茯磚茶加工過(guò)程中主要活性物質(zhì)的變化及其抗氧化活性研究

摘 要：研究了陜西茯磚茶不同發(fā)花時(shí)期主要活性成分的變化和抗氧化活性.研究發(fā)現(xiàn)茯磚茶發(fā)花第1天、第5天、第20天三組樣品可溶性蛋白、總多酚、游離氨基酸含量總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，總黃酮呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)（plt;0.05）.可溶性糖含量總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中鼠李糖、葡萄糖含量總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，阿拉伯糖、半乳糖含量呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)，甘露糖含量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，木糖含量保持不變（plt;0.05）.發(fā)花第1天、第5天、第20天三組樣品抗氧化活性指標(biāo)中還原力、亞鐵離子螯合能力、ABTS自由基清除能力與樣品濃度呈正相關(guān)，在樣品濃度較高時(shí)均表現(xiàn)出了較好的抗氧化活性.在低濃度時(shí)（0.01～0.05 mg/mL），發(fā)花第5天和發(fā)花第20天的還原力相較于第1天的還原力顯著增強(qiáng)（plt;0.05）.研究結(jié)果可為茯磚茶的標(biāo)準(zhǔn)化加工和開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù).

關(guān)鍵詞：茯磚茶； 發(fā)花時(shí)間； 活性成分； 抗氧化活性

中圖分類號(hào)：TS272.5+4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

Study on the change of main active substances and antioxidantactivity in the processing of Fuzhuan tea

MAO Wen-bin， SUN Yu-jiao*， GUO Meng-yuan， LI Bao-bao， YUAN Xu-shuang， Hao Jun-yu

（School of Food Science and Engineering， Shaanxi University of Science amp; Technology， Xi′an 710021， China）

Abstract：This article studied the changes in the main active ingredients and antioxidant activity of Shaanxi Fuzhuan brick tea at different flowering stages.The study found that the soluble protein，total polyphenols，and free amino acid content of the three groups of samples from Fuzhuan brick tea showed an overall downward trend on the 1st，5th，and 20th day of flowering，while the total flavonoids showed a first decreasing and then increasing trend （plt;0.05）.The overall soluble sugar content showed a trend of first increasing and then decreasing，with the content of rhamnose and glucose showing an overall downward trend，the content of arabinose and galactose showing a trend of first decreasing and then increasing，the content of mannose showing an upward trend，and the content of xylose remaining unchanged （plt;0.05）.On the 1st，5th，and 20th day of blooming，the antioxidant activity indicators of the three groups of samples showed a positive correlation with sample concentration，including reducing ability，ferrous ion chelating ability，and ABTS free radical scavenging ability.They all exhibited good antioxidant activity at high sample concentrations.At low concentrations （0.01～0.05 mg/mL），the reducing power on the 5th and 20th day of flowering was significantly enhanced compared to the first day （plt;0.05）.The research results can provide theoretical basis for the standardized processing and development and utilization of Fuzhuan tea.

Key words：Fuzhuan brick tea; flowering time; active ingredients; antioxidant activity

0 引言

茶是一種重要的農(nóng)產(chǎn)品，由茶樹(shù)的鮮葉和嫩芽制成，是世界上消費(fèi)量最大的功能飲料.它在飲食和藥用方面有著悠久的歷史，特別是在中國(guó)、日本、印度和泰國(guó)等亞洲國(guó)家，已有5 000多年的歷史［1-3］.根據(jù)生產(chǎn)工藝，中國(guó)商業(yè)茶可分為不同類型，如綠茶、紅茶、烏龍茶、白茶、黃茶和黑茶［4］等.作為一種主要的黑茶，茯磚茶（Fuzhuan brick Tea，F(xiàn)BT）被稱為邊銷(xiāo)茶或邊境茶，是少數(shù)民族特有的飲品.此外，茯磚茶也是生活在蔬菜和水果非常稀少的中國(guó)西南部和西北部邊境地區(qū)的少數(shù)民族的生活必需品之一［5，6］.茯磚茶是以原生黑茶為原料，經(jīng)過(guò)蒸、堆、壓、微生物發(fā)酵、干燥等工序制成的，是一種獨(dú)特的后發(fā)酵茶，主要產(chǎn)于中國(guó)湖南省和陜西?。?，8］.此外，茯磚茶是一種本土微生物發(fā)酵茶，其特點(diǎn)是在其生產(chǎn)過(guò)程中以冠突散囊菌為主的微生物生長(zhǎng)［9，10］.

冠突散囊菌（Aspergillus cristatus，A.cristatus）是一種益生菌［11］，它是茯磚茶發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物［12］，它的質(zhì)量和數(shù)量對(duì)茯磚茶品質(zhì)優(yōu)劣起到關(guān)鍵性作用.在發(fā)酵過(guò)程中，冠突散囊菌分泌胞外酶，促進(jìn)茶葉中化合物的代謝，從而影響茯磚茶的品質(zhì)［13］.

本文以茯磚茶不同發(fā)花時(shí)期為研究對(duì)象研究了發(fā)花第1天、第5天和第20天樣品可溶性糖、可溶性蛋白、總多酚、總黃酮、游離氨基酸等主要活性物質(zhì)，以及以還原力、亞鐵離子螯合力、ABTS自由基清除率和DPPH自由基清除率為測(cè)定指標(biāo)的抗氧化活性.以期為茯磚茶生產(chǎn)實(shí)踐提供理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)依據(jù)，具有重要的理論和實(shí)踐意義.

1 材料與方法

1.1 原材料和儀器

（1）主要材料與試劑：發(fā)花第1天、第5天、第20天的茯磚茶，由陜西樸道茶業(yè)股份有限公司提供；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)單糖、2，4，6-三吡啶基-S-三嗪（TPTZ）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS），購(gòu)于上海市阿拉丁生化科技股份有限公司；Folin-Denis購(gòu)于Sigma公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

（2）主要儀器：GC-2010 pro氣相色譜儀，日本島津公司；T2600紫外分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司.

1.2 茯磚茶的浸提物提取和制備

將茯磚茶發(fā)花第1天、第5天、第20天的茶磚粉碎后過(guò)80目篩，茶粉干燥保存?zhèn)溆?分別取三組樣品，以1∶100（m/v）的料液比加入蒸餾水，于90 ℃下攪拌浸提2 h，離心收集上清液，凍干，得到三組水浸提物.

1.3 茯磚茶不同發(fā)花時(shí)期主要活性成分的測(cè)定

1.3.1 可溶性糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法［14］測(cè)定樣品中的可溶性糖含量，葡萄糖（Glucose，Glc）標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.2 mg/mL.分別取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL Glc標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，添加蒸餾水至2.0 mL.加入50 μL濃度為80%的苯酚溶液，再加入2.5 mL濃硫酸，靜置10 min，劇烈振蕩后再靜置20 min，于490 nm處測(cè)量樣品的吸光值.根據(jù)Glc的質(zhì)量和吸光度，繪制標(biāo)曲.吸取50 μL待測(cè)樣品，按照上述方法進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算出樣品的可溶性糖含量.

1.3.2 可溶性蛋白含量的測(cè)定

采用Braford法［15］測(cè)定可溶性蛋白含量，雞白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.1 mg/mL.分別取雞白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于試管中，補(bǔ)水至1.0 mL，加入5.0 mL的考馬斯亮藍(lán)溶液，劇烈振蕩后靜置10 min，于590 nm處測(cè)量其吸光度.根據(jù)雞白蛋白的吸光值和質(zhì)量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.分別吸取400 μL待測(cè)樣品，按照上述方法進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算出樣品的可溶性蛋白含量.

1.3.3 總多酚含量的測(cè)定

采用福林-酚法［16］測(cè)定多酚含量，沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.05 mg/mL.分別取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL于試管中，補(bǔ)水至2.0 mL，加入0.25 mL的Folin-Denis溶液，劇烈振蕩后在0.5～8 min內(nèi)加入2.5 mL 7.5%（w/v）碳酸鈉溶液.混勻避光放置60 min，于760 nm處測(cè)量其吸光度.根據(jù)沒(méi)食子酸的吸光值和質(zhì)量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.分別吸取50 μL待測(cè)樣品，按照上述方法進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算出樣品的總多酚含量.

1.3.4 總黃酮含量的測(cè)定

采用硝酸鋁比色法［17］測(cè)定黃酮含量，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.3 mg/mL.分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.125 mL、0.250 mL、0.375 mL、0.500 mL、0.625 mL、0.750 mL、0.875 mL、1.000 mL于試管中，每管用蒸餾水補(bǔ)到2.0 mL.分別加入40 μL 5% （w/v）NaNO2溶液搖勻，靜置6 min，加入40 μL 10%（w/v）Al（NO3）3溶液搖勻，靜置6 min，加入320 μL 4% NaOH，再次混勻，靜置10 min，于510 nm測(cè)量其吸光度.根據(jù)蘆丁的吸光值和質(zhì)量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.分別吸取100 μL待測(cè)樣品，按照上述方法進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算出樣品的總黃酮含量.

1.3.5 游離氨基酸含量的測(cè)定

采用茚三酮比色法［18］測(cè)定游離氨基酸含量，谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為10 mg/mL，將其分別稀釋為濃度0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0. 4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液.分別吸取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液1.0 mL于試管中，加入0.5 mL pH 8.0的磷酸鹽緩沖液和0.5 mL 2%（w/v）茚三酮溶液，沸水浴中加熱15 min，待冷卻后每管加水定容至25 mL，靜置10 min后，于570 nm處測(cè)量其吸光度.根據(jù)谷氨酸的吸光值和質(zhì)量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.分別吸取1 mL待測(cè)樣品，按照上述方法進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算出樣品的游離氨基酸含量.

2%茚三酮溶液：稱取水合茚三酮2 g，加50 mL蒸餾水和80 mg氯化亞錫攪拌均勻.分次加入少量水溶解，放在暗處，靜置過(guò)夜，過(guò)濾后加水定容至100 mL.

1.3.6 單糖組成的測(cè)定

采用高效氣相色譜法測(cè)定樣品的單糖組成，根據(jù)我們之前的方法進(jìn)行樣品的衍生化［19］.取1.8 mL的樣品，加入200 μL的三氟乙酸于121 ℃下水解3 h，結(jié)束后用NaOH溶液調(diào)節(jié)樣品pH至中性以上，加入30 mg硼氫化鈉，振蕩后室溫下放置1.5 h；逐滴加入36%冰乙酸分解多余的硼氫化鈉直至無(wú)氣泡產(chǎn)生，隨后將樣品于60 ℃下減壓蒸干，加入6 mL 0.1%（v/v）鹽酸甲醇溶液，振蕩后減壓蒸干，重復(fù)多次以除去多余的硼酸根；將剩余物在105 ℃烘箱中高溫加熱20 min以除去多余的水分，繼續(xù)將樣品沸水浴1 h，反應(yīng)結(jié)束后加入1 mL二氯甲烷和1 mL水充分震蕩溶解剩余物，對(duì)樣品進(jìn)行萃取、離心、去水相，保留有機(jī)相，重復(fù)三次，進(jìn)行GC分析.內(nèi)標(biāo)物肌醇、七種單糖標(biāo)準(zhǔn)品：鼠李糖（Rhamnose，Rha）、巖藻糖（Fucose，F(xiàn)uc）、阿拉伯糖（Arabinose，Ara）、木糖（Xylose，Xyl）、甘露糖（Mannose，Man）、葡萄糖（Glucose，Glc）、半乳糖（Galactose，Gal）以同樣方法衍生化后進(jìn)行氣相檢測(cè).

將樣品譜圖中的各個(gè)色譜峰與各標(biāo)準(zhǔn)單糖的出峰時(shí)間進(jìn)行對(duì)比可確定其單糖組成，計(jì)算出樣品單糖組成摩爾比率及含量.

氣相色譜檢測(cè)條件：使用GC-2010 Pro氣相色譜儀，Rtx-50色譜柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 mm），火焰離子檢測(cè)器（FID）.具體如下：升溫程序：以6 ℃/min的速率從180 ℃升溫至210 ℃，以0.3 ℃/min的速率從210 ℃升溫至215 ℃，再以6 ℃/min的速率從215 ℃升溫至240 ℃，240 ℃保溫半小時(shí).載氣：氮?dú)夂蜌錃猓涣魉伲?.88 mL/min；進(jìn)樣體積：0.5 μL；分流比19∶1.進(jìn)樣口溫度和檢測(cè)器溫度分別為270 ℃和280 ℃.

1.4 茯磚茶抗氧化能力的測(cè)定

1.4.1 還原力的測(cè)定

參考Zhang等［20］的方法，并稍作修改.將發(fā)花第1天、第5天和第20天樣品分別配制成0.01 mg/mL、 0.025 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL，將抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照配制為0.001 mg/mL、0.0025 mg/mL、0.005 mg/mL、0.01 mg/mL、0.02 mg/mL的樣品待測(cè)液.向試管中加入1 mL不同濃度的待測(cè)樣品溶液后，依次添加1 mL pH 6.6的0.2 M磷酸鹽緩沖液和0.125 mL的1%（w/v）的鐵氰化鉀溶液，將反應(yīng)液置于50 ℃的水浴鍋中水浴20 min后，加入0.125 mL的10%（w/v）三氯乙酸終止反應(yīng)，再添加1.5 mL的0.1% （w/v）三氯化鐵顯色，振蕩均勻，空白對(duì)照組選用蒸餾水，于700 nm下用UV分光光度計(jì)測(cè)量樣品溶液的吸光度值.平行測(cè)定三次，得到各個(gè)濃度的平均吸光度值，樣品的吸光值越高表示還原力越強(qiáng).

pH 6.6的0.2 M磷酸鹽緩沖液：分別配制0.2 M Na2HPO4（甲）和0.2 M NaH2PO4（乙），甲液取40 mL，乙液取60 mL，混合后就是pH 6.64的溶液.

1.4.2 亞鐵離子螯合能力的測(cè)定

參考Zhang等［20］的方法，并稍作修改.將發(fā)花第1天、第5天和第20天樣品分別配制為0.025 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6" mg/mL，將抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照配制為0.002 5 mg/mL、0.005 mg/mL、0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06" mg/mL的樣品待測(cè)液.使用之前，將Ferric Ion Reducing Antioxidant Power （FRAP）工作液加熱到37 ℃，將0.1 mL不同濃度的樣品溶液加入試管中，然后加入1 mL的FRAP工作液，振蕩均勻，將反應(yīng)液放入37 ℃的水浴鍋中水浴5 min，空白對(duì)照組選用蒸餾水，于593 nm下用UV分光光度計(jì)測(cè)量樣品溶液的吸光度值.平行測(cè)定三次，得到各個(gè)濃度的平均吸光度值.以吸光度值大小作為亞鐵離子螯合能力大小，樣品的吸光值越高代表亞鐵離子還原能力越強(qiáng).

FRAP試劑：配制pH 3.6的300 mM乙酸鹽緩沖液、10 mM的TPTZ和20 mM的三氯化鐵溶液并按照體積比10：1：1混合即可.

1.4.3 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考Chen等［21］的方法，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷?將發(fā)花第1天、第5天和第20天樣品分別配制為0.6 mg/mL、0.4 mg/mL、0.2 mg/mL、0.1 mg/mL、0.05 mg/mL、0.025" mg/mL，將抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照配制為為0.06 mg/mL、0.04 mg/mL、0.02 mg/mL、0.01 mg/mL、0.005 mg/mL、0.002 5" mg/mL的樣品待測(cè)液.然后添加2 mL配制好的0.2 mM DPPH溶液，最后加入2 mL甲醇，振蕩混勻后，在室溫下避光反應(yīng)15 min.空白對(duì)照組選用蒸餾水，于517 nm下用UV分光光度計(jì)測(cè)量樣品溶液的吸光度值.平行測(cè)定三次，得到各個(gè)濃度的平均吸光度值.根據(jù)公式（1）計(jì)算樣品DPPH自由基清除能力：

DPPH自由基清除率（%）=A0-AsAs×100%

（1）

式（1）中：A0表示用水代替樣品待測(cè)液加入試劑的吸光值；As表示樣品待測(cè)液加入試劑的吸光值.

1.4.4 ABTS自由基清除能力的測(cè)定

參考王天等［22］和Dudonnbé等［23］的方法，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷?將發(fā)花第1天、第5天和第20天樣品分別配制為0.1 mg/mL、0.05 mg/mL、0.025 mg/mL、0.012 5 mg/mL、0.006 25" mg/mL，將抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照配制為0.01 mg/mL、0.005 mg/mL、0.002 5 mg/mL、0.001 25 mg/mL、0.000 625" mg/mL的樣品待測(cè)液.分別配制7 mM ABTS和2.45 mM K2S2O8溶液并按照體積1∶1混合作為ABTS母液.使用PH為6.6的PBS緩沖液將其稀釋至吸光度0.75±0.02作為ABTS工作液.取不同濃度梯度的樣品溶液0.1 mL，添加3.9 mL的ABTS工作液，震蕩均勻，在室溫下反應(yīng)6 min.空白對(duì)照組選用蒸餾水，在734 nm下用UV分光光度計(jì)測(cè)量樣品溶液的吸光度值.平行測(cè)定三次，得到各個(gè)濃度的平均吸光度值.根據(jù)公式（2）計(jì)算ABTS自由基的清除能力：

ABTS自由基清除率（%）=1-AsA0×100%

（2）

式（2）中：A0表示用H2O代替樣品待測(cè)液加入試劑的吸光值；As表示樣品待測(cè)液加入試劑的吸光值.

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)有3個(gè)平行，且至少重復(fù)3次，SPSS 26進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用LSD分析進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析，plt;0.05有顯著性差異，并使用Origin 2021繪圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 茯磚茶不同發(fā)花時(shí)期主要活性成分的分析

2.1.1 可溶性糖含量差異分析

如圖1所示，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量及其相對(duì)應(yīng)的吸光度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：y=7.754 5x+0.004 2，R2=0.997 1.將所測(cè)得的樣品的吸光度代入方程得到樣品的可溶性糖含量.由表1可知，從發(fā)花第1天到第5天再到第20天可溶性糖含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì).其中發(fā)花第5天的可溶性糖含量達(dá)到最高，為196.05±1.39 mg/g茶粉；同時(shí)發(fā)花第1天與發(fā)花第20天的可溶性糖含量并沒(méi)有顯著性差異（plt;0.05），分別為166.51±5.03 mg/g茶粉和172.00±2.08 mg/g茶粉.

2.1.2 可溶性蛋白含量差異分析

如圖2所示，根據(jù)雞白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量及其相對(duì)應(yīng)的吸光度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：y=4.228 6x+0.013 9，R2=0.995 2.將所測(cè)得的樣品的吸光度代入方程經(jīng)過(guò)換算得到樣品的可溶性蛋白含量.如表1所示，發(fā)花第1天的可溶性蛋白含量最高，為18.25±0.15 mg/g茶粉，第5天和第20天的可溶性蛋白含量較少，且兩者沒(méi)有顯著性差異（plt;0.05），分別為12.67±0.27 mg/g茶粉和12.53±0.26 mg/g茶粉.

2.1.3 總多酚含量差異分析

如圖3所示，根據(jù)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量及其相對(duì)應(yīng)的吸光度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：y=19.27x+0.030 7，R2=0.998 8.將所測(cè)得的樣品的吸光度代入方程經(jīng)過(guò)換算得到樣品的總多酚含量.如表1所示，發(fā)花第1天和第5天的總多酚含量較高，且兩者沒(méi)有顯著性差異（plt;0.05），分別為113.26±4.60 mg/g茶粉和116.20±5.11 mg/g茶粉；第20天的總多酚含量顯著性降低（plt;0.05），為94.24±4.02 mg/g茶粉.

2.1.4 總黃酮含量差異分析

如圖4所示，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量及其相對(duì)應(yīng)的吸光度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：y=1.36x+0.018 3，R2=0.994 3.將所測(cè)得的樣品的吸光度代入方程經(jīng)過(guò)換算得到樣品的總黃酮含量.如表1所示，發(fā)花第1天到第5天再到第20天總黃酮含量呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢(shì)，其中第1天和第20天兩者總黃酮含量沒(méi)有顯著性差異（plt;0.05），分別為218.47±4.06 mg/g茶粉和223.70±2.09 mg/g茶粉，第5天的總黃酮含量為181.07±4.33 mg/g茶粉.

2.1.5 游離氨基酸含量差異分析

如圖5所示，根據(jù)谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量及其相對(duì)應(yīng)的吸光度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：y=2.718 6x-0.008 7，R2=0.997 6.將所測(cè)得的樣品的吸光度代入方程經(jīng)過(guò)換算得到樣品的游離氨基酸含量.如表1所示，黃酮含量均顯著性下降（plt;0.05），分別為24.33±1.67 mg/g茶粉、17.17±1.03 mg/g茶粉、12.29±0.05 mg/g茶粉.

2.1.6 單糖組成結(jié)果分析

樣品經(jīng)三氟乙酸完全水解、還原乙酰化，最終經(jīng)過(guò)氣相檢測(cè)得到圖6.圖6（a）為肌醇和7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單糖的圖譜峰，1-8分別是鼠李糖（Rhamnose，Rha）、巖藻糖（Fucose，F(xiàn)uc）、阿拉伯糖（Arabinose，Ara）、木糖（Xylose，Xyl）、肌醇、甘露糖（Mannose，Man）、葡萄糖（Glucose，Glc）、半乳糖（Galactose，Gal）.將樣品的出峰時(shí)間分別與標(biāo)準(zhǔn)單糖進(jìn)行比對(duì)，得出三組樣品均由Rha、Ara、Xyl、Man、Glc、Gal組成，但其相對(duì)摩爾比率不同，分別為3.12∶14.54∶1∶1.87∶15.83∶12.43、3.87∶16.12∶1∶5.12∶12.97∶15.31和4.04∶17.04∶1∶4.13∶13.25∶17.10.

由圖6（b）～（d）及表2分析可知，以肌醇作為內(nèi)標(biāo)定量，從發(fā)花第1天到發(fā)花第5天Rha含量顯著性下降（plt;0.05），其中第20天的Rha含量與第1天和第5天沒(méi)有顯著性差異（plt;0.05）；Ara含量呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)，且均表現(xiàn)出顯著性變化（plt;0.05），其中第1天的Ara含量最高，為230.43±4.63 mg肌醇/g茶粉；Xyl含量在三組樣品中整體趨于平緩，并無(wú)顯著性變化；Man含量整體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，但第5天和第20天的Man含量沒(méi)有顯著性差異（plt;0.05），分別為48.62 ±1.06和45.36±3.32 mg肌醇/g茶粉；Glc整體呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，第5天和第20天的Glc含量沒(méi)有顯著性差異（plt;0.05），分別為123.25±3.78和145.59±9.76 mg肌醇/g茶粉；Gal含量則呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，其中第1天和第20天的Gal含量沒(méi)有顯著性差異（plt;0.05），分別為197.01±2.61和187.81±7.35 mg肌醇/g茶粉.根據(jù)以上研究，發(fā)現(xiàn)茯磚茶在發(fā)花過(guò)程中可能對(duì)單糖進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，具體表現(xiàn)為在1～5天發(fā)花過(guò)程中利用了Rha、Ara、Glc、Gal，產(chǎn)生Man；在5～20天發(fā)花過(guò)程中產(chǎn)生Ara，Gal.

在茯磚茶發(fā)花過(guò)程中，可溶性糖含量總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，發(fā)花第5天可溶性糖含量最高，可溶性糖的減少可能與微生物生長(zhǎng)有關(guān)，可溶性糖可以用作發(fā)酵過(guò)程中微生物生長(zhǎng)的碳源［24］；蛋白質(zhì)含量的降低可能是由于微生物蛋白酶的水解，蛋白質(zhì)通常在微生物發(fā)酵過(guò)程中被降解［25］；總多酚含量降低，這可能與水解、氧化聚合和二次反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)［26，27］；黃酮類化合物通常以黃酮醇苷的形式存在于茶中，發(fā)花過(guò)程中，總黃酮呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)，這可能是由冠突散囊菌發(fā)酵過(guò)程中對(duì)黃酮類化合物和黃酮苷的水解引起的［28］；游離氨基酸含量總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，游離氨基酸的減少與脫羧和脫氨、偶聯(lián)氧化反應(yīng)和美拉德反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)［29，30］，此外，氨基酸被認(rèn)為是穩(wěn)定的碳和氮，為曲霉等微生物的大規(guī)模繁殖提供營(yíng)養(yǎng)［31，32］；在發(fā)花過(guò)程中，曲霉可以產(chǎn)生和分泌各種胞外酶，如半纖維素酶、果膠酶、纖維素酶和木聚糖酶，以降解和轉(zhuǎn)化碳水化合物，冠突散囊菌在發(fā)酵過(guò)程中可能消耗不同的單糖殘基，從而產(chǎn)生具有不同單糖組成的最終碳水化合物［28］.

2.2 茯磚茶不同發(fā)花時(shí)期抗氧化能力的分析

2.2.1 還原力分析

還原力是評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化作用的一個(gè)重要指標(biāo)，吸光值越大，表明還原性越高［33］.

如圖7所示，在0.01～0.2 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，隨著樣品濃度的增加，三組樣品的還原力也逐漸增加.其中，在低濃度時(shí)（0.01～0.05 mg/mL），發(fā)花第5天和發(fā)花第20天的還原力相較于第1天的還原力顯著增強(qiáng)（plt;0.05）.

2.2.2 亞鐵離子螯合能力分析

亞鐵離子具有很強(qiáng)的助氧化活性，因此通過(guò)鰲合亞鐵離子，降低物質(zhì)中亞鐵離子的濃度，可避免或降低其氧化活性［34］.如圖8所示，發(fā)花第1天、第5天和第20天三種樣品的亞鐵離子螯合能力呈現(xiàn)明顯量效關(guān)系，隨著樣品濃度的增加而增加.發(fā)花第1天、發(fā)花第5天、發(fā)花第20天基本不存在顯著性差異（plt;0.05）.

2.2.3 DPPH自由基清除能力分析

DPPH、ABTS自由基清除能力變化趨勢(shì)能夠反映抗氧化活性能力的變化趨勢(shì)［35］.如圖9所示，抗壞血酸（Vitamin C，VC）、發(fā)花第1天、第5天和第20天四種樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力呈現(xiàn)明顯量效關(guān)系，VC、1 d、5 d、20 d對(duì)DPPH自由基的清除能力都隨著樣品濃度的增加而增大.在低濃度時(shí)（0.025～0.02 mg/mL），對(duì)三個(gè)樣品的DPPH自由基清除率比較，呈現(xiàn)出先下降后增加的趨勢(shì)（plt;0.05）.而在高濃度時(shí)（0.4～0.6 mg/mL），三種不同發(fā)花階段的茯磚茶樣品均表現(xiàn)出良好的DPPH自由基清除能力.

2.2.4 ABTS自由基清除能力分析

如圖10所示，抗壞血酸（Vitamin C，VC）、發(fā)花第1天、第5天和第20天四種樣品對(duì)ABTS自由基的清除能力呈現(xiàn)明顯量效關(guān)系，VC、1 d、5 d、20 d對(duì)ABTS自由基的清除能力都隨著樣品濃度的增加而增大.在高濃度時(shí)（50～100 μg/mL），三組樣品對(duì)ABTS自由基的清除能力呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì).

金花菌已經(jīng)被證實(shí)可以提高多種發(fā)酵原料的抗氧化活性［36］，伊家全等［12］將冠突散囊菌用于固態(tài)發(fā)酵羅漢果渣，研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程中，羅漢果渣的抗氧化活性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，其DPPH、ABTS自由基清除能力及總還原力分別在第8天、第8天和第6天達(dá)到最大，且與未發(fā)酵組相比具有顯著性差異（plt;0.05）.王羅［37］將冠突散囊菌用于人工接種發(fā)酵苦蕎茶，結(jié)果顯示苦蕎茶發(fā)酵前后都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，且與其濃度呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，當(dāng)茶湯濃度達(dá)到1.2 mg/mL后，苦蕎葉發(fā)酵茶對(duì)DPPH、ABTS自由基的清除能力強(qiáng)于發(fā)酵前的苦蕎葉毛茶.肖咪等［38］研究發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌發(fā)酵后的湖北海棠提取物抗氧化能力提高了64.8%，相關(guān)性分析表明，湖北海棠發(fā)酵后的抗氧化、降糖活性與多酚含量呈正相關(guān)性.鄒金美等［39］研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)冠突散囊菌發(fā)酵過(guò)的鐵觀音茶葉總還原力和Fe3+還原能力、清除DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基清除能力仍然很強(qiáng).

本研究發(fā)現(xiàn)，在低濃度時(shí)（0.01～0.05 mg/mL），發(fā)花第5天和發(fā)花第20天的還原力相較于第1天的還原力顯著增強(qiáng)（plt;0.05），這和在發(fā)花過(guò)程中冠突散囊菌數(shù)量逐漸增加的趨勢(shì)一致.這可能是冠突散囊菌的生長(zhǎng)顯著提高了樣品的抗氧化活性，其原因可能是茯磚茶在發(fā)花過(guò)程中冠突散囊菌的生長(zhǎng)繁殖不同程度利用了茯磚茶可溶性糖、總多酚、游離氨基酸、總黃酮等功能性成分，且總黃酮含量變化趨勢(shì)與ABTS自由基清除率在高濃度（50～100 μg/mL）時(shí)變化趨勢(shì)一致，這說(shuō)明可能是發(fā)花過(guò)程中總黃酮含量的變化提升了其抗氧化活性［12］，但冠突散囊菌具體的抗氧化機(jī)制還有待進(jìn)一步研究.

3 結(jié)論

本文通過(guò)對(duì)不同發(fā)花時(shí)間茯磚茶的主要活性物質(zhì)變化和抗氧化活性研究，發(fā)現(xiàn)茯磚茶發(fā)花過(guò)程中可溶性糖、可溶性蛋白、總多酚、游離氨基酸、總黃酮等主要活性成分發(fā)生了顯著變化.隨之，還原力、ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率、亞鐵離子螯合力等抗氧化活性也有不同程度的變化.本研究可以為冠突散囊菌進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)，促進(jìn)茯磚茶的標(biāo)準(zhǔn)化加工和開(kāi)發(fā)利用.

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【責(zé)任編輯：陳 佳】