巨噬細(xì)胞條件性GP73基因敲除小鼠的構(gòu)建及鑒定

黃慶 甄蘭 趙桂霖 趙汝舟 葉新萍 吳飛翔，4，5

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科；100850 北京2軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所；

410007 長(zhǎng)沙3湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心；530021 南寧4廣西肝癌診療工程技術(shù)研究中心；

530021 南寧5區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣西醫(yī)科大學(xué)）

高爾基體蛋白73（golgi protein 73，GP73）是由KLADNEY 等［1］于2000 年發(fā)現(xiàn)的一種定位于高爾基體的Ⅱ型跨膜蛋白。GP73 包含一個(gè)N 端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域及一個(gè)C 端卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，距離N 端55 位氨基酸處存在一個(gè)可被弗林蛋白酶（furin）識(shí)別并切割的位點(diǎn)，切割后可將GP73 從細(xì)胞中釋放出來(lái)［2］。研究表明，GP73 在肝癌等多種肝臟疾病中顯著升高，可作為肝臟疾病的血清標(biāo)志物［3-4］。在胰腺癌細(xì)胞中GP73 高表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)其侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移［5］；在胃癌中GP73 表達(dá)下調(diào)且與腫瘤分化密切相關(guān)［6］；GP73 也能通過(guò)激活TGF-β1/Smad2 信號(hào)通路促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［7］。此外，有研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)GP73 可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)［8］；GP73 通過(guò)刺激鄰近巨噬細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活，從而使巨噬細(xì)胞釋放參與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAM）表型的細(xì)胞因子和趨化因子，且阻斷GP73 可降低TAM 的密度，抑制腫瘤生長(zhǎng)以及延長(zhǎng)生存期［9］。然而，GP73 的病理及生理功能尚未完全清楚，有關(guān)巨噬細(xì)胞中GP73相關(guān)功能的研究甚少，其在腫瘤性疾病中的作用和機(jī)制亟待探究。

Cre/LoxP 重組系統(tǒng)是由STERNBERG 等［10］于1981 年提出的一種位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，包含Cre 重組酶和LoxP 位點(diǎn)兩部分。LoxP 位點(diǎn)為P1 噬菌體上一長(zhǎng)34 bp的堿基序列，該位點(diǎn)可被Cre重組酶特異性識(shí)別。在目的基因兩側(cè)插入LoxP 位點(diǎn)的過(guò)程稱之為flox 修飾，當(dāng)位于同一DNA 鏈上的2 個(gè)LoxP 位點(diǎn)方向相同時(shí)，將介導(dǎo)2 個(gè)LoxP 位點(diǎn)之間的DNA 序列特異性缺失［11］。小鼠溶菌酶基因（lysozyme 2，Lyz2）主要在巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞等髓系細(xì)胞中表達(dá)，負(fù)責(zé)編碼溶菌酶M（lysozyme M，LysM）［12］。通過(guò)將Cre 重組酶插入小鼠Lyz2基因起始密碼子處，得到Lyz2基因Cre 陽(yáng)性小鼠，再將其與flox 修飾的GP73小鼠雜交，從而構(gòu)建出巨噬細(xì)胞條件性GP73基因敲除小鼠。本研究采用Cre/LoxP 重組系統(tǒng)構(gòu)建巨噬細(xì)胞條件性GP73基因敲除小鼠，同時(shí)在基因組和蛋白水平對(duì)其進(jìn)行鑒定分析，為進(jìn)一步研究GP73調(diào)控巨噬細(xì)胞功能在腫瘤性疾病中發(fā)揮的作用和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8 周齡SPF 級(jí)C57BL/6J 背景GP73flox/+小鼠及Lyz2-Cre+小鼠各3 只，均為雄性1 只和雌性2 只，體質(zhì)量20～25 g，均購(gòu)自上海南方模式生物科技股份有限公司（動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK瀘2023-0005）。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照SPF 級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～24 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，晝夜各半循環(huán)照明，自由飲水進(jìn)食。本研究符合廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求（倫理審批號(hào)：LW2023123）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

小鼠組織直接PCR 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bimake 生物科技有限公司；DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；核酸染料購(gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；總RNA 提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)MACHEREY-NAGEL 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Perfect-Start?Green qPCR SuperMix 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；小鼠GP73抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；β-tubulin 抗體購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；NP40 裂解液、5×SDS 上樣緩沖液購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；Super ECL Detection Reagent購(gòu)自上海翌圣生物科技有限公司。

1.3 小鼠的構(gòu)建與繁殖

GP73flox/+小鼠由上海南方模式生物科技股份有限公司構(gòu)建。應(yīng)用Cre/LoxP 技術(shù)將LoxP 位點(diǎn)設(shè)置于GP73基因4 號(hào)外顯子區(qū)域兩端，對(duì)小鼠GP73基因進(jìn)行flox 修飾，從而構(gòu)建出GP73flox/+小鼠（圖1A）。將GP73flox/+小鼠雌雄自交，子代得到GP73flox/flox小鼠。將GP73flox/flox小鼠與Lyz2-Cre+小鼠雜交，子代得到GP73flox/+Lyz2-Cre+小鼠，將其與GP73flox/flox小鼠雜交，最終得到基因型為GP73flox/floxLyz2-Cre+的巨噬細(xì)胞條件性GP73基因敲除小鼠（macrophageGP73knockout mice，MKO小鼠）；GP73flox/floxLyz2-Cre-小鼠作為對(duì)照組小鼠，后續(xù)稱為GP73fl/fl小鼠（圖1B）。

圖1 巨噬細(xì)胞條件性GP73基因敲除小鼠構(gòu)建與繁殖Fig.1 Construction and reproduction of macrophageconditional GP73 gene knockout mice

1.4 小鼠基因組DNA的提取、擴(kuò)增及鑒定

1.4.1 鼠尾DNA提取 剪取3～8周齡小鼠尾尖2～5 mm置于1.5 mL EP管，每支EP管加入100μL新配置的組織消化液，55 ℃金屬浴消化15 min，95 ℃金屬浴孵育5 min，12 000 r/min 離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中渦旋振蕩，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物鑒定 PCR反應(yīng)體系（20μL）：2×M-PCR OPTI?Mix 10 μL，正反向引物各1 μL（10μmol/L），DNA 模板2μL，去離子水6μL。引物序列見(jiàn)表1。PCR 反應(yīng)程序：flox 基因型擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃3 min；94 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min；12 ℃30 min。Lyz2-Cre 基因型擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃3 min；94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min；12 ℃30 min。將以上鼠尾基因組PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳（135 V，30 min），電泳完成后使用凝膠成像儀拍攝并分析結(jié)果。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.5 巨噬細(xì)胞GP73基因敲除效果驗(yàn)證

1.5.1 骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophages，BMDMs）分離和培養(yǎng) 選取6～8 周齡GP73fl/fl和MKO 小鼠各6 只，異氟烷過(guò)量麻醉處死小鼠后，置于超凈臺(tái)中分離股骨和脛骨，用10 mL 預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞篩過(guò)濾后，4 ℃、1 500 r/min 離心3 min，棄去上清液；吸取適量紅細(xì)胞裂解液重懸沉淀，靜置1～2 min，4 ℃、1 500 r/min 離心3 min，棄去上清液。重懸細(xì)胞沉淀后接種至含DMEM 培養(yǎng)基+10%胎牛血清+20 ng/mL M-CSF 的培養(yǎng)皿，每3 d換液，第7天即為成熟的BMDMs。

1.5.2 腹腔原位巨噬細(xì)胞（peritoneal macrophages，PM）分離培養(yǎng) 選取6～8周齡GP73fl/fl和MKO小鼠各6只，吸取適量預(yù)冷的1640 培養(yǎng)基注入小鼠腹腔，輕揉小鼠腹部1～2 min，用注射器將小鼠腹腔液吸出并轉(zhuǎn)入離心管中，4 ℃、1 500 r/min 離心3 min，棄去上清液，用適量1640 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀接種至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

1.6 qPCR檢測(cè)GP73基因表達(dá)水平

將培養(yǎng)完成后的BMDMs 及PM 的培養(yǎng)基棄去，PBS清洗3次后加入適量RNA提取試劑，提取總RNA，測(cè)定濃度及純度后行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系（20 μL）：5×EasyScript?All-in-One SuperMix for qPCR 4 μL，基因組DNA 去除劑1 μL，總RNA 1 μL，無(wú)RNA 酶水補(bǔ)齊。反轉(zhuǎn)錄程序：25 ℃孵育10 min；42 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃，30 min。qPCR 體系（20 μL）：2×qPCR SuperMix 10 μL，正反向引物各1 μL（10 μmol/L），cDNA模板2μL，去離子水6μL。反應(yīng)程序：94 ℃30 s；94 ℃5 s，60 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)；qPCR引物序列見(jiàn)表1。GP73fl/fl及MKO小鼠各6個(gè)樣本，擴(kuò)增內(nèi)參基因β-actin及目的基因GP73，每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算GP73mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 Western blot檢測(cè)GP73蛋白表達(dá)水平

選取6～8 周齡GP73fl/fl和MKO 小鼠各3 只，解剖取出肝臟、腎臟及胸腺組織，分別稱取50 mg 置于含NP40 裂解液的研磨管中，低溫研磨至溶液澄清，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，吸取上清液備用。培養(yǎng)完成后的BMDMs 及PM 的培養(yǎng)基棄去，PBS 清洗3 次后加入適量NP40 裂解液，待細(xì)胞完全裂解后，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，吸取上清液備用。上述樣品經(jīng)BCA 法定量后加入SDS 上樣緩沖液煮樣，-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

將上述蛋白樣品行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒壓電泳完成后，采用濕轉(zhuǎn)法100 V 恒壓轉(zhuǎn)膜60 min；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h；分別置于1×TBST 稀釋的GP73 多克隆抗體（1∶1 000）、β-tubulin 單克隆抗體（1∶10 000）中，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜；1×TBST 清洗3次，每次10 min。加入1×TBST緩沖液稀釋的辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶5 000），置于搖床室溫孵育1 h；1×TBST 清洗3 次，每次10 min；最后配置ECL 化學(xué)發(fā)光液并顯影保存。

1.8 小鼠組織器官生長(zhǎng)發(fā)育評(píng)價(jià)

各取6 只GP73fl/fl小鼠及MKO 小鼠稱重記錄。解剖取出小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、棕色脂肪、白色脂肪等主要組織器官，稱重并計(jì)算組織與體重的比值。每組各抽取3只拍照保存。

1.9 小鼠血生化指標(biāo)的檢測(cè)

各取3 只GP73fl/fl及MKO 小鼠，經(jīng)內(nèi)眥靜脈取血，靜置1 h后，3 500 r/min 離心10 min，取上層血清備用。采用全自動(dòng)生化分析儀，按操作說(shuō)明，上機(jī)檢測(cè)兩組小鼠丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、血糖（glucose，Glu）、肌酐（creatinine，CRE）、尿素（urea，UREA）及尿酸（uric acid，UA）的水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.4.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組樣本之間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠基因型鑒定

通過(guò)flox 引物僅擴(kuò)增出408 bp 單條帶的小鼠基因型為GP73flox/flox純合子，僅擴(kuò)增出356 bp 單條帶的小鼠基因型為GP73+/+，同時(shí)擴(kuò)增出356 bp 和408 bp雙條帶的小鼠基因型為GP73flox/+雜合子。通過(guò)Cre 引物擴(kuò)增出700 bp 單條帶的小鼠基因型為L(zhǎng)yz2-Cre+，未擴(kuò)增出條帶的小鼠基因型為L(zhǎng)yz2-Cre-。PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，7、10 號(hào)小鼠flox 兩條帶且Cre 無(wú)條帶，為GP73flox/+小鼠；4 號(hào)小鼠flox 兩條帶且Cre 有條帶，為GP73flox/+Lyz2-Cre+小鼠；5、8、12號(hào)小鼠flox單條帶且Cre有條帶，為GP73flox/floxLyz2-Cre+小鼠；6、9、11號(hào)小鼠flox單條帶且Cre無(wú)條帶，為GP73flox/floxLyz2-Cre-小鼠（圖2）。

圖2 小鼠基因型PCR鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of mouse genotype by PCR

2.2 巨噬細(xì)胞GP73基因敲除效果的驗(yàn)證

2.2.1 基因水平敲除效果鑒定 提取GP73fl/fl和MKO小鼠BMDMs、PM總RNA，利用qPCR檢測(cè)其GP73mRNA水平，結(jié)果顯示，MKO小鼠BMDMs、PM中GP73mRNA水平均較GP73fl/fl小鼠明顯降低（P＜0.0001）（圖3A）。

圖3 巨噬細(xì)胞GP73基因敲除效果Fig.3 GP73 gene knockout efficiency in macrophages

2.2.2 蛋白水平敲除效果鑒定 利用Western blot 檢測(cè)小鼠BMDMs、PM、肝臟、腎臟及胸腺中GP73蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，MKO小鼠BMDMs、PM中GP73蛋白表達(dá)水平均較GP73fl/fl小鼠顯著降低，而在肝臟、腎臟及胸腺中，兩組小鼠GP73蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3B）。表明GP73在巨噬細(xì)胞特異性敲除，巨噬細(xì)胞條件性GP73基因敲除小鼠模型構(gòu)建成功。

2.3 小鼠各組織器官生長(zhǎng)發(fā)育情況

解剖12 周齡的GP73fl/fl及MKO 小鼠，取主要器官進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和稱量，結(jié)果顯示，MKO 小鼠與GP73fl/fl小鼠相比，心、肝、脾、肺、腎、棕色脂肪及白色脂肪組織重量與體重之比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（圖4A），各組織無(wú)顯著形態(tài)學(xué)差異（圖4B）。表明巨噬細(xì)胞條件性GP73基因敲除未影響小鼠各組織器官的發(fā)育。

圖4 小鼠各組織/體重及形態(tài)學(xué)觀察Fig.4 Tissue/body weight and morphological observation of mice

2.4 小鼠血生化指標(biāo)的比較

提取GP73fl/fl及MKO 小鼠血清，血生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（表2）顯示，MKO 小鼠與GP73fl/fl小鼠相比，各項(xiàng)血生化指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表2 小鼠血生化指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of blood biochemical indexes in the mice

3 討論

目前Cre/LoxP 重組系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于條件性基因敲除小鼠的構(gòu)建，基因敲除小鼠也是研究基因功能的重要模型［13］。為了研究巨噬細(xì)胞的功能，多種巨噬細(xì)胞基因敲除小鼠已被報(bào)道構(gòu)建成功，例如Akt1flox/floxLyz2-Cre+、Atg5flox/floxLyz2-Cre+及Septin7flox/flox-Lyz2-Cre+小鼠等［14-16］。M?LLERS等［17］發(fā)現(xiàn)在髓樣干細(xì)胞向成熟巨噬細(xì)胞分化時(shí)，LysM的活性逐漸增強(qiáng)。ABRAM 等［18］研究表明，雖然LysM也在部分樹(shù)突狀細(xì)胞及粒細(xì)胞中表達(dá)，但是LysM-Cre+小鼠對(duì)成熟巨噬細(xì)胞的基因有著較高的敲除效率。因此，Lyz2-Cre+工具鼠常被用于巨噬細(xì)胞基因功能的研究。

越來(lái)越多的研究表明，GP73 在巨噬細(xì)胞中具有重要病理生理功能，且GP73 和巨噬細(xì)胞均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近期研究發(fā)現(xiàn)，GP73 可通過(guò)影響NF-κB/NLRP3炎癥小體信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［19］。GP73 作為先天免疫的負(fù)調(diào)節(jié)因子，還能通過(guò)與MAVS/TRAF6相互作用并促進(jìn)MAVS/TRAF6降解，促進(jìn)丙型肝炎病毒感染［20］；通過(guò)抑制先天性免疫反應(yīng)和NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)乙型肝炎病毒復(fù)制［21］；乙型肝炎病毒通過(guò)激活GP73而抑制宿主的先天性免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)展［22］。有研究發(fā)現(xiàn)，胃癌中GP73 高表達(dá)會(huì)降低新輔助化療的療效，且GP73 為胃癌患者新輔助化療預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素［23］；膽管癌患者術(shù)前GP73 血清水平升高時(shí)，其術(shù)后總生存率顯著降低［24］。此外，研究表明，巨噬細(xì)胞參與構(gòu)成腫瘤免疫微環(huán)境，其可通過(guò)促進(jìn)腫瘤血管生成、誘導(dǎo)腫瘤免疫耐受等途徑，導(dǎo)致腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移［25-26］。然而，現(xiàn)有的研究尚未能完全揭示GP73 調(diào)控巨噬細(xì)胞功能的機(jī)制及對(duì)腫瘤性疾病進(jìn)展的影響，亦無(wú)可靠的巨噬細(xì)胞條件性GP73基因敲除小鼠模型可供科研選擇。因此，構(gòu)建該小鼠模型對(duì)研究GP73調(diào)控巨噬細(xì)胞功能在腫瘤性疾病中的作用和機(jī)制至關(guān)重要。

本研究應(yīng)用Cre/LoxP 重組系統(tǒng)成功構(gòu)建巨噬細(xì)胞條件性GP73基因敲除小鼠，通過(guò)基因組和蛋白水平對(duì)其敲除效果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)MKO 小鼠巨噬細(xì)胞GP73 表達(dá)水平顯著降低，而肝臟、腎臟及胸腺組織中GP73 表達(dá)正常，說(shuō)明MKO 小鼠特異性敲除了巨噬細(xì)胞的GP73基因，且其他組織的GP73 表達(dá)未受影響，但樹(shù)突狀細(xì)胞、粒細(xì)胞等髓系細(xì)胞中GP73 表達(dá)水平仍需進(jìn)一步檢測(cè)。此外，MKO 小鼠各組織的生長(zhǎng)發(fā)育及血生化指標(biāo)與對(duì)照小鼠無(wú)顯著差異，說(shuō)明MKO小鼠發(fā)育良好，未出現(xiàn)早期胚胎死亡、發(fā)育畸形等問(wèn)題，且肝臟、腎臟等主要臟器的生長(zhǎng)及功能未受到顯著影響。因此，MKO 小鼠滿足了作為研究GP73基因功能動(dòng)物模型的基本條件。綜上，該模型的成功建立，為深入研究GP73調(diào)控巨噬細(xì)胞功能在腫瘤性疾病中的作用和機(jī)制提供了良好的動(dòng)物模型。