新霉素對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及PDGF、VEGF和血管生成素表達(dá)的影響

趙 佳，郝利銘，姜文華，孔德霞，李洪成，周 莉

（吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系，吉林長春130021）

新霉素對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及PDGF、VEGF和血管生成素表達(dá)的影響

趙 佳＊，郝利銘，姜文華，孔德霞，李洪成，周 莉

（吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系，吉林長春130021）

目的探討新霉素對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及PDGF、VEGF和血管生成素表達(dá)的影響。方法采用人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251，DMEM培養(yǎng)基添加10%胎牛血清培養(yǎng)。MTT細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖，Real Time PCR檢測mRNA表達(dá)情況，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測蛋白表達(dá)。結(jié)果MTT結(jié)果表明，新霉素對(duì)U251細(xì)胞增殖存在抑制作用，并以劑量依賴的方式進(jìn)行，并發(fā)現(xiàn)新霉素的抑制作用隨時(shí)間增強(qiáng)。Real Time PCR結(jié)果顯示，新霉素作用后U251細(xì)胞中PDGF、VEGF和血管生成素mRNA的表達(dá)都受到不同程度的抑制，分別降低了26.75%、38.23%和43.87%。ELISA分析表明新霉素能夠降低PDGF、VEGF和血管生成素蛋白水平的表達(dá)。結(jié)論新霉素能夠抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中PDGF、VEGF和血管生成素的表達(dá)并抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。

新霉素；腦膠質(zhì)瘤；PDGF；VEGF；血管生成素

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1579）

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腦腫瘤，其富含血管，是高度血管依賴性的惡性腫瘤，血管新生化程度與其惡性程度、生物侵襲性、臨床復(fù)發(fā)和預(yù)后均密切相關(guān)［1］。最近研究發(fā)現(xiàn)，新霉素在血管發(fā)生過程中具有抑制作用。新霉素可抑制血管生成素在內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)生核轉(zhuǎn)移，進(jìn)而抑制血管發(fā)生和細(xì)胞增殖，并且新霉素對(duì)前列腺癌的生長和血管發(fā)生具有抑制作用［2－3］。腫瘤血管發(fā)生受多種血管生成因子的調(diào)節(jié)，本文中，我們研究了新霉素對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用，并進(jìn)一步分析新霉素對(duì)三種重要的血管發(fā)生因子：PDGF、VEGF和血管生成素表達(dá)的影響，探討新霉素抑制腦膠質(zhì)瘤的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251購自上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO，胎牛血清購自TBD公司，MTT購自Sigma公司，ELISA檢測試劑盒購自R＆D公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251采用DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清培養(yǎng)。置于37℃、5%CO2孵箱中，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3 MTT細(xì)胞活性檢測實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，以6×103cells／孔的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度新霉素溶液以及對(duì)照生理鹽水，繼續(xù)培養(yǎng)0、12、24、48、72h。吸去上清，向每孔加入100μl MTT工作溶液（0.5 mg／ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸去上清，加入100μlDMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶標(biāo)儀492nm處測量各孔的吸光值。細(xì)胞增殖抑制率＝（對(duì)照組A值－干擾組A值）／對(duì)照組A值×100%。

1.4 細(xì)胞總RNA的提取

采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA（Invitrogen Corporation，Grand Island，New York，USA）。每組細(xì)胞沉淀中加入1ml Tizol，吹打均勻，靜止5 min。加入200μl氯仿，劇烈振蕩混勻1min，靜置3 min；4℃下12 000r／min離心10min；將上清液小心轉(zhuǎn)移到DEPC處理的1.5ml EP管里，加入500 μl異丙醇，混勻，室溫放置10min；4℃下15 000r／min離心10min；棄上清，75%乙醇（約1ml）洗2次，4℃，12 000rpm，離心5min；棄上清，室溫干燥（5－10min）；用30μl Rnase－free水溶解RNA，于分光光度計(jì)上測定RNA濃度及純度，分裝，－80℃保存?zhèn)溆茫?］。

1.5 反轉(zhuǎn)錄

取1μg總RNA，按照Reverse Transcription System（Promega，Madison，USA）說明書進(jìn)行操作。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA片段用DEPC水稀釋5倍，分裝，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 Real Time PCR

反應(yīng)體系為：12.5μl SYBR Green Realtime PCR Master Mix，Sense引物（2μM）2.5μl，Antisense引物（10μM）2.5μl，模板2μl，dH2O（滅菌蒸餾水）5.5μl。

反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min，95℃30s，52℃60s，72℃30s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在熒光定量PCR儀（Stratagene，Mx3000P，USA）上進(jìn)行。

每份標(biāo)本設(shè)3個(gè)復(fù)孔檢測，取其循環(huán)閾值均值（Ct值，即PCR反應(yīng)過程中出現(xiàn)熒光信號(hào)的初始循環(huán)數(shù)）。以管家基因β－actin為內(nèi)參，采用比較2－△△Ct法分析各基因在細(xì)胞中的相對(duì)含量。

PCR反應(yīng)中用到的引物：

β－actin引物：

Sense：5’－TCGTGCGTGACATTAAGGAG－3’

Antisense：5’－ATGCCAGGGTACATGGTGGT－3’PDGF引物：

Sense：5′－CTGCTCATCATATTCCAACCC－3′

Antisense：5′－CCTACCACAgTCTCCCTCCT－3′

VEGF引物：Sense：5’－GCCGTCCAATCGAGACCCT－3’Antisense：5’－CATGGCGATGTTGAACTCCTC－3’

Angiogenin引物：

Sense：5’－CATCATGAGGAGACGGGG－3’

Antisense：5’－TCCAAGTGGACAGGTAAGCC－3’。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）

收集細(xì)胞上清液，采用雙抗體夾心法分別檢測PDGF、VEGF和血管生成素的表達(dá)情況。嚴(yán)格按照ELISA Kits說明書進(jìn)行操作。使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Multiskan MK3，F(xiàn)inland）進(jìn)行吸光值檢測。

2 結(jié)果

2.1 新霉素抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖

采用MTT法檢測新霉素對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如圖1所示。MTT結(jié)果表明，作用48 h后，隨著新霉素濃度的增加，U251細(xì)胞的增殖率逐漸下降（圖1A），新霉素濃度為100μM時(shí)，U251細(xì)胞的增殖減少了12.27%。而400μM時(shí)，細(xì)胞的增殖減少了58.38%。說明新霉素對(duì)U251細(xì)胞增殖存在抑制作用，并以劑量依賴的方式進(jìn)行。同時(shí)我們檢測了不同時(shí)間新霉素對(duì)U251細(xì)胞增殖的作用情況，發(fā)現(xiàn)新霉素的抑制作用隨時(shí)間增強(qiáng)，如圖1B。

2.2 新霉素抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PDGF、VEGF和血管生成素的表達(dá)

首先我們從mRNA水平上檢測新霉素對(duì)PDGF、VEGF和血管生成素表達(dá)的影響。收集U251細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進(jìn)行Real Time PCR。結(jié)果如圖2，與對(duì)照組細(xì)胞相比，新霉素作用后U251細(xì)胞中PDGF、VEGF和血管生成素mRNA的表達(dá)都受到不同程度的抑制，分別降低了26.75%、38.23%和43.87%。

為進(jìn)一步驗(yàn)證新霉素對(duì)3種蛋白表達(dá)的影響，我們進(jìn)行了ELISA分析。收集細(xì)胞上清液，采用雙抗體夾心法分別檢測3種蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如表1、圖2。從圖中可以看出，新霉素作用后，降低了PDGF、VEGF和血管生成素蛋白水平的表達(dá)，抑制率分別為29.77%、46.38%和42.48%。

表1 各組膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PDGF、VEGF和血管生成素蛋白的表達(dá)（pg／ml）

圖1 MTT檢測新霉素對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響

圖2 Real Time PCR檢測新霉素對(duì)PDGF、VEGF和血管生成素mRNA表達(dá)的影響

3 討論

腦腫瘤是中年男性與癌癥有關(guān)的死亡中第三位最常見的死因，其起源一般為星形細(xì)胞、室管膜細(xì)胞、少枝膠質(zhì)細(xì)胞和混合來源。膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤，占所有病例的60%［5］。目前盡管采用手術(shù)、放療和化療等多種手段，但對(duì)腦膠質(zhì)瘤的治療仍很有限。近年來研究發(fā)現(xiàn)，血管生成因子與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，血管為腫瘤提供營養(yǎng)物質(zhì)并排出代謝產(chǎn)物，腫瘤通過新生血管發(fā)生轉(zhuǎn)移；血管生成因子也能夠直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖［6－7］。

我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)新霉素抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，并且新霉素能夠抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PDGF、VEGF和血管生成素的表達(dá)。PDGF、VEGF和血管生成素是3種重要的血管發(fā)生因子，在腦膠質(zhì)瘤中均高表達(dá)，并在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［8－10］。提示新霉素可能是通過抑制這3種因子的表達(dá)，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的生長。

新霉素是氨基糖苷類抗生素的一種，它能夠與原核生物核糖體的小亞單位結(jié)合，從而導(dǎo)致mRNA錯(cuò)讀，繼而抑制翻譯過程，所以它對(duì)許多有機(jī)體都具有殺菌作用［2］。而新霉素與其結(jié)構(gòu)類似的化合物如基因菌素（G418）最大的區(qū)別在于，新霉素對(duì)于大多數(shù)的真核細(xì)胞沒有毒性，因?yàn)槠洳慌c真核生物的核糖體結(jié)合［3］。

有報(bào)道表明新霉素能夠抑制血管生成素、aFGF、bFGF等在內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)生核轉(zhuǎn)移，進(jìn)而抑制它們誘發(fā)的血管發(fā)生，并且新霉素對(duì)基礎(chǔ)水平和自發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖沒有顯著的抑制作用，但能夠顯著抑制由血管生成素、aFGF、bFGF等誘發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖［3］，這說明新霉素比非特異性的細(xì)胞生長抑制劑具有更好的針對(duì)性和高效性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著新霉素濃度的增加，U251細(xì)胞的增殖率逐漸下降，新霉素對(duì)腦膠質(zhì)瘤的抑制作用存在劑量依賴。100μM新霉素使細(xì)胞增殖減少了12.27%。而400μM時(shí)，細(xì)胞增殖減少了58.38%。

目前新霉素的毒性情況是已知的，當(dāng)新霉素過量使用時(shí)，會(huì)引發(fā)腎和第八神經(jīng)損傷［11］。在臨床上使用新霉素治療細(xì)菌感染，口服劑量為4－8g／天，肌內(nèi)注射劑量為1－2g／天。本實(shí)驗(yàn)中新霉素抑制U251細(xì)胞增殖的IC50值為375μM，這一濃度低于已報(bào)道的其在細(xì)胞培養(yǎng)物中引起毒性所需的濃度（～1mM）［12］。

綜上，新霉素能夠抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PDGF、VEGF和血管生成素的表達(dá)并制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，而三種因子為重要的血管發(fā)生因子，所以理論上新霉素不但可以抑制腦膠質(zhì)瘤生長所必需的新血管發(fā)生，又對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖具有直接的抑制作用，那么新霉素作為抗腫瘤藥物將會(huì)比單純抑制腫瘤血管發(fā)生或細(xì)胞增殖的抑制劑更有效。

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Effect of neomycin on cell proliferation and expression of PDGF，VEGF，angiogenin in glioma cells

ZHAO Jia，HAO Li－

ming，JIANG Wen－h(huán)ua，et al.（Department of Histology and Embryology，College of Basic Medical Sciences，Jilin University，Changchun130021，China）

ObjectiveTo observe the effect of neomycin on cell proliferation and expression of PDGF，VEGF，angiogenin in U251glioma cells.MethodsThe cell proliferation was analyzed using MTT.Real Time PCR and ELISA were applied to investigate the expression of PDGF，VEGF，angiogenin.ResultsThe MTT results showed that neomycin positively inhibited the cell proliferation of U251cells and the inhibition was enhanced by dose－dependent and time－dependent.Real Time PCR and ELISA results showed that neomycin inhibited the expression of PDGF，VEGF，angiogenin both on mRNA level and protein level.ConclusionNeomycin positively inhibited the cell proliferation and expression of PDGF，VEGF，angiogenin in U251glioma cells.

neomycin；glioma；PDGF；VEGF；angiogenin

R730.264

A

趙佳，31歲，女，博士，講師，主要從事腫瘤細(xì)胞生物學(xué)研究。

2013－06－06）

1007－4287（2014）10－1579－04

＊通訊作者