好地引導(dǎo)和促進(jìn)澤瀉藥材商品在市場(chǎng)交易中實(shí)現(xiàn)“優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)”,以促進(jìn)澤瀉全產(chǎn)業(yè)鏈高質(zhì)量發(fā)展。

值得注意的是,中藥化學(xué)成分復(fù)雜,影響因素眾多,變化機(jī)制頗為復(fù)雜。此次相關(guān)性研究結(jié)果中還存在現(xiàn)有性狀指標(biāo)無(wú)法完全解釋內(nèi)在成分變化,川澤瀉單個(gè)重、長(zhǎng)度與23-AB、23-AC、AB含量無(wú)顯著性關(guān)系,總?cè)坪可踔僚c單個(gè)重、長(zhǎng)度呈負(fù)相關(guān)性。推測(cè)這可能與新鮮澤瀉藥材在產(chǎn)地烘干時(shí)為快速降低水分,采用80～90 ℃高溫烘炕,使得川澤瀉藥材總?cè)坪匡@著下降[21,22]有關(guān),具體原因還需后續(xù)作進(jìn)一步研究。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展,今后可擴(kuò)大樣品量,引入網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等現(xiàn)代研究方法,深入挖掘川澤瀉藥材質(zhì)量標(biāo)志物Q-Marker,從而制定更完善、更客觀的川澤瀉道地藥材標(biāo)準(zhǔn)及商品標(biāo)準(zhǔn),同時(shí)也為我國(guó)中藥材商品標(biāo)準(zhǔn)研究提供新的思路和方法。