氧化白藜蘆醇抗諾卡菌活性及作用機(jī)制

摘要：目的 探究氧化白藜蘆醇（oxyresveratrol，OXY）的抗諾卡菌活性，明確其抗菌效果，同時(shí)初步探索其抑制諾卡菌的機(jī)制，為篩選新型抗諾卡菌藥物提供更多理論基礎(chǔ)。方法 借鑒紙片擴(kuò)散法對(duì)臨床收集的12株諾卡菌進(jìn)行OXY抗菌活性篩選；通過(guò)測(cè)定OXY對(duì)諾卡菌的MIC值和MBC值，明確其抗諾卡菌活性；通過(guò)測(cè)定A620的方法，評(píng)價(jià)OXY對(duì)諾卡菌的生長(zhǎng)的影響；采用光學(xué)顯微鏡、掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察的方法，明確OXY對(duì)諾卡菌形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的影響；最后通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)液上清中堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）和鉀離子的含量探索OXY對(duì)諾卡菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜完整性的影響。結(jié)果 通過(guò)借鑒紙片擴(kuò)散法的篩選發(fā)現(xiàn)25和50 mg/mL OXY都能較好地抑制12株諾卡菌的生長(zhǎng)，12.5 mg/mL OXY能一定程度上抑制諾卡菌的生長(zhǎng)；OXY對(duì)12株諾卡菌的MIC值和MBC值分別為0.2和0.4 mg/mL；A620的結(jié)果表明0.5×MIC OXY和1×MIC OXY都能顯著抑制諾卡菌的生長(zhǎng)；OXY作用使圣喬治教堂諾卡菌形態(tài)發(fā)生顯著改變，細(xì)菌皺縮、變圓、細(xì)胞壁變粗糙，細(xì)胞發(fā)生破裂；OXY還能破壞諾卡菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性，上清液中AKP和鉀離子含量隨著OXY作用濃度的升高而升高。結(jié)論 OXY具有較好抗諾卡菌活性，其MIC值和MBC值分別為0.2和0.4 mg/mL，OXY可能是通過(guò)破壞諾卡菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性發(fā)揮抗菌作用。

關(guān)鍵詞：氧化白藜蘆醇；諾卡菌；抗菌活性；抗菌機(jī)制

中圖分類號(hào)：R987.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Anti-Nocardia activity and mechanism of oxyresveratrol

Sun Xihuan1， Wu Xinyi2 and Huang Donghong1

（1 The Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University， Clinical Microbiology Laboratory， Quanzhou 362000;

2 Fujian Medical University， School of Medical Technology and Engineering， Fuzhou 350100）

Abstract Objective To explore the anti-Nocardia activity of oxyresveratrol （OXY）， clarify its antibacterial effect， and initially explore the mechanism of its inhibition of Nocardia， so as to provide a more theoretical basis for screening new anti-nocardia drugs. Methods The OXY antibacterial activity against 12 strains of Nocardia was screened by the disk diffusion method. The minimal inhibitory concentration （MIC） and minimal bactericidal concentration （MBC） of OXY against Nocardia were determined to clarify its anti-Nocardia activity. The effect of OXY on the growth of Nocardia was evaluated by the determination of A620. The effects of OXY on the morphology and structure of Nocardia were investigated by the optical microscope， the scanning electron microscope and the transmission electron microscope. Finally， the contents of alkaline phosphatase （AKP） and K+ in the supernatant of the culture medium were detected to explore the effect of OXY on the integrity of Nocardia cell walls and membranes. Results By using disk diffusion method， it was found that both 25 and 50 mg/mL OXY could inhibit the growth of 12 strains of Nocardia， and 12.5 mg/mL OXY could inhibit the growth of Nocardia to some extent. The MIC and MBC values of OXY against 12 strains of Nocardia were 0.2 and 0.4 mg/mL， respectively. The results of A620 showed that both 0.5×MIC OXY and 1×MIC OXY could significantly inhibit the growth of Nocardia. OXY significantly changed the morphology of N. cyriacigeorgica; the bacteria shrank， became round， the cell wall became rough， and the cells broke down. OXY could also destroy the integrity of the Nocardia cell wall and membrane， and the content of AKP and K+ in the supernatant increased with the increase of the OXY concentration. Conclusion OXY had good antibacterial activity against Nocardia， and its MIC and MBC values were 0.2 and 0.4 mg/mL， respectively. OXY might exert an antibacterial effect by destroying the integrity of the Nocardia cell wall and membrane.

Key words Oxyresveratrol; Nocardia; Antibacterial activity; Antibacterial mechanism

諾卡菌（Nocardia）屬于放線菌目、諾卡菌科是一種菌體呈分枝狀或串珠狀細(xì)密排列的革蘭陽(yáng)性需氧桿菌，抗酸染色為弱陽(yáng)性，其自然界廣泛分布，如水、灰塵、土壤和腐爛的植被[1]。諾卡菌病常好發(fā)于免疫功能低下的患者，如器官移植、惡性腫瘤、艾滋病及自身免疫性疾病的患者；諾卡菌可侵襲全身多個(gè)器官，肺是最常受累的器官（約占70%），其他感染部位包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚、眼、關(guān)節(jié)及腹膜等[2-4]。諾卡菌病的治療，首選甲氧芐啶磺胺甲惡唑，常采用聯(lián)合方案包括甲氧芐啶磺胺甲惡唑聯(lián)合亞胺培南、頭孢曲松和阿米卡星等[5]。但是，諾卡菌的耐藥形勢(shì)不容忽視，多項(xiàng)研究結(jié)果表明諾卡菌，尤其是皮疽諾卡菌對(duì)復(fù)方磺胺甲惡唑存在不同程度的耐藥，耐藥率達(dá)50%～80%不等[6-8]。另外，根據(jù)CLSI M62[9]不同菌種的諾卡菌對(duì)部分常規(guī)抗生素的敏感性存在較大差異，例如，巴西諾卡菌和豚鼠耳炎諾卡菌對(duì)亞胺培南高度耐藥，圣喬治教堂諾卡菌對(duì)環(huán)丙沙星和克拉霉素高度耐藥。同時(shí)，諾卡菌病的治療療程較長(zhǎng)，一般為6～12個(gè)月，存在藥物毒副作用的問(wèn)題，例如，阿米卡星存在耳毒性和腎毒性，并且肺組織穿透性差[10]。因此，有必要發(fā)展新型且安全的抗諾卡菌藥物。

氧化白藜蘆醇（oxyresveratrol，OXY）是1種多羥基苯乙烯， 存在于多種植物中， 目前主要從葡萄、虎杖、花生和桑樹(shù)等植物中提取[11]。氧化白藜蘆醇化學(xué)分子結(jié)構(gòu)與白藜蘆醇極為相似，同樣具有多種生物活性，包括抗菌[12]、抗氧化[13]、抗炎癥[14]和抗腫瘤[15]等作用。OXY具有較好的水溶性，毒副作用小，安全性高等特點(diǎn)，現(xiàn)已經(jīng)逐漸被醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所關(guān)注。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)OXY對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、口腔病原體變形鏈球菌和白色念珠菌等具有較好的抗菌活性[12，16-17]。OXY還能抑制尿路致病性大腸桿菌生物膜的形成、群集運(yùn)動(dòng)、菌毛產(chǎn)生和血凝能力[18]。然而，有關(guān)OXY抑制抗諾卡菌活性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究針對(duì)當(dāng)前諾卡菌的耐藥性問(wèn)題，探究OXY對(duì)抗諾卡菌的活性及作用機(jī)制，為篩選新型抗諾卡菌藥物提供理論依據(jù)，同時(shí)，拓展OXY更多的潛在應(yīng)用價(jià)值。

1 儀器與材料

1.1 儀器

氣浴恒溫振蕩器（型號(hào)：SHZ-82，常州金壇良友儀器有限公司）；微生物恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)：BJPX-150，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）；生物安全柜（型號(hào)：bsc-1500，蘇凈安泰）；酶標(biāo)儀（型號(hào)：Tecan Austria Infinite F50，帝肯TECAN）；生物顯微鏡（型號(hào)：DM2000LED，徠卡）。

1.2 試驗(yàn)品

氧化白藜蘆醇（批號(hào)：20200301，純度98%，上海源葉生物有限公司）。

1.3 試劑

陽(yáng)離子調(diào)節(jié)肉湯， CAMHB（批號(hào)：20210115，海博生物）；磷酸緩沖液（批號(hào)：21036193，Biosharp白鯊生物）；生理鹽水（批號(hào)：230327A41，福州海王福藥制藥有限公司）；二甲基亞砜，DMSO（批號(hào)：D8371，北京索萊寶科技有限公司）；AKP檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20230404，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；鉀離子檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20230306，南京建成生物工程研究所有限公司）。

1.4 菌株

2019—2023年福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床標(biāo)本分離的諾卡菌12株。其中圣喬治教堂諾卡菌8株，皮疽諾卡菌2株，巴西諾卡菌1株，亞洲諾卡菌1株。

2 方法

2.1 藥液配制

稱取100 mg OXY溶于1 mL DMSO中，制成濃度為100 mg/mL的原液。

2.2 OXY抗諾卡菌活性的篩選

12株諾卡菌配制成1.5×108 CFU/mL菌液，分別涂布于血瓊脂平板上，用200 μL槍頭在每個(gè)平板上制成4個(gè)8 mm左右小孔，OXY原液用生理鹽水稀釋成6.25、12.5、25和50 mg/mL溶液，各取50 μL于平板小孔中，37 ℃培養(yǎng)48 h后量取抑菌圈。

2.3 MIC值的測(cè)定

OXY原液用CAMHB肉湯將其稀釋成 12.5 mg/mL溶液。依據(jù)CLSI M24[19]微量肉湯稀釋法，將12.5 mg/mL濃度采用倍比稀釋成10個(gè)濃度，最小濃度為0.024 mg/mL。將12株諾卡菌配制成1.5×108 CFU/mL菌液，稀釋100倍備用。取50 μL藥液于圓底96孔板再加入50 μL菌液，同時(shí)設(shè)置CAMHB肉湯空白對(duì)照和DMSO陰性對(duì)照，37 ℃孵育72 h，孔內(nèi)諾卡菌完全被抑制的濃度即為MIC值。

2.4 MBC值的測(cè)定

參照MIC的試驗(yàn)方法，分別設(shè)置1×MIC、2×MIC、4×MIC和8×MIC OXY，37 ℃培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)結(jié)束后，吸取20 μL的培養(yǎng)液涂布于新鮮的血瓊脂培養(yǎng)基上，過(guò)夜培養(yǎng)48 h，無(wú)活菌生長(zhǎng)的最小濃度即為MBC值。

2.5 顯微鏡形態(tài)觀察

配制1.5×108 CFU/mL菌液，將其稀釋5倍備用，陰性對(duì)照加DMSO，其他管加入OXY使其終濃度分別為0.5×MIC、1×MIC和2×MIC，放于37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h之后，離心，棄上清，200 μL PBS重懸菌液，取20 μL涂于玻片，固定后進(jìn)行革蘭染色，之后通過(guò)顯微鏡觀察OXY對(duì)細(xì)菌形態(tài)的影響。

2.6 掃描電鏡與透射電鏡觀察

試管中加入5 mL 1.5×108 CFU/mL菌液，陰性對(duì)照加入10 μL DMSO，處理組加入10 μL 100 mg/mL OXY使其終濃度分別為1×MIC值，每組3個(gè)重復(fù)，放于37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h之后，3000 r/min 離心10 min，棄上清，PBS洗滌2次，棄PBS，加入2.5%戊二醛固定液，固定過(guò)夜，送至武漢邁斯普生物科技有限公司進(jìn)行制片觀察。

2.7 OXY對(duì)諾卡菌生長(zhǎng)影響的測(cè)定

以CAMHB肉湯為培養(yǎng)基，配制1.5×108 CFU/mL菌液稀釋200倍備用。玻璃試管中加入5 mL菌液，陰性對(duì)照組加入DMSO，處理組加入OXY使其終濃度分別為0.5×MIC和1×MIC，每組3個(gè)重復(fù)，放于37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中，180 r/min培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)的12、24、36和48 h取出200 μL置于96孔板中，酶標(biāo)儀620 nm測(cè)吸光值。

2.8 堿性磷酸酶AKP含量檢測(cè)

以CAMHB肉湯為培養(yǎng)基，配制1.5×108 CFU/mL菌液，每玻璃試管分裝2 mL菌液，而后加入OXY，使其終濃度為0.5×MIC、1×MIC和2×MIC，同時(shí)設(shè)置DMSO陰性對(duì)照組，每組3個(gè)重復(fù)，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后，4000 r/min離心5 min，取上清液，利用AKP檢測(cè)試劑盒進(jìn)行AKP酶活性的檢測(cè)。

2.9 鉀離子含量檢測(cè)

用無(wú)菌生理鹽水配制1.5×108 CFU/mL菌液，每玻璃試管分裝2 mL菌液，而后加入OXY，使其終濃度為0.5×MIC、1×MIC和2×MIC，同時(shí)設(shè)置DMSO陰性對(duì)照組，每組3個(gè)重復(fù)，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后，4000 r/min離心5 min，取上清液，利用鉀離子檢測(cè)試劑盒進(jìn)行鉀離子濃度檢測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 OXY抗諾卡菌活性

借鑒紙片擴(kuò)散法的方法，對(duì)臨床收集的12株諾卡菌進(jìn)行OXY抗菌活性的初篩。如圖1A所示，以其中1株圣喬治教堂諾卡菌為例，6.25、12.5、25和50 mg/mL

OXY作用48 h的抑菌圈分別為9、14、19和24 mm。如圖1B所示，25和50 mg/mL OXY都能較好地抑制12株諾卡菌的生長(zhǎng)，12.5 mg/mL OXY對(duì)諾卡菌具有一定的抑菌作用。

如表1所示，OXY對(duì)8株圣喬治教堂諾卡菌、2株皮疽諾卡菌、1株巴西諾卡菌和1株亞洲諾卡菌的MIC值都為0.2 mg/mL，MBC值均為0.4 mg/mL，進(jìn)一步說(shuō)明OXY對(duì)諾卡菌具有較好的抑菌和殺菌作用。

3.2 OXY對(duì)諾卡菌生長(zhǎng)的影響

由圖2可知，1×MIC OXY都能夠顯著抑制圣喬治教堂諾卡菌和皮疽諾卡菌的生長(zhǎng)，并且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)抑制效果更為顯著，0.5×MIC OXY也能一定程度上抑制諾卡菌的生長(zhǎng)。例如，圣喬治教堂諾卡菌的陰性對(duì)照組在48 h時(shí)，A620值接近0.9，而0.5×MIC和1×MIC OXY處理組的A620值分別為0.1和0.35左右。結(jié)果表明OXY對(duì)諾卡菌的抑制作用呈濃度和時(shí)間相關(guān)性。

3.3 OXY對(duì)諾卡菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由圖3A可見(jiàn)，陰性對(duì)照組的圣喬治教堂諾卡菌呈現(xiàn)革蘭陽(yáng)性絲狀桿菌形態(tài)，0.5×MIC OXY作用圣喬治教堂諾卡菌24 h，細(xì)菌形態(tài)未發(fā)生明顯改變，而1×MIC OXY與2×MIC OXY作用后，圣喬治教堂諾卡菌形態(tài)發(fā)生顯著改變，由原來(lái)的革蘭陽(yáng)性絲狀桿菌變?yōu)楦锾m陰性、短而圓的橢球狀。

由圖3B的掃描電鏡試驗(yàn)可知未經(jīng)處理的圣喬治教堂諾卡菌呈現(xiàn)正常的長(zhǎng)桿狀形態(tài)，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整；用1×MIC OXY處理24 h的圣喬治教堂諾卡菌形態(tài)發(fā)生異常改變，細(xì)菌皺縮、細(xì)菌表面變粗糙；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)OXY處理后少部分細(xì)菌發(fā)生破裂。

透射電子顯微鏡試驗(yàn)顯示正常的圣喬治教堂諾卡菌的細(xì)胞壁與細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整、緊密相貼，胞漿分布均勻（圖3C）。而用1×MIC OXY處理24 h的圣喬治教堂諾卡菌細(xì)胞壁外形不平，邊緣粗糙；如圖3C紅色箭頭所示，細(xì)胞局部出現(xiàn)破裂，胞漿內(nèi)物質(zhì)溶解或外漏使菌體電子密度下降甚至出現(xiàn)部分“空穴”。

總之，以上結(jié)果表明OXY破壞了圣喬治教堂諾卡菌正常的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

3.4 OXY對(duì)諾卡菌細(xì)胞壁完整性的影響

AKP存在于細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間，當(dāng)抗菌藥物作用于細(xì)胞壁時(shí)，AKP將外泄。因此，檢測(cè)菌液上清中AKP的濃度可以反映菌株細(xì)胞壁的完整性。如圖4所示，OXY作用圣喬治教堂諾卡菌和皮疽諾卡菌24 h之后，上清中AKP的含量顯著升高，并且隨著OXY作用濃度的升高而升高，具有濃度依賴性，該結(jié)果進(jìn)一步表明OXY破壞了諾卡菌細(xì)胞壁的完整性。

3.5 OXY對(duì)諾卡菌細(xì)胞膜完整性的影響

鉀離子是細(xì)菌存活所必需的重要金屬離子，不斷地在細(xì)胞內(nèi)與組織液之間進(jìn)行交換，對(duì)維持細(xì)胞滲透壓平衡至關(guān)重要。細(xì)胞膜作為一種先天性屏障，能夠有效抑制鉀離子外流。所以當(dāng)鉀離子大量外漏時(shí)，說(shuō)明細(xì)胞膜完整性遭到破壞或其滲透性已發(fā)生改變。如圖5所示，OXY不管是作用圣喬治教堂諾卡菌還是皮疽諾卡菌，培養(yǎng)上清液中的鉀離子含量都顯著升高，并且隨著作用濃度的升高而升高，具有濃度依賴性，說(shuō)明OXY破壞了諾卡菌細(xì)胞膜的完整性。

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)可知，OXY具有較好的抗諾卡菌活性，其MIC值和MBC值分別為0.2和0.4 mg/mL，其抗菌機(jī)制可能是由于OXY引起細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的直接破壞，最終導(dǎo)致諾卡菌死亡。

4 討論與結(jié)論

諾卡菌病多見(jiàn)于免疫功能低下者，近年來(lái)由于腎上腺皮質(zhì)激素和免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，諾卡菌病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。諾卡菌病的治療療程相對(duì)較久，藥物毒副作用較大，同時(shí)可選藥物相對(duì)有限，而諾卡菌的耐藥形勢(shì)不容樂(lè)觀，開(kāi)發(fā)新型抗諾卡菌藥物勢(shì)在必行。

植物天然產(chǎn)物抗菌作用歷史悠久，而對(duì)人體相對(duì)安全，它是未來(lái)新型抗菌藥物的潛在來(lái)源，近年來(lái)研究者把目標(biāo)轉(zhuǎn)向植物天然產(chǎn)物。植物天然產(chǎn)物的主要優(yōu)勢(shì)在于其豐富而獨(dú)特的化學(xué)多樣性，在世界范圍內(nèi)廣泛分布并且易于獲取，并具有多種抗菌作用模式。OXY是一種天然存在的植物抗毒素，人體耐受性很好，它被認(rèn)為是一種很有前途的化合物，由于其抗菌和抗氧化特性，近年來(lái)被廣泛用于水果、蔬菜的保鮮研究[20-21]。

治療諾卡菌病首選的藥物是復(fù)方磺胺甲惡唑，其他可能對(duì)諾卡菌有活性藥物，包括碳青霉烯類、頭孢曲松、阿米卡星、米諾環(huán)素、氟喹諾酮類和阿莫西林克拉維酸。這些抗菌藥物的抑菌機(jī)制相對(duì)單一，例如，抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成、干擾蛋白質(zhì)的合成或抑制核酸的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，且目前已有較多相關(guān)耐藥報(bào)道，而植物天然產(chǎn)物可通過(guò)影響細(xì)胞膜與細(xì)胞壁完整性、抑制核酸蛋白質(zhì)合成、抑制能量代謝、抑制細(xì)菌生物膜形成和群體感應(yīng)、影響細(xì)菌外排泵和抑制細(xì)菌毒力因子釋放等多種途徑達(dá)到抑菌效果，相較于常規(guī)抗生素，難以出現(xiàn)耐藥性[22-23]。另外，根據(jù)CLSI M62[9]文件不同諾卡菌的藥敏模式存在較大差異，例如，圣喬治教堂諾卡菌對(duì)環(huán)丙沙星、克拉霉素和阿莫西林克拉維酸高度耐藥，巴西諾卡菌對(duì)亞胺培南、環(huán)丙沙星和克拉霉素高度耐藥，皮疽諾卡菌對(duì)頭孢曲松、妥布霉素和克拉霉素高度耐藥。但本研究發(fā)現(xiàn)OXY對(duì)12株4種諾卡菌表現(xiàn)出相同的抑菌活性，它們具有相同的MIC值和MBC值，其MIC值和MBC值分別為0.2和0.4 mg/mL，而后的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)OXY可能是通過(guò)破壞諾卡菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性發(fā)揮抗菌作用。通過(guò)本研究進(jìn)一步說(shuō)明細(xì)菌對(duì)植物天然產(chǎn)物不易產(chǎn)生耐藥性，植物天然產(chǎn)物具有廣闊的應(yīng)用前景。

但是，OXY具體的作用靶點(diǎn)和機(jī)制尚未闡明， Joung等[12]發(fā)現(xiàn)OXY是通過(guò)增加膜通透性、抑制ATP酶、引起細(xì)胞壁和膜損傷發(fā)揮抗金黃色葡萄球菌作用。Kim等[17]研究結(jié)果顯示在白色念珠菌中，OXY與DNA直接相互作用，觸發(fā)DNA鏈斷裂并導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，同時(shí)在DNA損傷過(guò)程中，OXY導(dǎo)致線粒體功能障礙，從而起到殺傷白色念珠菌的作用。OXY作用不同菌的活性和機(jī)制各不相同，相較于常規(guī)抗生素，植物天然產(chǎn)物的抗菌機(jī)制相對(duì)較為復(fù)雜，OXY進(jìn)一步的抗菌活性及其機(jī)制還有待研究。

總之，通過(guò)本研究可以為開(kāi)發(fā)新型抗諾卡菌藥物提供更多理論依據(jù)，同時(shí)拓展了OXY更多的潛在應(yīng)用價(jià)值。

參 考 文 獻(xiàn)

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