禽腺病毒4 型檢測方法研究進展

孟 鴿，張同鋒，尚佳靜，張永英，羅 娟 ，封瑩潔 ，于曉慧，蔣文明，劉華雷，劉冠慧，李 陽

（1. 河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056038；2. 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；3.山東省鄆城縣行政審批服務局，山東鄆城 274700）

禽腺病毒（fowl aviadenovirus，F(xiàn)AdV）為無囊膜的雙股DNA 病毒，直徑70～90 nm，呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，病毒粒子衣殼主要由六鄰體（Hexon）蛋白、五鄰體（Penton）蛋白和纖維（Fiber）蛋白組成。Hexon 蛋白上的7 個高度變異區(qū)是區(qū)分不同F(xiàn)AdV 血清型的重要區(qū)域；Fiber 蛋白上有1 個受體結(jié)合位點，其在病毒侵入宿主細胞時起重要作用[1]。FAdV 根據(jù)其基因結(jié)構(gòu)與序列長短分為3 個群：Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群。Ⅰ群屬于禽腺病毒屬，Ⅱ群屬于唾液酸酶腺病毒屬，Ⅲ群屬于胸腺病毒屬。Ⅰ群FAdV 根據(jù)限制性內(nèi)切酶消化模式的不同又可分為FAdV-A、FAdV-B、FAdV-C、FAdV-D、FAdV-E 等5 個種，也可以通過血清交叉中和試驗分為1～7、8a、8b、9～11 等12 種血清型[2]。FAdV-A 對應血清型1 型，F(xiàn)AdV-B 對應血清型5 型，F(xiàn)AdV-C 對應血清型4 和10 型，F(xiàn)AdV-D 對應血清型2、3、9 和11 型，F(xiàn)AdV-E 對應血清6、7、8a 和8b 型。Kiss 等[3]對365 株FAdV 分離株的部分聚合酶基因核苷酸序列分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AdV-A、FAdV-D、FAdV-E 占比最高，分別為11%、34%、50%。Wang 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，10%的FAdV 分離株與肝炎-心包積液綜合征（hepatitis-hydropericardium syndrome，HHS）相關(guān)。

HHS 主要由FAdV 血清4 型（FAdV-4）引起，對未接種疫苗的禽類具有較高的致死性，病死率高達80%[5]。1987 年HHS 首次被發(fā)現(xiàn)，此后在印度、加拿大、匈牙利、日本、韓國及波蘭等國家陸續(xù)暴發(fā)[6]。自2015 年起，我國山東、湖北、江蘇、安徽、江西和河北等省份均有由FAdV-4 引起的HHS 疫情的報告[7-8]。以上流行數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)AdV-4 引起的HHS 呈現(xiàn)世界范圍流行趨勢，嚴重危害全球家禽養(yǎng)殖業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，因此對FAdV-4 感染的診斷及防控顯得尤為重要。本文綜述了國內(nèi)外FAdV-4 的血清學檢測和分子生物學檢測方法研究進展，以期為FAdV感染的防控提供技術(shù)參考。

1 血清學檢測方法

1.1 病毒中和試驗（VNT）

VNT 是指病毒與待測血清混合、孵育后，接種給易感宿主或細胞，通過觀察病毒感染情況，即觀察中和后病毒對宿主或細胞的感染力，對分離株進行分析鑒定的方法[9]。VNT 被認為是檢測FAdV的“金標準”，具有高度的敏感性和特異性，但其操作流程復雜，主要用于血清分型和血清抗體檢測[10]。Guo 等[11]利用表達EGFP-Fiber-2 融合蛋白的重組病毒FA4-EGFP，建立了一種新的檢測FAdV-4 特異性中和抗體的VNT 方法。該方法僅對FAdV-4 血清有反應，并且對試驗感染和臨床接種家禽的FAdV-4 抗體檢測均有效，與傳統(tǒng)的VNT比較具有良好的線性相關(guān)性。該方法簡化了檢測程序，將檢測時間由3～4 d 縮短至24 h，為監(jiān)測疫苗免疫狀態(tài)和診斷FAdV-4 的臨床感染提供了快速、有效且節(jié)約成本的方法。欒慶東等[12]成功表達了FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-11 共4 種我國主要流行血清型的可溶性Fiber 蛋白，在細胞水平進行了交叉VNT，發(fā)現(xiàn)4 種血清型間存在的交叉保護與病毒的Fiber 蛋白無關(guān)，這項研究結(jié)果為后續(xù)血清分型診斷方法的建立提供了理論依據(jù)。傅禹銘[13]利用VNT 發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AdV-4 血清能夠中和FAdV-11 分離株，F(xiàn)AdV-8a 和FAdV-8b 不能相互交叉中和，F(xiàn)AdV-8b 血清能和FAdV-11 分離株產(chǎn)生中和，但交叉保護作用較弱，這項研究為后續(xù)疫苗研制提供了數(shù)據(jù)支持。

1.2 瓊脂凝膠擴散試驗（AGP）

AGP 通常是指雙向雙擴散試驗，是最早應用于FAdV 檢測的經(jīng)典方法之一[14]。當可溶性抗原（蛋白質(zhì)、多糖、結(jié)合蛋白等）與相應抗體在半固體瓊脂凝膠（瓊脂或瓊脂糖）內(nèi)由近及遠不斷自由擴散時可以形成一定的濃度梯度，在適當比例相遇時可形成肉眼可見的沉淀線，由此來檢測抗體效價或抗原鑒定的一種技術(shù)，其操作簡單，所用儀器少，特異性較高，結(jié)果直觀容易判定[15]。張中秋等[16]和智海東等[17]利用FAdV -Ⅰ 制備瓊脂擴散抗原，人工感染無特定病原體（SPF）雞胚，可檢測到沉淀抗體，表明研制的抗原可用于FAdV-Ⅰ檢測。但AGP 耗時長、靈敏度低、易出現(xiàn)假陽性。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

ELISA 是基于抗原抗體特異性反應而建立的血清學方法，是將抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合進行免疫反應的定性和定量檢測方法。該方法操作簡單，特異性強，其靈敏度比常規(guī)血清學檢測方法高得多，是最常用的血清學檢測方法，受到廣泛關(guān)注[18]。ELISA可分為間接ELISA（I-ELISA）、夾心ELISA 和競爭ELISA，根據(jù)檢測目的不同，又分為檢測抗原的ELISA 和檢測抗體的ELISA 方法。

我國由FAdV 感染引起的HHS 臨床病例有所增加[19]，因此開發(fā)一種新的快速血清學檢測方法迫在眉睫。He 等[20]利用FAdV-4 JSJ13 株Fiber-2蛋白原核表達質(zhì)粒作為包被抗原，建立了I-ELISA方法，并對450 份臨床血清樣本進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未接種疫苗雞群的抗體陽性檢出率低，而接種FAdV-4 疫苗的陽性檢出率超過73.3%。該方法檢測FAdV-4 抗體準確、靈敏，可用于FAdV-4 野外分離株的鑒定和分子流行病學監(jiān)測。Pan 等[21]用高濃度的FAdV-4 病毒粒子作為包被抗原，開發(fā)了一種用于檢測12 種FAdV Ⅰ群血清型的通用ELISA方法，其能夠區(qū)分FAdV Ⅰ群、FAdV Ⅲ群和其他病毒的抗體，且無交叉反應，可作為FAdV Ⅰ群血清學調(diào)查和疫苗開發(fā)的有力工具。Feichtener 等[22]開發(fā)了針對所有血清型FAdV（1～7、8a、8b、9～11）重組蛋白的ELISA 方法，并對172 份樣品進行特異性檢測，發(fā)現(xiàn)其特異性為99.3%～100%，對接種FAdV-1、FAdV-4 疫苗的家禽血清進行檢測發(fā)現(xiàn)，其敏感性比VNT 更高。Shao 等[23]使用FAdV-4的Fiber-3 蛋白單克隆抗體4A3 和3C2，建立了一種基于單克隆抗體的夾心ELISA，此方法僅對FAdV-4 有反應，對FAdV-4 蛋白和純化的GSTFiber2 蛋白的檢測限分別為1 000 TCID50/mL 和12.5 ng/mL。

為區(qū)分FAdV-4 自然感染動物與免疫接種動物，Xie 等[24]合成了FAdV-4 22k 非結(jié)構(gòu)蛋白66～88 aa 區(qū)對應的免疫原性肽，并以該肽為包被抗原，建立了FAdV-4 特異性I-ELISA 方法，其與間接免疫熒光法和商用ELISA 試劑盒檢測結(jié)果的一致性分別為95%和85%，在檢測臨床感染樣本時，其與間接免疫熒光法的一致性為80.5%，能有效區(qū)分FAdV-4 感染雞和疫苗接種雞，為臨床樣品上FAdV-4 的檢測提供了一種高效的區(qū)分感染和疫苗接種的新技術(shù)。

1.4 間接免疫熒光技術(shù)（IFA）

IFA 又稱熒光抗體技術(shù)，是把抗原抗體反應的敏感性和特異性同顯微形態(tài)學相結(jié)合的技術(shù)，既具有高度的免疫學特性和敏感性，又具有顯微形態(tài)學的精確性和直觀性，可用于免疫組織化學和免疫細胞化學抗原性物質(zhì)的定位研究，也可用于檢測抗原或未知抗體，應用十分廣泛。國紀壘等[25]通過制備FAdV-Ⅰ 12 個血清型的兔抗FAdV IgG，建立了IFA 方法，對感染雞的各組織器官進行檢測，發(fā)現(xiàn)該方法簡單、快速、特異，是檢測FAdV-Ⅰ和抗原定位的良好方法。Feichitner 等[26]開發(fā)了一種基于重組FAdV Fiber 蛋白的6 種血清型多重免疫熒光微球測定（fluorescent microsphere immunoassay，F(xiàn)MIA）方法，其能夠在高通量技術(shù)下同時檢測針對所有臨床相關(guān)血清型的抗體。

2 分子生物學檢測方法

2.1 聚合酶鏈式反應（PCR）

PCR 是一種用于擴增特定DNA 片段的分子生物學技術(shù)，其最大特點是能將微量的DNA 進行大量特異性擴增。PCR 是檢測FAdV 的主要方法，具有靈敏度高、簡便、快速等優(yōu)點，可直接從臨床或環(huán)境樣品中檢測FAdV，無需對樣品進行處理。張夢荷[27]通過構(gòu)建6 個重組質(zhì)粒建立了針對FAdV I 群PCR 檢測方法，其靈敏度高，可檢測出3.02×10-2ng/μL 的病毒DNA。Mase 等[28]建立了一種普通PCR 方法，其可同時檢測和區(qū)分FAdV的主要血清型（1、2、4、8a 和8b）。

2.2 實時熒光定量PCR（qPCR）

qPCR 實現(xiàn)了從常規(guī)PCR 定性到定量的跨越，被廣泛用于多種病原體的檢測和定量，與常規(guī)PCR 相比，qPCR 具有敏感性高、特異性強，而且具有快速、高效、操作簡單等優(yōu)點，無需同PCR 一樣進行后處理，避免了交叉污染風險。Wang 等[29]根據(jù)FAdV-4 Hexon 蛋白編碼基因保守序列設(shè)計引物和探針，建立了FAdV-4TaqMan 探針qPCR 方法，其檢測限為10 copies/μL，是傳統(tǒng)PCR 的10 倍，具有高度特異性，與其他11 種血清型FAdV 以及禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和禽白血病病毒等均無交叉反應。盧清俠等[30]基于FAdV-4 的Hexon 蛋白編碼基因保守區(qū)建立了FAdV-4 SYBR Green ⅠqPCR 方法，其最低檢測限為7.1×102copies/μL，且與其他禽源病毒無交叉反應，批內(nèi)和批間重復性試驗變異系數(shù)均不超過2%，具有良好的特異性和重復性，可用于FAdV-4 臨床早期快速檢測。

2.3 環(huán)介導等溫擴增（LAMP）

LAMP 是一種簡單、快速、特異的核酸篩選擴增方法，無需借助復雜儀器，在恒溫條件下即可實現(xiàn)核酸的高效擴增[31]。LAMP 檢測過程中產(chǎn)生大量焦磷酸鎂沉淀，因而可通過濁度儀測量沉淀物產(chǎn)生的濁度或者在紫外光源下觀察反應管中的LAMP 產(chǎn)物[32]。唐熠等[33]根據(jù)FAdV Ⅰ群Hexon蛋白編碼基因保守區(qū)序列，設(shè)計LAMP 擴增引物，建立了適用于FAdV Ⅰ群的LAMP 快速檢測方法，其靈敏度可達10 copies/μL，操作簡便、快速，特異性高。Yuan 等[34]建立了FAdV-4 LAMP 實時濁度法，其對FAdV-4 具有特異性，檢測下限為75 copies/μL，與qPCR 結(jié)果一致。Zhai 等[35]建立了用于快速檢測FAdV-4 的LAMP 與橫向流動試紙條（LFD）相結(jié)合的方法，其與FAdV-7、FAdV-8b 以及雞馬立克氏病毒、傳染性法氏囊病毒等均不產(chǎn)生交叉反應，最低檢測限為 10 copies/μL，靈敏度是普通PCR 的1 000 倍，比 qPCR 高10 倍，優(yōu)化后的LAMP-LFD 可在65 ℃下60 min 內(nèi)完成反應，操作簡單、耗時短，無需有害試劑和精密儀器，可以應用于資源有限的實驗環(huán)境。Fan等[36]針對雞細小病毒（ChPV）、雞傳染性貧血病毒（CIAV）和FAdV-4 研發(fā)了一種多重熒光環(huán)介導等溫擴增（mLAMP）技術(shù)。該方法特異性良好，對ChPV、CIAV 和FAdV-4 的最低檢測限分別為307、749 和648 copies/μL，可直接觀察到擴增結(jié)果，可用于基層等試驗設(shè)備有限的地區(qū)。

2.4 其他分子生物學檢測技術(shù)

隨著分子診斷技術(shù)的不斷進步，等溫擴增技術(shù)不斷應用于核酸檢測領(lǐng)域。重組聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA） 是一種簡單、先進的DNA 擴增方法[37]。RPA 可在恒溫條件下實現(xiàn)病毒核酸的快速擴增，通常在30 min 內(nèi)完成反應[38]。研究[39-40]表明，RPA 反應利用噬菌體衍生的重組酶與單鏈寡核苷酸引物結(jié)合，能夠在雙鏈DNA 中尋找同源序列，保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，發(fā)生鏈置換反應形成并啟動DNA 合成，對模板上的靶標進行指數(shù)式擴增。Zhang 等[41]研究出一種適用于檢測FAdV 12 種血清型的RPA 方法，該方法可在14 min 內(nèi)完成反應，與qPCR 相比時間縮短了74.5%，病毒DNA 核酸的陽性檢出限低至0.1 fg，靈敏性極高。為降低檢測所需的試劑量、時間以及檢測成本，Li 等[42]建立了多重反轉(zhuǎn)錄實時定量PCR（MRT-qPCR）。該方法可同時檢測可垂直傳播或造成免疫抑制的6 種禽病毒，如馬立克氏病毒（MDV）、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒（REV）、禽呼腸孤病毒（ARV）、CIAV、FAdV和傳染性法氏囊病毒（IBDV），具有高特異性、敏感性和可重復性的優(yōu)勢。Xie 等[43]利用兩種單克隆抗體（mAb），建立了針對FAdV-4 的Fiber-2蛋白編碼基因的快速膠體金試紙條。該試紙條具有高特異性，對FAdV-4 及Fiber-2 蛋白的最低檢測限分別為1×105TCID50/0.1 mL 及0.1 μg/0.1 mL，為資源有限地區(qū)提供了一種高效、便捷的診斷方法。

3 小結(jié)

FAdV Ⅰ群中的FAdV-4 主要引起HHS。HHS自1987 年首次在巴基斯坦安卡拉地區(qū)被發(fā)現(xiàn)后已在世界范圍內(nèi)普遍存在，給全球養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大威脅和經(jīng)濟損失。FAdV-4 的檢測方法目前主要包括血清學檢測方法和分子生物學檢測方法。血清學檢測中，以FAdV 重組蛋白作為包被抗原建立的ELISA 方法最為常用，其靈敏度比常規(guī)血清學檢測高很多。同時，ELISA 方法的簡便和快速等優(yōu)勢，使其成為臨床檢測FAdV 的一種重要方法。PCR 是最常用的分子生物學診斷方法，能將微量的DNA 大量擴增；qPCR 被廣泛用于多種病原體的檢測和定量，與常規(guī) PCR 相比，qPCR 具備敏感性高、特異性強，而且快速、高效、操作簡單等優(yōu)點；LAMP 反應時間短，設(shè)備要求簡單，近年來受到了眾多學者的關(guān)注；隨著分子診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，已建立出可以檢測12 種血清型的RPA 方法，這種可以檢測不同血清型FAdV 的通用檢測方法在臨床上具備獨特的優(yōu)勢。隨著檢測技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的新型檢測技術(shù)逐漸被用于FAdV-4 的快速檢測，為該病的快速診斷、防控提供了更有力技術(shù)支撐。