甘草內(nèi)生菌對(duì)順鉑誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

張 楠,張尚龍,連小龍,楊志軍,馬趣環(huán),葉禮巧,鄧 毅,2*,楊秀娟,2*

1甘肅中醫(yī)藥大學(xué);2甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730000;3青海大學(xué),青海 810000

順鉑(cisplatin,CP)作為臨床常用的抗腫瘤藥物,療效顯著但毒副作用較強(qiáng)。主要表現(xiàn)為腎毒性、肝毒性、耳毒性及心臟毒性等,且尤以腎損傷較為嚴(yán)重[1-4]。具有時(shí)間-劑量依賴性[5]。CP引起的腎毒性可能涉及多方面的致病機(jī)制,包括線粒體功能障礙、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等[6]。因此如何能夠有效降低CP毒副作用成為擴(kuò)大CP臨床用藥劑量的首要問題,尋找合適的治療方案或藥物協(xié)同CP減毒增效成為目前研究的主要方向。

近年來,隨著中醫(yī)藥的發(fā)展,通過聯(lián)合中藥實(shí)現(xiàn)增效減毒的方式成為一大研究熱點(diǎn)。甘草作為“解毒圣藥”,性味甘平,功能補(bǔ)脾益氣,調(diào)和諸藥[7,8],其活性成分可緩解中毒癥狀,降低死亡率,對(duì)藥物和毒物具有顯著的解毒作用[9-11]。內(nèi)生菌屬于藥用微生物資源范疇[12],是指生活在健康植物組織和器官內(nèi)部的真菌或細(xì)菌,與宿主在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中,發(fā)生基因重組并獲得宿主植物的基因,產(chǎn)生與宿主相同或相似的藥用活性成分[13],Man等[14]研究發(fā)現(xiàn),甘草內(nèi)生菌株具有與宿主相同的生理作用,能夠代謝出與甘草相似的皂苷類、黃酮類活性成分,具有抑菌、抗氧化的藥理作用。Yang等[15]研究發(fā)現(xiàn),甘草內(nèi)生菌發(fā)酵液具有與宿主水煎液、總黃酮及總皂苷相似的止咳作用。本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),甘草內(nèi)生菌具有抑菌[16]、抗炎[17]、祛痰[18]、抗腫瘤[19]等多種藥理作用,可代謝出與宿主甘草相似的甘草酸銨、甘草苷及甘草素[20],因而甘草內(nèi)生菌可能具有與甘草相似的解毒作用。前期減毒實(shí)驗(yàn)證明,甘草能有效減輕CP引起的腎毒性。但甘草內(nèi)生菌對(duì)CP所致的腎毒性并未見系統(tǒng)的機(jī)制研究。

因此,本文旨在通過體外實(shí)驗(yàn)建立CP誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞損傷模型,探討甘草內(nèi)生菌對(duì)CP損傷HEK293細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制。以期為甘草內(nèi)生菌與CP聯(lián)合應(yīng)用實(shí)現(xiàn)增效減毒提供依據(jù),為甘草內(nèi)生菌的解毒作用提供理論參考,進(jìn)一步擴(kuò)充甘草內(nèi)生菌的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

甘草經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李碩副教授鑒定為GlycyrrhizauralensisFisch的根和根莖,甘草內(nèi)生菌(JTZB055)為本課題組從同期甘草中分離純化所得,經(jīng)16S rDNA測(cè)序結(jié)果鑒定顯示JTZB055屬于內(nèi)生細(xì)菌芽孢桿菌屬;順鉑(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):SC5170-20 mg)。

1.2 細(xì)胞株

人胚腎HEK293細(xì)胞購(gòu)自于武漢普諾賽生命科技有限公司。用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖完全培養(yǎng)基,于5%CO2,37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待長(zhǎng)至瓶底約85%時(shí),用含EDTA 0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng),待用。

1.3 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基(Cytiva公司,批號(hào):AH29027412);胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司,批號(hào):21030707);噻唑藍(lán)(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):917Q051);胰蛋白酶、青鏈霉素(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號(hào):GP2211017、GA22020011094);二甲基亞砜(DMSO,北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):1121E0331);β-actin(武漢Abbkine公司,批號(hào):ATVMA0302);Bcl-2、Caspase-9、GRP78及CHOP抗體(北京博奧森公司,批號(hào):bs-0032R、bs-0049R、bs-1219R、bs-20669R);Bax、Caspase-3、Caspase-8及山羊抗兔二抗(Abmart公司,批號(hào):ab32503、ab32351、ab108333、abs20040ss);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):20211213)。

1.4 主要儀器

酶標(biāo)儀(BioTek Instruments,Inc);倒置熒光顯微鏡成像(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司);191L氣套式CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)精騏有限公司);超凈工作臺(tái)(AIRTHCH公司);流式細(xì)胞儀(Beckman);微量分光光度計(jì)(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司);熒光定量PCR儀(加拿大楓嶺生物技術(shù)有限公司);化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)Azure Biosystems公司)。

1.5 方法

1.5.1 甘草內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物萃取粉末的制備

將甘草內(nèi)生細(xì)菌JTZB055于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上復(fù)蘇,挑取單個(gè)菌落,接種到普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中,在37 ℃、220 r/min恒溫振蕩器中培養(yǎng)5 d,收集發(fā)酵液,抽濾,濾液水浴加熱蒸干成甘草內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液粉末,于4 ℃冰箱保存,備用。發(fā)酵液粉末用水溶解成水溶液后依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取,萃取3次,合并萃取液,以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑至50 mL后,水浴干燥成粉末,于4 ℃冰箱保存,備用[21]。

1.5.2 MTT法檢測(cè)CP對(duì)HEK293細(xì)胞存活率的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,用0.25%胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL,向96孔板中加入不同濃度的CP(1、2、4、8、16、32、64 μg/mL),每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組,在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)孵育24 h后,每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,每孔再加入DMSO 150 μL,振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀測(cè)量各組在570 nm處的吸光度(A),按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率[22]。

存活率=(加藥組A值-調(diào)零組A值)/

(對(duì)照組A值-調(diào)零組A值)×100%

1.5.3 MTT法檢測(cè)甘草內(nèi)生菌對(duì)HEK293細(xì)胞存活率的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,用0.25%胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL,向96孔板中加入不同濃度的JTZB055(1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320、640 μg/mL),每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組,在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)孵育24 h后,每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,每孔再加入DMSO 150 μL,振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀測(cè)量各組在570 nm處的吸光值,并按照“1.5.2”所述方法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.5.4 MTT檢測(cè)甘草內(nèi)生菌對(duì)CP所致HEK293細(xì)胞損傷模型的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,用0.25%胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL,以每孔100 μL接種于96孔板,進(jìn)行分組:①對(duì)照組:DMEM培養(yǎng)基;②CP組:4 μg/mL CP;③CP+JTZB055組:加入2.5、5、10、20、40、80、160、320、640 μg/mL JTZB055,4 h后加入4 μg/mL CP。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)空白調(diào)零孔(只含有DMEM培養(yǎng)基)。將96孔板繼續(xù)37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,并按照“1.5.2”所述方法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.5.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用0.25%胰酶消化,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL,分組鋪在6孔板中,分為對(duì)照組(Con)、模型組(CP)、JTZB055組(JT)、CP+JTZB055高劑量組(CPJT-H)、CP+JTZB055中劑量組(CPJT-M)、CP+JTZB055低劑量組(CPJT-L)。倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài),對(duì)比各組細(xì)胞形態(tài)狀況差異。

1.5.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞HEK293細(xì)胞,用0.25%胰酶進(jìn)行消化,收集細(xì)胞懸液,細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù),將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105個(gè)/mL個(gè)細(xì)胞,按照“1.5.5”分組加入6孔板。加入預(yù)冷的PBS緩沖液清洗2遍,加入200 μL結(jié)合液重懸細(xì)胞,沉淀中加入5 μL PI和5 μL A-V染色液混勻, 4 ℃避光冰浴放置孵育10～15min。在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè),激發(fā)波長(zhǎng)為488nm和535nm。每個(gè)樣品檢測(cè)5×104個(gè)/mL個(gè)細(xì)胞,每組試驗(yàn)重復(fù)3次。CellQuest 軟件分析細(xì)胞凋亡率,結(jié)果用平均凋亡率表示。

1.5.7 熒光定量PCR檢測(cè)mRNA水平

前期處理如“1.5.5”,根據(jù)總RNA提取試劑盒操作提取總RNA,微量分光光度計(jì)進(jìn)行RNA濃度、純度檢測(cè),根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)為cDNA,后運(yùn)用擴(kuò)增程序兩步法在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增,引物序列見表1。由PCR分析儀采集的目的基因和內(nèi)參基因的CT值,計(jì)算ΔCT=CT目的-CT內(nèi)參,ΔΔCT=ΔCT實(shí)驗(yàn)組-ΔCT對(duì)照組,最后使用2-ΔΔCT方法計(jì)算,得出基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物設(shè)計(jì)序列及長(zhǎng)度Table 1 Primer sequence and length

1.5.8 Western blot法檢測(cè)凋亡蛋白表達(dá)水平

前期處理如“1.5.5”,培養(yǎng)24 h后棄掉舊培養(yǎng)液,用預(yù)冷PBS清洗三次,1 500 r/min于4 °C低溫離心機(jī)離心15 min后,棄上清。每孔加入200 μL配置好的裂解液,冰上裂解30 min,刮下細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷EP管中,放置冰上靜止30 min裂解,12 000 r/min于4 °C低溫離心機(jī)離心15 min后,保留上清液為蛋白樣本于新的預(yù)冷EP管中,棄去沉淀。BCA法測(cè)定蛋白濃度,SDS-PAGE膠電泳,每孔10 μg上樣,然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h;孵育一抗,4 ℃過夜,TBST清洗后室溫孵育二抗1 h;TBST清洗后ECL發(fā)光液成像,采用Image J 軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分析,目的蛋白條帶光密度值與內(nèi)參蛋白條帶光密度值的比值,即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的CP在24 h、48 h、72 h對(duì)HEK293的影響

如圖1所示,與Con組相比,隨著CP給藥濃度及給藥時(shí)間的增加,HEK293細(xì)胞的存活率逐漸降低(P<0.01),且CP誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞損傷呈時(shí)間-劑量依賴性。因此選用24 h作為CP給藥模型時(shí)間,通過SPSS軟件分析得出CP對(duì)HEK293細(xì)胞的IC50值為3.394 μg/mL,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用4 μg/mL作為HEK293損傷模型濃度。

圖1 不同濃度CP對(duì)HEK293細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effects of different concentrations of CP on survival rate of HEK293

2.2 不同濃度的甘草內(nèi)生菌在24、48、72 h對(duì)HEK293細(xì)胞存活率的影響

如圖2所示,不同濃度的甘草內(nèi)生菌處理HEK293細(xì)胞24、48、72 h后對(duì)細(xì)胞的存活率有不同的影響。隨著給藥時(shí)間的增加,甘草內(nèi)生菌對(duì)HEK293細(xì)胞的增殖作用逐漸降低,且在72 h時(shí)對(duì)細(xì)胞具有抑制作用。因此選用24 h作為藥物作用時(shí)間,當(dāng)甘草內(nèi)生菌濃度在640 μg/mL時(shí),對(duì)細(xì)胞具有殺傷作用,可能是高濃度的甘草內(nèi)生菌對(duì)HEK293細(xì)胞具有一定細(xì)胞毒作用。當(dāng)甘草內(nèi)生菌濃度<320 μg/mL時(shí),對(duì)細(xì)胞增殖具有一定的促進(jìn)作用,且甘草內(nèi)生菌濃度在10 μg/mL時(shí),與Con組相比,HEK293細(xì)胞存活率最高(P<0.01)。

圖2 不同濃度甘草內(nèi)生菌對(duì)HEK293細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of G.uralensis endophytes on the survival rate of HEK293 注:與Con組相比,*P <0.05,**P <0.01。Note:Compared with control,*P <0.05;**P <0.01.

2.3 不同濃度的甘草內(nèi)生菌對(duì)HEK293損傷模型存活率的影響

如圖3所示,當(dāng)甘草內(nèi)生菌濃度高于320 μg/mL時(shí),對(duì)CP所致的HEK293細(xì)胞損傷無明顯的保護(hù)作用,當(dāng)甘草內(nèi)生菌濃度在10～160 μg/mL范圍時(shí),與CP組相比,HEK293細(xì)胞的存活率顯著升高(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)甘草內(nèi)生菌濃度在10、5 、2.5 μg/mL時(shí)細(xì)胞損傷均明顯改善,且濃度為10 μg/mL時(shí),顯著改善CP誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞損傷,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。為了進(jìn)一步篩選出最佳減毒濃度,實(shí)驗(yàn)選用Con組、CP組(4 μg/mL)、JT組(10 μg/mL)、CPJT-H組(10 μg/mL)、CPJT-M組(10 μg/mL)、CPJT-L組(10 μg/mL)等六組進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證,探討甘草內(nèi)生菌對(duì)CP誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用機(jī)制。

圖3 不同濃度的甘草內(nèi)生菌對(duì)HEK293損傷模型存活率的影響Fig.3 Effects of different concentrations of G.uralensis endophytes on the survival rate of HEK293 injury 注:與Con相比,*P <0.05,**P <0.01;與CP組相比,#P <0.05,##P <0.01,下同。Note:Compared with Con,*P <0.05;**P <0.01;Compared with CP,#P <0.05,##P <0.01,the same below.

2.4 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

如圖4所示,顯微鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)Con組細(xì)胞均勻生長(zhǎng),細(xì)胞貼壁牢固呈梭形或多角形分布。與Con比較,JT組無明顯差別,細(xì)胞輪廓清晰,貼壁較穩(wěn)均勻生長(zhǎng),且JT組細(xì)胞較空白組生長(zhǎng)數(shù)量有所增加。CP組細(xì)胞形態(tài)改變多呈圓形生長(zhǎng),細(xì)胞多數(shù)呈漂浮狀態(tài),貼壁性較差,與Con組相比數(shù)量明顯減少。與CP組相比,聯(lián)合高中低劑量組細(xì)胞皺縮形態(tài)明顯減輕,貼壁能力有所恢復(fù),且CPJT-H組效果最好。提示一定濃度下甘草內(nèi)生菌對(duì)HEK293細(xì)胞有一定的促進(jìn)作用,且CPJT-H組可以一定程度緩解CP誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞的受損形態(tài),改善細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。

圖4 各組藥物作用下HEK293細(xì)胞形態(tài)(×100)Fig.4 Cell morphology of HEK293 under drug action in each group (×100)

2.5 流式細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與Con組相比,CP組凋亡率顯著上升,凋亡比例增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),提示CP誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡。與CP組相比,CPJT-H、CPJT-M、CPJT-L藥物組干預(yù)治療CP組后,細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01),且CPJT-H組效果最為顯著,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明(見圖5),JT組(10 μg/mL)可以促進(jìn)HEK293細(xì)胞的增殖,有效改善CP誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞凋亡。

圖5 各藥物組作用24 h后HEK293細(xì)胞的凋亡率Fig.5 Apoptosis rate of HEK293 cells after 24 h of treatment in each drug group

2.6 熒光定量PCR檢測(cè)mRNA水平表達(dá)的影響

各組藥物作用24 h后,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)目的基因,以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參,在mRNA水平檢測(cè)各目的基因相對(duì)表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),各個(gè)溶解曲線未出現(xiàn)多峰現(xiàn)象,相應(yīng)擴(kuò)增曲線未發(fā)現(xiàn)有非特異性擴(kuò)增及引物二聚體。與Con組相比,CP組顯著上調(diào)HEK293細(xì)胞中Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、GRP78及CHOP mRNA表達(dá)水平(P<0.05,P<0.01),下調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)水平,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與CP組相比,CPJT-H組Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、GRP78及CHOP mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05,P<0.01),Bcl-2 mRNA表達(dá)水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見圖6)。

圖6 不同藥物組作用HEK293細(xì)胞24 h mRNA表達(dá)水平Fig.6 The 24 h mRNA expression of HEK293 cells was affected by different drug

2.7 Western blot法檢測(cè)相關(guān)凋亡蛋白的影響

Western blot結(jié)果顯示(見圖7),與Con組相比,CP組中促凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、GRP78、CHOP的表達(dá)量顯著升高(P<0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量下調(diào)(P<0.01)。甘草內(nèi)生菌治療組干預(yù)模型組后,與CP組相比,促凋亡蛋白的表達(dá)量顯著降低(P<0.05,P<0.01),Bcl-2蛋白表達(dá)量上調(diào)(P<0.01),且CPJT-H組效果最為顯著(P<0.01)。提示甘草內(nèi)生菌可能通過調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、GRP78、CHOP蛋白表達(dá)改善CP誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞損傷。

圖7 各組藥物作用HEK293細(xì)胞24 h后蛋白的相對(duì)表達(dá)水平Fig.7 The relative expression level of protein in HEK293 cells after 24 h of drug treatment in each

3 討論與結(jié)論

腎臟作為機(jī)體的主要排泄器官,CP主要通過腎臟排泄,在腎近端小管積聚,形成高濃度、長(zhǎng)時(shí)間的蓄積狀態(tài),促進(jìn)ROS的生成并抑制其代謝酶降解,造成ROS在體內(nèi)的大量蓄積,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,造成腎臟損傷[23]。甘草具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、清除自由基的藥理作用,可減少ROS生成,改善細(xì)胞凋亡狀態(tài)[24,25]。甘草內(nèi)生菌與甘草共生,屬于藥用微生物資源,具有與宿主甘草相似的藥理活性,能夠降低馬錢子引起的腎臟損傷,亦具有改善順鉑腎毒性的潛在活性[6]。本研究通過MTT法對(duì)不同藥物干預(yù)組進(jìn)行吸光度測(cè)定,結(jié)果表明,CP誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞損傷具有時(shí)間劑量依賴性,與CP組比較,甘草內(nèi)生菌治療組顯著改善細(xì)胞損傷,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),聯(lián)合用藥組細(xì)胞皺縮形態(tài)明顯減輕,貼壁能力有所恢復(fù),與文獻(xiàn)報(bào)道一致。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與Con組相比,CP組凋亡率顯著升高(P<0.01),與CP組相比,聯(lián)合治療組凋亡率降低,且CPJT-H組效果最為顯著(P<0.01)。與MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,進(jìn)一步提示甘草內(nèi)生菌對(duì)CP誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡過程非常復(fù)雜,可分為內(nèi)源性途徑、外源性途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑。Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用,包括抗凋亡蛋白如Bcl-2和促凋亡蛋白如 Bax[26]。Bcl-2 在線粒體凋亡途徑中具有主要調(diào)控作用,可通過激活下游基因造成細(xì)胞凋亡[27]。Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9是Caspase家族中的主要成分,在細(xì)胞凋亡中常作為重要指標(biāo)來檢測(cè)細(xì)胞凋亡的程度[28]。GRP78及CHOP則是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志蛋白,是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要組成部分[29]。通過考察Bcl-2家族、Caspase家族以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡蛋白探討甘草內(nèi)生菌對(duì)CP誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用機(jī)制,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與Con組相比,CP干預(yù)后使Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、GRP78、CHOP的mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量上調(diào)(P<0.05,P<0.01),Bcl-2的mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.01)。與CP組相比,甘草內(nèi)生菌各治療藥物組干預(yù)后,對(duì)CP誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞損傷均有一定程度的改善作用。其中CPJT-H組的Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、GRP78、CHOP的mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05,P<0.01),Bcl-2的mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.01)。

綜上,甘草內(nèi)生菌能降低CP誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞的凋亡,并通過抑制促凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、GRP78、CHOP的表達(dá)并促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),從而減輕CP誘導(dǎo)腎毒性作用,為甘草內(nèi)生菌與CP聯(lián)用減毒提供依據(jù),擴(kuò)充甘草內(nèi)生菌的藥理作用。