小亞璃眼蜱吸血前后組織形態(tài)比較觀察

李曉森，羅亭祥，楊德鵬，伍 軍，石文玉，張華聰，艾則麥提·艾合買提，蘇蓓琪，瑪合力亞·馬合木提，胡政香，呼爾查，3

（1. 新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊 830052；2. 新疆農業(yè)大學草業(yè)學院，新疆烏魯木齊 830052；3. 新疆農業(yè)大學獸醫(yī)學博士后流動站，新疆烏魯木齊 830052）

小亞璃眼蜱（Hyalommaanatolicum）是一種具有重要醫(yī)學意義的硬蜱，在我國主要分布于西北地區(qū)，其寄生宿主種類較多，包括駱駝、牛、馬、綿羊等家畜[1]。小亞璃眼蜱是多種病原微生物的傳播媒介，可傳播多種人獸共患傳染病，對畜牧業(yè)發(fā)展造成的經濟損失居高不下[2]。

小亞璃眼蜱以宿主動物血液為唯一的營養(yǎng)來源，因此需要寄生在不同的宿主動物體表吸血生存[3]。該蜱須經過蟲卵、幼蟲、若蟲及成蟲4 個階段來完成完整的生活史[4]。成蟲階段是小亞璃眼蜱最容易被識別的階段，以每年的3—5 月多見，此時其主要寄生于駱駝、牛、羊等較大體形的牲畜體表[5]。硬蜱在宿主體表需要連續(xù)多天不間斷吸血，經過慢速吸血期和快速飽血期后，體形迅速膨大，各組織器官形態(tài)也隨之發(fā)生巨大變化[6]。本試驗選擇人工飼養(yǎng)的小亞璃眼蜱蟲株進行組織切片形態(tài)觀察，并首次采用糖原PAS 染色法觀察了小亞璃眼蜱雌蜱在不同狀態(tài)下的糖原分布情況，以期為了解吸血期硬蜱器官的變化提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及試驗動物 新西蘭大白兔1 只，體質量2.1 kg，雌性，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心。本試驗所用的小亞璃眼蜱，為新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院在實驗室條件下（氣溫25 ℃± 2 ℃、相對濕度85% ± 5%、光照周期15 h 晝/9 h 夜）保存的人工飼養(yǎng)蟲株。整個試驗過程均在新疆農業(yè)大學動物醫(yī)院實驗動物房內進行，動物房氣溫為25 ℃± 2 ℃，相對濕度為40% ± 10%，光照周期為15 h 晝/9 h 夜。試驗兔在金屬刷漆的兔籠中獨立飼養(yǎng)，對其飼喂商品化兔糧，供應充足的涼開水。

1.1.2 小亞璃眼蜱樣本準備 本試驗所用的切片樣本狀態(tài)為饑餓、半飽血和飽血雌蜱。饑餓雌蟲樣本，為在實驗室條件下飼養(yǎng)了6 個月未吸血的雌蜱；半飽血雌蜱（從叮咬吸血開始第5 天的雌性蟲體）和飽血雌蜱（完全吸飽血后自行脫離宿主的雌性蟲體），為在試驗兔體表獲得的寄生蟲體。人工飼養(yǎng)過程如下：首先使試驗兔熟悉飼養(yǎng)環(huán)境，在實驗動物房飼養(yǎng)5 d，無應激反應后，在試驗兔耳朵上固定透氣材質的布料耳套[7]；然后將在實驗條件下人工飼養(yǎng)的成蟲以2:1 的雄雌比例置于耳套內吸血，第5 天時取下半飽血雌蜱，第6～10 天時收集飽血雌蜱。

1.2 方法

1.2.1 組織切片制作 將待制作切片的蟲體樣本在實驗室條件下保存24 h 后，置入Bouin 氏組織固定液中靜置48 h，準備制作組織切片。首先將組織固定液中的饑餓、半飽血以及飽血雌蜱取出，用酒精梯度脫水除去雌蜱體內的水分；再將雌蜱置于二甲苯中透明化，將透明化的雌蜱置于溶化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫；待石蠟完全浸入后完成石蠟包埋，在切片機上完成不同狀態(tài)雌蜱樣本的冠狀面組織切片。

1.2.2 PAS 糖原染色 糖原PAS 染色切片的制作步驟：將石蠟切片脫蠟，然后將切片放入二甲苯20 min，無水乙醇5 min，75%乙醇5 min，以自來水洗；將切片置于高碘酸染液中染色15 min，以自來水洗后再用蒸餾水洗兩遍；將切片置入雪弗（Schiff）染色液中避光靜置30 min，以流水沖洗5 min；將切片置入蘇木素中染色1～3 min，以自來水洗，用1%鹽酸乙醇水溶液分化數秒，以自來水洗，再用氨水溶液返藍15 min，以自來水洗；將切片依次放入無水乙醇5 min，75%乙醇5 min，50%乙醇5 min，二甲苯5 min，以中性樹膠封片。最后再將切片正置于光學顯微鏡Nikon Eclipse E100上，采用Nikon DS-U3 成像系統(tǒng)采集分析圖片。

2 結果

2.1 整體切片觀察

小亞璃眼蜱雌蜱整蟲糖原PAS 染色結果（圖1）顯示，饑餓蜱體形與半飽血和飽血蜱相比明顯偏小，糖原含量相對較低，而半飽血和飽血雌蜱體內糖原含量則較高。圖1 以蟲體尾部在左邊，頭部在右邊的方式，展示了3 個樣本的冠狀面切片。整蟲切片的樣本顯示出對稱的組織器官形態(tài)。

圖1 小亞璃眼蜱雌蜱糖原PAS 切片整體對比觀察結果

2.2 蜱類器官形態(tài)觀察

2.2.1 中腸組織 局部組織器官放大畫面顯示，腸組織在饑餓蜱體內占比相對較小，中腸腔內容物較少，幾乎沒有紅細胞可見，且中腸腔內未觀察到脫離中腸壁的完整消化小體，糖原深染部位集中在中腸基底膜周圍（圖2-A）；中腸在半飽血和飽血蜱體內明顯膨大，占據蜱體內大部分體積，中腸腔內充滿宿主血液細胞成分，同時有大量深染的消化小體游離于腸內容物中，中腸上皮細胞內含有大量糖原類深染物質（圖2-B、C）。

圖2 小亞璃眼蜱雌蜱糖原PAS 切片中腸對比觀察結果

2.2.2 卵巢組織 不同狀態(tài)下雌蜱卵巢組織表面均含有深染的糖原物質。饑餓蜱卵巢較小（圖3-A），半飽血與飽血雌蜱卵巢之間并未表現(xiàn)出明顯的形態(tài)差異，飽血蜱的胚胎間距有所增大（圖3-C）。半飽血和飽血蜱體內的組織器官間隙相比于饑餓蜱較小。

圖3 小亞璃眼蜱雌蜱糖原PAS 切片卵巢對比觀察結果

2.2.3 唾液腺 3 種狀態(tài)雌蜱唾液腺的形態(tài)差異較大。饑餓蜱唾液腺較小，形態(tài)特征不明顯（圖4-A），半飽血蜱的唾液腺細胞清晰可見（圖4-B），然而飽血蜱唾液腺細胞出現(xiàn)了萎縮，整體數量也明顯減少（圖4-C）。饑餓和半飽血蜱唾液腺周圍糖原深染的組織較多，特別是半飽血蜱的唾液腺導管內出現(xiàn)密度較大的深染團塊，且該深染形態(tài)也可從半飽血雌蜱整體切片的頭部區(qū)域發(fā)現(xiàn)（圖1-B）。

圖4 小亞璃眼蜱雌蜱糖原PAS 切片唾液腺對比觀察結果

2.2.4 氣管 不同狀態(tài)小亞璃眼蜱雌蜱氣管部分的形態(tài)變化不大。氣管主要集中在蜱體兩側靠近氣門板的區(qū)域（圖1）。饑餓蜱體內的氣管密度較半飽血和飽血蜱大一些，氣管形態(tài)均以圓形、半圓形和長管狀呈現(xiàn)。糖原染色較其他組織較淺（圖5）。

圖5 小亞璃眼蜱雌蜱糖原PAS 切片氣管對比觀察結果

3 討論

通過本次組織切片染色鏡檢觀察，發(fā)現(xiàn)小亞璃眼蜱成蜱在不同狀態(tài)下，其組織器官的形態(tài)差異較大。中腸組織在饑餓狀態(tài)下萎縮，其腸壁基底膜周圍存在較多糖原深染部位，但相比半飽血至飽血過程的雌蜱，其糖原物質遠遠不足，然而饑餓雌蜱體內最能體現(xiàn)能量物質的糖原主要集中在中腸周邊。中腸染色切片另一突出特點是，消化小泡和中腸基底層部位出現(xiàn)棕色點狀深染物質，推測該物質是蜱類消化宿主血液后殘留的血紅素結晶。研究[8]表明，篦子硬蜱（Ixodesricinus）血紅素在HE 染色切片中呈散在的點狀深棕色匯集。本試驗切片觀察結果顯示，血紅素以棕色點狀匯集于中腸內。蜱類基因組研究[9]表明，硬蜱不僅缺少合成血紅素的相關基因，還缺乏血紅素加氧酶（heme oxygenase，HO）基因，而HO 是分解血紅素的關鍵功能蛋白。因此，血紅素無法被硬蜱進一步分解，只能在中腸內以結晶的形式匯集。蜱類需要將宿主血液消化后產生的多余血紅素通過排泄或者其他途徑排出體外。

在不同狀態(tài)下，雌蜱唾液腺的形態(tài)變化較大。經過6 個月未吸食血液，饑餓雌蜱體內儲存的脂肪和糖類大量消耗，蟲體形態(tài)從飽滿鈍圓變?yōu)槔饨峭怀?，腹部向背部凹陷，從而在切片中心位置出現(xiàn)了較大空白處。然而通常情況下，硬蜱唾液腺分布在蟲體背部以下的體腔內。本次饑餓蜱切片中唾液腺組織并不明顯，推測原因可能是冠狀面組織切片的位置偏向蟲體腹側所致。唾液腺組織在半飽血蜱體內非常發(fā)達，蜱類在這一時期仍需要持續(xù)從宿主體內大量吸食血液，其唾液腺導管內含有的生物活性物質經口器注入叮咬部位，從而使宿主動物被叮咬處血液凝固性降低，炎癥反應被抑制，從而有利于蜱蟲持續(xù)吸血。此外，蜱類可有效利用唾液腺分解獲得所需的營養(yǎng)物質[10]。相比于半飽血蜱，飽血蜱的唾液腺組織出現(xiàn)了一定程度萎縮。有研究[11]表明，雌蜱飽血后唾液腺細胞凋亡相關基因的轉錄水平顯著上升，導致唾液腺細胞發(fā)生凋亡從而出現(xiàn)萎縮。

在半飽血和飽血狀態(tài)下，小亞璃眼蜱雌蜱氣管和卵巢未表現(xiàn)出明顯的形態(tài)差異。雌蜱飽血后不久（通常為5～15 d）將產卵。試驗[12]表明，產卵量可達雌蜱飽血體質量的80%，產卵過程需要消耗大量的營養(yǎng)和能量。本試驗取樣時間為雌蜱脫離宿主體表后24 h，在這一時間點，飽血蜱和半飽血蜱卵巢并未出現(xiàn)顯著形態(tài)差異，提示卵巢發(fā)育變化仍需更多動態(tài)試驗觀察。相比其他狀態(tài)，饑餓蜱卵巢則明顯偏小，這是由于蜱類長期潛伏在自然環(huán)境中，需要將營養(yǎng)和能量用于適應環(huán)境，待過冬后再繼續(xù)完成體表寄生[13]。

綜上，本試驗對小亞璃眼蜱雌蜱糖原PAS 組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，糖原物質主要集中在蜱蟲的唾液腺細胞、唾液腺導管、中腸上皮細胞、卵巢上皮細胞層以及吸血后蜱血淋巴細胞。本試驗可為進一步研究蜱類營養(yǎng)代謝與防控提供研究基礎。