致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌RAA-LFD 快檢方法的建立

田飛焱，吳 葵，黃海莉，孟 霞，裴建明，劉文珍，張錦波，李小勇，周文華，顧澤茂，徐節(jié)華

（1. 江西省農業(yè)技術推廣中心，江西南昌 330046；2. 華中農業(yè)大學水產學院，湖北武漢 430070；3. 南昌市疾病預防控制中心，江西南昌 330038）

急性肝胰腺壞死?。╝cute hepatopancreas necrosis disease，AHPND）是由副溶血弧菌特定毒力 株（AHPND-causingVibrioparahaemolyticus，VpAHPND）引起的蝦類疫病。該特定毒力株攜帶的pVA1 質粒通過編碼昆蟲相關光桿菌殺蟲二元毒素（photorhabdus insect-related，Pir）pirA/B 而具有致病性[1-3]。AHPND 已在全球主要蝦類養(yǎng)殖地區(qū)暴發(fā)流行并造成了嚴重危害，為此世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）將其列為須通報水生動物疫病，2022年我國農業(yè)農村部新修訂的《一、二、三類動物疫病病種名錄》將其列為三類動物疫病。已報道的攜帶有pVA1 質粒并可引起AHPND 病例的弧菌種類包括副溶血弧菌、哈維氏弧菌（Vibrioharveyi）、歐文氏弧菌（Vibrioowensii）和坎貝氏弧菌（Vibrio campbellii）等[2，4-7]。致病菌范圍擴大無疑會增加該病的傳播風險，因此快速準確檢測AHPND 病原是防控的重要策略。

目前，針對AHPND 病原的特異性診斷主要是采用分子生物學方法對pVA1 質粒進行檢測。WOAH 推薦的AHPND 分子生物學診斷方法包括一步法PCR[8-9]、套式PCR[10]、real-time quantitative PCR（qPCR）[11]和環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification protocol，LAMP）[12]等。這些方法均需昂貴的儀器和具有較高操作技能的檢測專技人員，難以滿足基層實驗室及生產一線的現場快速檢測和普及應用。因此，有必要研究建立簡易快速、儀器依賴程度低的現場檢測新方法，以滿足蝦類健康養(yǎng)殖和疾病防控所需。重組酶介導擴增（recombinase-aid amplification，RAA）是一種新型恒溫核酸擴增技術，其顯著特點在于可實現常溫下的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）解鏈和擴增。該方法可與側流試紙條顯色技術（lateral flow dipstick，LFD）結合，從而實現檢測結果的快速、可視化判定[13]。本研究擬采用RAA 與FLD 相結合方法，針對pVA1 質粒pirB基因設計特異性引物和探針，建立特異、靈敏、可視化的RAA-LFD 快檢方法，旨在為AHPND 的現場快速檢測及診斷提供新的技術手段。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與臨床樣品

VpAHPND-65 毒力株及其他58 株副溶血弧菌，由江西省農業(yè)技術推廣中心實驗室分離、鑒定并保存；副溶血弧菌RIMD2210633 株、霍亂弧菌（Vibriocholera，Vc）Vc-175 株、 志賀氏菌（Shigellacastellani）CMCC 51572 株、 沙門氏菌（Salmonellaenterica）H9812 株，均由南昌市疾病預防控制中心菌種庫提供；白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）、傳染性皮下和造血器官壞死病病毒（infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus，IHHNV）、十足目虹彩病毒（decapod iridescent virus 1，DIV1）和蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoonhepatopenaei，EHP）的陽性病料組織，由江西省農業(yè)技術推廣中心實驗室收集、鑒定并保存。

1.2 主要試劑與儀器

RAA-nfo 核酸擴增試劑（試紙條型）盒，購自杭州眾測生物科技有限公司；雙標核酸檢測試紙條（彩虹型），購自Tiosbio 公司；Probe qPCR Mix、細菌基因組DNA 提取試劑盒，購自TAKARA（北京）公司；DNeasy Blood & Tissue Kit，購自Qiagen 公司；含3%氯化鈉的堿性蛋白胨水、TCBS 瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基等，購自北京路橋技術股份有限公司；HH.S11-1 型電熱恒溫水浴鍋，購自上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；Mastercler? ep realplex4S 熒光定量PCR 儀，購自德國Eppendorf 公司。

1.3 引物、探針設計

根據RAA-LFD 引物和探針設計原理，對GenBank 上登錄的副溶血弧菌AHPND-PirB-KKVIET1株（MN480428.1）、TX-327株（MH410660.1）、HY3 株（MH718270.1）、V.03 株（KU556825.1），歐文氏弧菌SH14 株（CP045861.1）、GL605株（CP097860.1）， 坎 貝 氏 弧 菌LMB29 株（MH890610.1）、K82 株（MN846069.1），以及哈維氏弧菌K9 株（MN846071.1）、BpShHep24株（MH423892.1）等弧菌分離株PirB基因序列進行比對分析。采用Primer 5.0 軟件設計引物和探針（表1），引物和探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 VpAHPND RAA-LFD 引物和探針信息

1.4 重組質粒標準品構建

試驗標準品選用的PirA/B基因序列（MH718270.1）長度為1 961 bp 的片段，由生工生物工程（上海）股份有限公司進行核酸片段合成，并構建重組質粒pUC57-PirA/B。按公式拷貝數濃度（copies/μL）＝ 6.02×1023× 質量濃度（ng/μL）×10-9/（堿基數×660）計算，得出本試驗質粒標準品的拷貝數濃度為1.17×1010copies/μL。

1.5 樣品DNA 提取

用接種針挑取VpAHPND-65 株及1.1 中其他各菌株菌落，分別置于含3%氯化鈉的堿性蛋白胨水、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中36 ℃搖床過夜培養(yǎng)，使用TAKARA 細菌基因組DNA 提取試劑盒，按說明書方法提取細菌基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。WSSV、IHHNV、DIV1、EHP 等DNA 樣品， 則使用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit 從相應陽性組織中提取獲得。

1.6 反應體系建立和優(yōu)化

按照眾測RAA 試劑盒說明書配制擴增體系：緩沖液A 25.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，探針（10 μmol/L）0.6 μL，模板5.0 μL，用ddH2O 補至47.5 μL。將2.5 μL 緩沖液B 添加至反應試管蓋子上，在反應開始前才可混勻，此后馬上將反應管移至恒溫水浴鍋中。首先分別在15、25、30、35、37、40 和50 ℃下擴增35 min，選取最優(yōu)反應溫度；再分別擴增1、5、10、15、20、25、30 和35 min，完成最優(yōu)反應時間篩選。擴增結果以試紙條檢測線的顯色程度為判斷標準。

1.7 特異性試驗

分別提取VpAHPND-65 毒力株、副溶血弧菌RIMD2210633 株、霍亂弧菌Vc-175 株、志賀氏菌CMCC 51572 株、沙門氏菌H9812 株以及WSSV、IHHNV、DIV1、EHP 等感染病料組織DNA 作為試驗模板，應用建立并優(yōu)化后的VpAHPNDRAA-LFD方法進行擴增，同時以標準品質粒pUC57-PirA/B為陽性對照，ddH2O 為陰性對照，觀察是否有交叉反應，分析該方法的特異性。

1.8 敏感性試驗

1.8.1 質粒檢測限分析 將構建的質粒標準品pUC57-PirA/B 進行10 倍倍比稀釋， 選取1.17×106～1.17×100copies/μL 的稀釋液作為模板，使用建立的VpAHPNDRAA-LFD 方法進行檢測，重復試驗3 次，測定該方法對質粒標準品的檢測限。同時以WOAH 推薦的實時熒光qPCR 法[11]作為對照，qPCR 法[11]引物、探針分別為VpPirA-F（5'-TTGGACTGTCGAACCAAACG-3'）、VpPirAR（5'-GCACCCCATTGGTATTGAATG-3'）和VpPirA-P（5'-FAM-AGACAGCAAACATACACCTATCATCCCGGA-TAMRA-3'）。參照Probe qPCR Mix 試劑盒說明書，配置反應體系：Probe qPCR Mix 10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.6 μL，探針（10 μmol/L）0.2 μL，模板2.0 μL，用ddH2O補至20.0 μL。反應程序：95 ℃ 20 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。

1.8.2 基因組靈敏度分析 將VpAHPND-65 毒力株按照1.5 中方法36 ℃過夜培養(yǎng)，取1 mL 菌液提取基因組DNA；同時將該過夜培養(yǎng)的菌液進行10 倍倍比稀釋，每個稀釋度各取100 μL 菌液涂布TCBS平板，36 ℃培養(yǎng)24 h 后，對其中菌落分布均勻且不致密的TCBS 平板進行菌落計數，得出該過夜培養(yǎng)的菌液菌體細胞濃度為3.8×108CFU/mL。將提取的VpAHPND-65 基因組DNA 原液進行10 倍梯度稀釋，以DNA 原液及梯度稀釋液作為模板，同時使用建立的VpAHPNDRAA-LFD 方法及WOAH 推薦的qPCR法[11]進行平行檢測，以ddH2O為陰性對照，重復試驗3 次，測定該方法所能檢測到的最低菌體細胞濃度。

1.9 重復性試驗

選 取3 個 拷 貝 數 濃 度（1.17×106、1.17×103、1.17×101copies/μL）的pUC57-PirA/B質粒標準品，進行組內和組間重復性試驗，每個拷貝數濃度設置3 個重復。

1.10 臨床樣品檢測

應用本研究建立的VpAHPNDRAA-LFD 檢測方法和WOAH 推薦的qPCR 法[11]，對實驗室保存的58 株副溶血弧菌基因組DNA 進行平行檢測，以質粒標準品為陽性對照、ddH2O 為陰性對照，比較兩種檢測方法的符合率。

2 結果

2.1 反應條件優(yōu)化

最佳反應溫度優(yōu)化結果（圖1-A）顯示，當反應溫度低于30 ℃或大于50 ℃時，試紙條未出現試驗條帶，在30 ℃時出現較弱的試驗條帶，在35～45 ℃時各試紙條試驗條帶明顯且無差異。因此，最佳反應溫度范圍為35～45 ℃。若將反應溫度設置為與人體體溫接近，則可利用人體體溫進行擴增反應，最終選擇37 ℃作為試驗反應溫度。

圖1 反應溫度和反應時間優(yōu)化結果

在37 ℃條件下，不同反應時間對擴增效果的影響結果（圖1-B）顯示，擴增5 min，試紙條上出現極微弱的試驗條帶；擴增10 min，試紙條上出現微弱的試驗條帶；擴增15～35 min，各試紙條試驗條帶明顯且無差異。因此，選擇20 min 作為該方法的反應時間。綜上，反應條件確定為37 ℃恒溫水浴鍋中擴增20 min，反應結束后使用側流層析試紙條對擴增結果進行檢測。

2.2 特異性試驗

結果（圖2）顯示，只有VpAHPND-65 毒力株和陽性對照擴增產物的試紙條檢測線出現了條帶，其他病原及陰性對照的試紙條檢測線均未出現條帶。結果表明，建立的VpAHPNDRAA-LFD 檢測方法具有較強的特異性。

圖2 特異性試驗結果

2.3 敏感性試驗

2.3.1 質粒檢測限分析 選取1.17×106～1.17×100copies/μL 的pUC57-PirA/B DNA 樣品作為模板，分別進行RAA-LFD 和qPCR 檢測。結果（圖3～4）顯示，兩種方法的最低檢出限均為1.17×101copies/μL。結果表明，建立的RAA-LFD方法具有較高的敏感性。

圖3 RAA-LFD 方法的質粒靈敏度試驗結果

圖4 qPCR 方法的質粒靈敏度試驗結果

2.3.2 基因組靈敏度分析 結果（圖5～6）顯示，以細菌基因組DNA 為模板，RAA-LFD 方法和qPCR 方法所能檢測到的最低菌體細胞濃度均為3.8×102CFU/mL。結果表明，建立的RAA-LFD方法與qPCR 方法的檢測靈敏度相當，均處于同一數量級。

圖5 RAA-LFD 方法的基因組靈敏度試驗結果

圖6 熒光PCR 方法的基因組靈敏度試驗結果

2.4 重復性試驗

選取3 個稀釋度（1.17×106、1.17×103和1.17×101copies/μL）的pUC57-PirA/B 質粒標準品，分別進行組內重復試驗，每個稀釋度設置3 個重復。結果（圖7）顯示，在檢測線處均可觀測到試驗條帶。組內試驗結束后第7 天再進行組間重復試驗，發(fā)現所有質粒標準品均得到有效擴增，控制線和檢測線均有條帶產生。結果表明，本研究建立的VpAHPNDRAA-LFD 檢測方法重復性和穩(wěn)定性良好，具有較好的應用前景。

圖7 組內重復性試驗結果

2.5 臨床樣品檢測

應用本研究建立的VpAHPNDRAA-LFD 快檢方法和WOAH 推薦的qPCR 方法[11]對實驗室保存的58 株副溶血弧菌DNA 樣品進行檢測。結果（表2）顯示，53 株副溶血弧菌為VpAHPND陰性，5 株副溶血弧菌為VpAHPND陽性，RAA-LFD 快檢方法與qPCR 結果一致。結果表明，本研究建立的VpAHPNDRAA-LFD 快檢方法和WOAH 推薦的qPCR 方法的符合率為100%，具有較高的可信度。

表2 RAA-LFD 和qPCR 方法對副溶血弧菌分離株的檢測結果比較 單位：份

3 討論

自2010 年AHPND 疫情首次被報道以來，該病一直困擾著全球蝦類養(yǎng)殖業(yè)，目前仍無控制或減少其病原傳播的有效手段。因此在疫情早期，準確和快速檢測VpAHPND在疾病防控中起著關鍵作用。AHPND 由副溶血弧菌的特定毒力株（VpAHPND）引起。2014 年以來，研究人員針對該特定毒力株（VpAHPND）的毒性質粒（pVA1）基因先后開發(fā)了不同分子檢測技術，包括一步法PCR，套式PCR，qPCR 和LAMP 等。但是這些方法費時費力且依賴專業(yè)和昂貴的儀器設備，在資源匱乏的疾病流行區(qū)域難以進行現場診斷。近些年，等溫擴增技術（isothermal amplification technology，IAT）因具有不需依賴復雜的儀器，能夠快速、準確地進行病原檢測等優(yōu)點，已作為PCR 和LAMP 等方法的替代方案得到廣泛應用。Mai 等[14]建立了一種檢測AHPND 病原的重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）方法，其在39 ℃恒溫條件下反應30 min 后可通過凝膠電泳儀分析檢測結果；陳平亞等[15]建立了一種檢測AHPND病原的實時熒光RAA 檢測方法，其檢測結果需通過熒光檢測設備進行分析，最低質粒檢出限達到了8.2×101copies/μL。上述兩種恒溫擴增檢測方法的結果分析都依賴儀器設備，這在一定程度上限制了其在基層實驗室和養(yǎng)殖現場的應用。

LFD 是一種靈敏度高、檢測時間短的現場可視化檢測技術。華俊等[16]將RPA 與LFD 技術結合，建立了禽呼腸孤病毒RT-RPA-LFD 檢測方法，該方法在37 ℃條件下反應20 min 即可通過側流試紙條直觀觀測結果。本研究將RAA 與LFD 結合，建立了VpAHPNDRAA-LFD 檢測方法，該方法能夠在較寬的溫度范圍（35～45 ℃）正常工作，反應溫度接近人體體溫；反應耗時短，能夠在20 min 內完成擴增；反應完成后，側流層析試紙條在5 min內顯色，檢測結果可通過肉眼觀測。上述優(yōu)勢進一步降低了該方法對儀器的依賴程度，適用于控溫條件較差的養(yǎng)殖現場環(huán)境，如可利用簡易的水浴鍋或人體手掌心在較短時間內完成控溫擴增反應，最后通過LFD 的可視化顯色情況來判定結果。此外，建立的VpAHPNDRAA-LFD 檢測方法靈敏度高，可檢測到的最低菌體細胞濃度為3.8×102CFU/mL，最低質粒（pUC57-PirA/B）DNA 拷貝數濃度為1.17×101copies/μL，與WOAH 推薦的qPCR 方法靈敏度相當；特異性強，僅副溶血弧菌特定毒力株（VpAHPND）核酸檢測為陽性；組內和組間重復試驗表明該方法的重復性和穩(wěn)定性良好；RAA-LFD和qPCR 方法同時對實驗室分離保存的58 株副溶血弧菌的檢測符合率為100%，說明VpAHPNDRAALFD 快檢方法亦具有良好的可信度。

在設計引物時，本研究對NCBI 上登錄的副溶血弧菌、哈維氏弧菌、歐文氏弧菌和坎貝氏弧菌攜帶的pVA1 質?；蜻M行了比較分析，發(fā)現這些基因序列相似度較高，但由于暫未獲得攜帶pVA1 質粒的哈維氏弧菌、歐文氏弧菌和坎貝氏弧菌，因此有待后續(xù)獲得上述菌株后再進行本方法的測試應用。

綜上，本研究建立的VpAHPNDRAA-LFD 檢測方法能夠在接近人體體溫的溫度范圍（35～45 ℃）快速完成擴增反應，操作簡單，結果肉眼可視，且具有較高的靈敏度和特異性以及良好的重復性和可信度，因此作為一種快速診斷方法具有潛在的應用前景。