管碟法測定硫酸新霉素效價的方法優(yōu)化

摘要：目的 優(yōu)化硫酸新霉素含量管碟法測定方法，增大新霉素抑菌圈直徑大小，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。方法 按照《中國獸藥典》2020版一部附錄1200抗生素微生物（檢定法）的實驗基本要求，設(shè)置菌液麥?zhǔn)蠞岫龋?.5、1、2、3和gt;4 mcf）、培養(yǎng)基pH（7.6、7.8、8.0、8.2和8.4）、磷酸鹽緩沖液中NaCl添加比例（0、3%、4%、5%、7%和9%）等變量進(jìn)行含量測定，比較抑菌圈直徑大小和可信限率等指標(biāo)。結(jié)果 在添加0.5%的菌液麥?zhǔn)蠞岫葹? mcf的金黃色葡萄球菌液、培養(yǎng)基pH為8.0、緩沖液添加5%的NaCl條件下，高劑量抑菌圈直徑擴(kuò)大至20 mm左右，抑菌圈邊緣清晰，且符合《中國獸藥典》可信限率的要求（不大于5%）。通過多產(chǎn)品多廠家的實樣驗證此條件穩(wěn)定可靠。結(jié)論 優(yōu)化后的方法可用于硫酸新霉素常規(guī)效價含量的測定。

關(guān)鍵詞：新霉素；抗生素微生物檢定法；效價測定；金黃色葡萄球菌

中圖分類號：R978.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Optimization of the tube-plate method for determining the potency of

neomycin sulphate

Wu Yushan， Sun Bingqing， Zhang Yu， Jiang Qin， Gu Xin， Zhang Wengang， and Cao Ying

（Shanghai Animal Disease Control Center， Shanghai 201103）

Abstract Objective To optimize the determination method of neomycin content， increase the diameter of the antibacterial ring in the tube disc method， and improve detection efficiency. Method According to the experimental requirements of Appendix 1200 Antibiotic Microorganisms （Assay Method） in the 2020 edition of the Chinese Veterinary Pharmacopoeia， different bacterial concentrations （0.5， 1， 2， 3， and gt;4 mcf）， medium pH （7.8， 8.0， 8.2， and 8.4）， and NaCl addition ratios （0， 3%， 4%， 5%， 7%， and 9%） in phosphate buffer were selected based on the indicators， such as diameter of the antibacterial zone and confidence limits. Results The results showed that under the conditions of adding 0.5% of the bacterial solution with a concentration of 3 mcf of Staphylococcus aureus， a culture medium pH of 8.0， and adding 5% NaCl to the buffer， the diameter of the antibacterial zone expanded to about

20 mm， and the edge of the antibacterial zone was clear. The confidence limit rate met the requirements of the Veterinary Pharmacopeia of the People’s Republic of China（not more than 5%）. This condition was stable and reliable， and it had been verified through actual samples from multiple products and manufacturers. Conclusion The optimized method can be used for the determination of conventional potency content of neomycin.

Key words Neomycin; Antibiotic microbial assay method; Determination of potency; Staphylococcus aureus

硫酸新霉素（neomycin sulphate）是一種氨基糖苷類抗生素。它對革蘭陽性、陰性細(xì)菌及結(jié)核桿菌等均具有抗菌作用，對金黃色葡萄球菌和炭疽桿菌有較好的治療作用，因此廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。但由于新霉素具有較強(qiáng)的腎毒性和耳毒性[1]，因此目前常用的劑型以外用制劑為主，還有滴眼液、軟膏等。

目前硫酸新霉素含量測定方法主要以微生物檢定法（管碟法）為主。管碟法是利用抗生素在低微濃度下有選擇地抑制或殺死微生物的特點(diǎn)，以抗生素的抗菌活性為指標(biāo)，來衡量抗生素中的有效成分效力的方法[2]。目前，按照《中國獸藥典》收載的管碟法進(jìn)行新霉素含量測定時，使用金黃色葡萄球菌為試驗菌，抗生素高低劑量分別為20和l0 U/mL，高劑量所致抑菌圈直徑多分布在14～15 mm之間。未達(dá)到《中國獸藥典》管碟法高劑量所致的抑菌圈直徑18～22 mm的要求[3]。抑菌圈過小會導(dǎo)致高低劑量新霉素之間抑菌圈大小接近，存在可靠性檢驗不通過的風(fēng)險，進(jìn)而影響含量測定的準(zhǔn)確性。菌液作為將藥品效價可視化的媒介，其傳代次數(shù)和菌種活力是試驗?zāi)軌蝽樌M(jìn)行的前提保障。根據(jù)《藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則》工作菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株為第0代）。所以在菌種活力得以保證的前提下，管碟法可通過提高抗生素濃度、增加菌液濃度和改變培養(yǎng)條件等方法來增大抑菌圈直徑。目前實驗用高劑量20 U/mL已十分接近獸藥典中藥物濃度的上限25 U/mL，上層培養(yǎng)基的菌液添加量未明確規(guī)定。雖然有文章改用其他菌液[4-5]進(jìn)行硫酸新霉素的效價試驗，但同樣沒有說明培養(yǎng)基中其他菌液的添加量，存在因培養(yǎng)基中菌液添加量不適而導(dǎo)致實驗失敗的可能性。已有研究證明試驗菌液濃度過高會降低抑菌圈直徑，無法顯示出高低劑量的差異；而過低則會導(dǎo)致抑菌圈邊緣模糊，不利于結(jié)果的測量[6-7]。由于新霉素為多組分抗生素，考慮金黃色葡萄球菌對新霉素B敏感度及測定結(jié)果的專屬性，本實驗按照獸藥典要求，選擇金黃色葡萄球菌作為試驗菌。除此之外，根據(jù)《抗生素微生物檢定法及其標(biāo)準(zhǔn)操作》[8]中硫酸新霉素檢定法標(biāo)準(zhǔn)操作下的內(nèi)容，培養(yǎng)基的pH和緩沖液中NaCl濃度同樣會影響抑菌圈的大小。所以本研究從菌液濃度、培養(yǎng)基的pH和緩沖液中NaCl濃度3方面進(jìn)行優(yōu)化，以期使新霉素的抑菌圈直徑達(dá)到獸藥典要求，并保證效價結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1 材料

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

CW-CJ-2F超凈工作臺（Airtech）；DensiCHEK Plus微生物比濁儀（Bio-Merieux公司）；ZY-300IV多功能微生物抑菌圈測量儀（北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司）；恒溫培養(yǎng)箱（Memmert）；PB602-N電子天平 （Mettler Toledo）；SX-500滅菌鍋（Tomy）；一次性平皿（90 mm）；容量瓶

25 mL；陶瓦蓋（103 mm × 108 mm）。

1.1.2 試劑

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株[CMCC（B）26003]（中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心）；抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號（pH 7.8～8.0）（批號20220713）（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）（批號0244875）（美國BD公司）；磷酸二氫鈉（分析純，批號20121008）（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；磷酸氫二鈉（分析純，批號20130829）（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；氯化鈉（批號20210310）（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。新霉素標(biāo)準(zhǔn)品（批號K0091811，每毫克相當(dāng)于657新霉素單位）（中國獸醫(yī)藥品檢查所）；新霉素可溶性粉（廠家1，批號20210301，100 g：32 g[3250萬單位]）；廠家2，批號20210201，（100 g：32.5 g[3250萬單位]）。新霉素滴眼液（廠家3，批號20230301，8 mL： 40 mg[4萬單位]；廠家4，批號22010135，8 mL： 40 mg[4萬單位]）。

1.2 方法

1.2.1 樣品配制

為降低實驗誤差，在“試驗菌液麥?zhǔn)蠞岫取薄斑x擇培養(yǎng)基pH”“緩沖液中NaCl濃度”3個試驗中，采用二劑量法進(jìn)行自身測定：新霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液同時作為供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密稱取新霉素標(biāo)準(zhǔn)品38.07 mg用無菌水定容至25 mL，得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為1000 U/mL，用緩沖液稀釋成高劑量20 U/mL和低劑量10 U/mL的試驗用標(biāo)準(zhǔn)品溶液。樣品驗證試驗中，試驗用標(biāo)準(zhǔn)品溶液不變，稱取新霉素可溶性粉76.92 mg用無菌水定容至25 mL，樣品溶液濃度為1000 U/mL，用緩沖液稀釋成高劑量20 U/mL和低劑量10 U/mL的試驗用供試品溶液。

1.2.2 試驗菌液麥?zhǔn)蠞岫?/p>

《中國獸藥典》中對于新霉素適用菌推薦金黃色葡萄球菌，但對于菌液濁度和菌液添加量均無規(guī)定。將金黃色葡萄球菌接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，在35～37 ℃培養(yǎng)20～22 h。臨用時，用0.9%滅菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，作為gt;4 mcf（麥?zhǔn)蠁挝唬⒎謩e稀釋成0.5、1、2和3 mcf的菌液（0.5 mcf約相當(dāng)于1.0 × 108 cfu/mL金黃色葡萄球菌），上層培養(yǎng)基按照0.5%比例添加菌液。參考抑菌圈情況選擇適宜的菌液濁度，保證抑菌圈直徑適宜且邊緣清晰。

1.2.3 選擇培養(yǎng)基pH

選擇“1.2.2”項下最終的菌液濁度，按上層培養(yǎng)基0.5%的比例添加。按照商品培養(yǎng)基用法配制抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號（高pH），檢測pH為7.6（滅菌前）。通過添加NaOH調(diào)整培養(yǎng)基pH分別為7.8、8.0、8.2和8.4（滅菌前）。試驗發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基滅菌后pH會升高0.1～0.2，但所檢測的pH值可能受溫度影響較大，故試驗以調(diào)整滅菌前培養(yǎng)基pH為主。

本試驗所用培養(yǎng)基均已通過培養(yǎng)基適用性檢查。

1.2.4 緩沖液中NaCl濃度

根據(jù)“1.2.2”項下選擇的菌液濁度，按上層培養(yǎng)基0.5%的比例添加；參考“1.2.2”項調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH。按照《中國獸藥典》1201抗生素微生物檢定法第1法（管碟法）試驗，在緩沖液中分別添加0、3%、4%、5%、7%和9%的NaCl。

1.2.5 實樣檢測

選擇新霉素可溶性粉作為實際樣品對新霉素含量進(jìn)行檢測，檢測分為兩組，A組參考《中國獸藥典》1201抗生素微生物檢定法第1法；B組根據(jù)優(yōu)化后的菌液濁度、培養(yǎng)基pH、緩沖液中NaCl濃度進(jìn)行試驗?？疾靸?yōu)化后的抑菌圈大小與可信限率等結(jié)果是否符合規(guī)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗菌液濁度對新霉素抑菌圈的影響

將不同濁度菌液（0.5、1、2、3和gt;4 mcf）以0.5%的比例分別添加到雙碟上層培養(yǎng)基中。當(dāng)菌液濁度為0.5和1 mcf時，平皿中金黃色葡萄球菌生長稀疏，未形成均勻的菌層；當(dāng)菌液濁度為2和3 mcf時，金黃色葡萄球菌可完全覆蓋培養(yǎng)基且抑菌圈邊緣清晰。因此分別選擇2 mcf、3 mcf、gt;4 mcf 3個菌液濁度重復(fù)測量抑菌圈直徑，檢測數(shù)據(jù)見表1。gt;4 mcf條件下高低劑量的抑菌圈直徑分別是13.23和14.72 mm；菌液濁度為2時，高低劑量的抑菌圈直徑均值分別是14.18 和15.88 mm；菌液濁度為3 mcf時，高低劑量的抑菌圈直徑分別是13.71和15.28 mm。雖然當(dāng)菌液濁度為2時可獲得更大的抑菌圈，但考慮到其樣品標(biāo)準(zhǔn)偏差和樣品變異系數(shù)較大，約為3 mcf菌液濁度的二倍。綜合考慮抑菌圈直徑、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)等因素，在后續(xù)新霉素效價測定方法中選擇菌液濁度為

3 mcf（0.5%添加）的金黃色葡萄球菌液。

2.2 培養(yǎng)基pH值對抑菌圈直徑的影響

由表2和圖1可知，隨著抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號pH值的升高，以8.0為折點(diǎn)抑菌圈逐漸增大后趨于平穩(wěn)。當(dāng)pH值由7.6升為8.0時，高、低濃度的抑菌圈直徑增大。pH值在8.0到8.4之間，高、低濃度的抑菌圈直徑趨于穩(wěn)定。培養(yǎng)基不同pH值下產(chǎn)生的抑菌圈直徑的樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.13～0.29之間，樣本變異系數(shù)在1%～1.82%之間，說明培養(yǎng)基在不同pH值條件下新霉素產(chǎn)生的抑菌圈直徑是較為穩(wěn)定的。因此選擇將培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)至8.0。

2.3 緩沖液中NaCl濃度對抑菌圈直徑的影響

由表3和圖2可知，在稀釋用緩沖液中添加NaCl會增加抑菌圈直徑。緩沖液中添加NaCl濃度不超過5%時高、低劑量的抑菌圈均等比增大；添加NaCl濃度達(dá)到7%和9%時，高、低含量的抑菌圈直徑擴(kuò)大速度不一致，低劑量下抑菌圈增大程度減緩，并且樣本變異系數(shù)均高于2%，因此緩沖液中NaCl的添加量選擇5%的比例。

2.4 實樣檢測

新霉素可溶性粉和新霉素滴眼液各選兩個廠家的產(chǎn)品作為實際樣品，對新霉素含量進(jìn)行檢測抑菌圈大小、可靠性檢驗、效價測定結(jié)果（PT）及可信限率進(jìn)行分析比較結(jié)果見表4，A為獸藥典條件下的實驗結(jié)果，B為優(yōu)化后條件下的實驗結(jié)果。由表4可知，實驗結(jié)果P值均大于0.05，說明偏離平行不顯著，實驗結(jié)果成立。在獸藥典條件下，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的高濃度所致抑菌圈直徑最大接近16 mm，并且平均可信限率均在4%以上，最高可達(dá)到4.96%，接近5%的最大限值。而在優(yōu)化條件下，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的高濃度抑菌圈直徑在19～22 mm之間，并且平均可信限率均低于4%。

3 討論

3.1 試驗菌液濁度對新霉素抑菌圈的影響

菌液的添加量是影響測定效價的因素之一[9-10]。適當(dāng)?shù)脑囼灳吭谝欢ǔ潭壬铣梢允挂志U(kuò)大外，還可以使不同批次進(jìn)行的試驗結(jié)果有比較的可能。梅芊等[11]在文章中列舉了通過改變菌層培養(yǎng)基的加菌量，使土霉素抑菌圈直徑符合獸藥典要求的案例。韓寧寧等[12]通過菌株純化調(diào)整菌液濁度來降低鹽霉素抑菌圈直徑。本研究固定添加菌液比例0.5%，且每次均使用金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物，利用比濁儀調(diào)控菌液濁度，結(jié)果顯示菌液濁度為大于1 mcf時，培養(yǎng)基平面可長滿菌。為穩(wěn)定地顯示新霉素抑菌的效果，本實驗選擇在添加菌液濃度為0.5%的條件下，使用金黃色葡萄球菌液濁度為3 mcf。標(biāo)準(zhǔn)品高劑量抑菌圈直徑由14～15 mm增加到15～16 mm。

3.2 培養(yǎng)基pH值對抑菌圈直徑的影響

商品化抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號（高pH）普遍標(biāo)示pH值為7.8～8.0，按要求配制后檢測發(fā)現(xiàn)pH值僅為7.4～7.6，并未達(dá)到標(biāo)示值?！犊股匚⑸餀z定法及其標(biāo)準(zhǔn)操作》中提到，培養(yǎng)基或緩沖液的pH值升高有利于抑菌圈直徑擴(kuò)大。參考同樣有研究[13]調(diào)高培養(yǎng)基pH值會增大大觀霉素抑菌圈直徑。林素青等[14]實驗結(jié)果顯示增加培養(yǎng)基或緩沖液的pH值都可使抑菌圈增大，但pH達(dá)到8.3時不利于細(xì)菌生長而導(dǎo)致抑菌圈邊緣不明顯。與以往研究有所不同，本研究發(fā)現(xiàn)即使培養(yǎng)基pH值達(dá)到8.4，抑菌圈邊緣依舊清晰。但培養(yǎng)基的pH值高于8.0后抑菌圈直徑趨于不變。標(biāo)準(zhǔn)品高劑量抑菌圈直徑由15～16 mm增加到17～18 mm。建議配制培養(yǎng)基后，測量pH值調(diào)至8.0。此外，本實驗提示，商品化培養(yǎng)基應(yīng)定期進(jìn)行供應(yīng)品驗證，并通過pH值的調(diào)節(jié)使培養(yǎng)基發(fā)揮最佳培養(yǎng)效果。

3.3 緩沖液中NaCl濃度對抑菌圈直徑的影響

林素青等[14]結(jié)果表明在緩沖液和培養(yǎng)基中添加一定比例的鹽溶液可提高新霉素抑菌圈大小。但根據(jù)《抗生素微生物檢定法及其標(biāo)準(zhǔn)操作》，在緩沖液中添加一定量的NaCl或KCl可增加新霉素在瓊脂中的擴(kuò)散作用，若在培養(yǎng)基中加入NaCl或KCl則會使新霉素與瓊脂的結(jié)合發(fā)生逆轉(zhuǎn)，而降低擴(kuò)散效果，反而使抑菌圈縮小[8]。研究人員前期進(jìn)行了驗證，在培養(yǎng)基中加入NaCl會使抑菌圈縮小，在緩沖液中加入NaCl會使抑菌圈增大。因此本試驗在緩沖液中設(shè)置不同比例NaCl的添加量，發(fā)現(xiàn)在5%條件下標(biāo)準(zhǔn)品高劑量抑菌圈直徑由14～15 mm增加到19～20 mm。

4 結(jié)論

最終在培養(yǎng)基中加0.5%菌液濁度為3 mcf、調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至8.0、緩沖液加5%NaCl的條件下，新霉素高劑量下抑菌圈直徑可達(dá)到19～20 mm。形成的抑菌圈大小符合規(guī)定且邊緣清晰，實驗通過可靠性檢驗，供試品效價測定結(jié)果及可信限率符合規(guī)定，本實驗優(yōu)化的條件可為新霉素各類制劑中效價測定提供思路。

參 考 文 獻(xiàn)

江勛， 彭婷婷. 微生物濁度法測定硫酸新霉素效價方法探討[J]. 中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志， 2016， 44（1）： 96-98.

中國藥品生物制品檢定所. 中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[S]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2001.

中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典[S]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2020.

張晶， 岳榮， 關(guān)瑩， 等. 新霉素微生物檢定法的改進(jìn)[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志， 2019， 50（11）： 1285-1289.

李兵， 馬靖， 楊誼， 等. 新霉素效價測定方法改進(jìn)[J]. 中國藥品標(biāo)準(zhǔn)， 2000， （3）： 47-48.

任仲麗， 張秀花， 王靜， 等. 管碟法測定抗生素效價影響因素與控制方法的研究進(jìn)展[J]. 中國當(dāng)代醫(yī)藥， 2020， 27（25）： 27-29.

王新霞， 宋雪玲. 管碟法對抗生素藥品效價的微生物檢定[J]. 延安大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)科學(xué)版）， 2011， 9（3）： 58-68.

胡昌勤， 劉煒. 抗生素微生物檢定法及其標(biāo)準(zhǔn)操作[M]. 北京： 氣象出版社， 2004.

陳家鳳. 管碟法測定抗生素效價的影響因素及控制方法[J].畜牧獸醫(yī)科技信息， 2013， （2）： 16-17.

蔣惠嵐. 管碟法測定抗生素效價的影響因素及控制方法[J]. 中國獸藥雜志， 2011， 45（8）： 53-55.

梅芊， 郜繼東， 劉英. 影響管碟法測定磷霉素效價中抑菌圈質(zhì)量的因素分析[J]. 中國抗生素雜志， 2021， 46（9）： 868-872.

韓寧寧， 徐嫄， 于麗娜， 等. 鹽霉素效價測定的方法優(yōu)化[J]. 中國獸醫(yī)雜志， 2017， 53（2）： 93-95.

李凡， 朱志華， 姜鳳麗， 等. 管碟法測定生物效價影響因素的探討及改進(jìn)[J]. 中國獸藥雜志， 2008， （1）： 45-48.

林素青， 胡家露. 新霉素微生物效價測定方法的改進(jìn)[J].中國藥學(xué)雜志， 1963， （4）： 183-185.