鹿茸菇液體菌種培養(yǎng)過(guò)程中生理指標(biāo)的變化規(guī)律

摘要： 鹿茸菇菌絲采用液體搖瓶培養(yǎng)，分別測(cè)定菌絲生物量、菌絲球數(shù)量、菌絲球直徑、發(fā)酵液pH 值、還原糖和氨基氮質(zhì)量濃度，淀粉酶酶活性、纖維素酶酶活性、漆酶酶活性等生理指標(biāo)。結(jié)果表明：鹿茸菇培養(yǎng)過(guò)程中菌絲生物量和菌絲球數(shù)量在第10天達(dá)到最大值，分別為2.33，106 CFU·mL-1，菌絲球直徑隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而持續(xù)變大；還原糖與氨基氮質(zhì)量濃度先增加而后逐漸降低；淀粉酶及纖維素酶酶活性最大值分別為0.17， 0.10 nkat，漆酶胞外酶活性呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)；搖瓶培養(yǎng)第8～10天的液體菌種生物量達(dá)到最大（0.42 mg·mL-1），液體菌種培養(yǎng)終點(diǎn)應(yīng)控制在第8～10天，此時(shí)菌種活力最高，可用于發(fā)酵罐擴(kuò)繁培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞： 鹿茸菇； 液體培養(yǎng)； 還原糖； 胞外酶

中圖分類(lèi)號(hào)： S 646文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A"" 文章編號(hào)： 1000-5013（2024）05-0667-06

Change Laws of Physiological Indexes of Lyophyllum decastes Liquid Strains Cultivation Process

Abstract： The mycelia of Lyophyllum decastes is cultured in liquid shake flasks. The physiological indexes such as mycelium biomass， the mycelium ball numbers， the mycelium ball diameters， the pH value of fermentation broth， the mass concentrations of reducing sugar and amino nitrogen， the enzymatic activities of amylases， cellulases and laccases are measured separately. The results show that the mycelium biomass and the mycelium ball numbers both reach the maximum values which are 2.33 mg·mL-1 and 106 CFU·mL-1 respectively on the 10th day. The mycelium ball diameter continues to increase with the extension of cultivation time. The mass concentrations of reducing sugars and amino nitrogen increase firstly and then decrease gradually. The maximum enzyme activities of amylase and cellulase are 0.17 and 0.10 nkat respectively， while the laccase extracellular enzyme activity increases significantly. The biomass of liquid bacterial strains reaches maximum of 0.42 mg·mL-1 on the 8th-10th day in shake flask cultivation， and the end point of the liquid culture should be controlled at the 8th-10th when the activity of the strain is the highest at this time and it can be used for fermenter propagation culture.

Keywords： Lyophyllum decastes； liquid culture； reducing sugar； extracellular enzyme

鹿茸菇，學(xué)名荷葉離褶傘（Lyophyllum decastes），又稱(chēng)荷葉蘑，屬傘菌目、白蘑科，離褶傘屬。鹿茸菇菌蓋呈現(xiàn)類(lèi)似鹿茸的形狀，擁有獨(dú)特的醫(yī)療作用與藥用價(jià)值［1］。 鹿茸菇營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，其子實(shí)體和菌絲的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為20%，28%，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為1.5%，3.0%，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為4.0%，1.8%［2-4］，其中，β-1，3-D葡聚糖、β-1，6-D葡聚糖［5］可起到良好的抗菌作用，在治療糖尿病和特異性皮膚炎、降低膽固醇、預(yù)防腫瘤癌癥方面有明顯作用［6］，因此，鹿茸菇在當(dāng)今的市場(chǎng)中有著巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

菌種質(zhì)量會(huì)影響菌絲的生長(zhǎng)及后續(xù)出菇情況，研究食用菌液體培養(yǎng)過(guò)程中的生理指標(biāo)變化規(guī)律，可以進(jìn)一步明確菌種生長(zhǎng)過(guò)程中的質(zhì)量變化情況，確定發(fā)酵終點(diǎn)，為液體菌種的最佳培育時(shí)間提供參考。戴建清［7］發(fā)現(xiàn)雙孢蘑菇菌種在培養(yǎng)至第8天時(shí)的菌絲生物量、菌絲球直徑及菌絲球個(gè)數(shù)均達(dá)到峰值，同時(shí)培養(yǎng)液中的各種胞外酶及活性物質(zhì)質(zhì)量濃度也達(dá)到最高。劉海娟等［8］發(fā)現(xiàn)白靈菇液體發(fā)酵菌種最佳培養(yǎng)時(shí)間為第5天，從而有效縮短栽培周期。余昌霞等［9］發(fā)現(xiàn)草菇液體菌種培養(yǎng)終點(diǎn)在84～96 h，從而大大縮短了草菇菌種所需的活化時(shí)間。殷書(shū)平等［10］發(fā)現(xiàn)香菇液體菌種最佳培育時(shí)間為8～9 d。但目前，尚未有對(duì)鹿茸菇菌液體培養(yǎng)過(guò)程中生理指標(biāo)變化規(guī)律的研究。

以往對(duì)于液體菌種發(fā)酵終點(diǎn)的研究，將菌絲生物量作為主要衡量指標(biāo)［11］。然而，除了菌絲生物量外，還有一些重要的生理指標(biāo)可表征菌種活力，有研究認(rèn)為菌絲生物量與菌絲活力之間并沒(méi)有必然聯(lián)系，只是反應(yīng)發(fā)酵狀態(tài)的指標(biāo)之一［12］。因此，本文對(duì)鹿茸菇液體菌種培養(yǎng)過(guò)程中生理指標(biāo)的變化規(guī)律進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 菌種選擇

鹿茸菇菌種由福建省廈門(mén)市如意食用菌生物高科技有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基的配置

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：40 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉末，加入1 000 mL蒸餾水溶解，在121 ℃，高壓下，滅菌20 min，冷卻倒平板，備用。

馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）培養(yǎng)基：25 g馬鈴薯葡萄糖肉湯，加入1 000 mL蒸餾水溶解，在121 ℃，高壓下，滅菌20 min，備用。

1.3 鹿茸菇菌種的活化

將鹿茸菇菌種接種到 PDA培養(yǎng)基中，在28 ℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，備用。

1.4 液體培養(yǎng)

取100 mL的PDB培養(yǎng)液于250 mL錐形瓶中，在121 ℃下，滅菌20 min，待培養(yǎng)液冷卻后，接種2塊菌塊（1 cm2活化的 PDA菌種）。在24 ℃，180 r·min-1下，振蕩培養(yǎng)液，每隔2 d隨機(jī)取3個(gè)錐形瓶檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.5 菌絲球的測(cè)定

取20 mL發(fā)酵液于50 mL離心管中，在4 ℃，12 000 r·min-1下離心20 min，蒸餾水洗滌3次沉淀菌絲，在65 ℃下烘干至恒質(zhì)量。取4 mL培養(yǎng)液于平皿中計(jì)數(shù)菌絲球數(shù)量。取2 mL發(fā)酵液，隨機(jī)選取測(cè)量菌絲球最長(zhǎng)和最短長(zhǎng)度，取平均值記為菌絲球直徑。

1.6 發(fā)酵液pH值的測(cè)定

采用pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的pH值。

1.7 還原糖及氨基氮質(zhì)量濃度的測(cè)定

采用二硝基水楊酸法（DNS）法測(cè)定還原糖質(zhì)量濃度［13-14］，采用茚三酮法測(cè)定氨基氮質(zhì)量濃度［15］。

1.8 纖維素酶、淀粉酶、漆酶活性的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)［15-16］測(cè)定纖維素酶活性。1個(gè)酶活單位為每分鐘釋放出1 mg葡萄糖需要的酶量。

根據(jù)文獻(xiàn)［15］中的方法測(cè)定淀粉酶活性。1個(gè)酶活單位定義為每分鐘生成1 μmol葡萄糖需要的酶量。

根據(jù)文獻(xiàn)［17］的方法測(cè)定漆酶酶活性。1個(gè)酶活單位定義為每分鐘內(nèi)催化氧化1 μmol 2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）需要的酶量。

1.9 菌種活力的測(cè)定

將培養(yǎng)時(shí)間為2，4，6，8，10，12 d的液體菌種再次進(jìn)行液體培養(yǎng)，接種量為體積分?jǐn)?shù)4%液體培養(yǎng)基，在24 ℃，180 r·min-1下，振蕩培養(yǎng)6 d，取樣計(jì)算菌絲生物量及菌絲球數(shù)量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 菌絲球的變化情況

不同培養(yǎng)時(shí)間鹿茸菇菌絲球變化情況，如圖1所示。圖1中：ρ為菌絲生物量；n為菌絲球數(shù)量；D為菌絲球直徑。由圖1可知：在培養(yǎng)過(guò)程前6 d中，菌絲生物量增加緩慢，第6～10天鹿茸菇菌絲生物量增長(zhǎng)加快，第10～12天菌絲生物量增長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，菌絲生物量達(dá)到最高峰值（環(huán)境峰值，2.33 mg·mL-1）；在培養(yǎng)過(guò)程中，菌絲球數(shù)量穩(wěn)步增長(zhǎng)，第10天達(dá)到最大值為106 CFU·mL-1，與菌絲生物量變化一致，第10天后營(yíng)養(yǎng)成分減少，菌絲活性下降，菌絲球數(shù)量減少；菌絲球直徑持續(xù)增加，前8 d增長(zhǎng)較為緩慢，第8～10天增長(zhǎng)迅速，在后期菌絲球邊緣出現(xiàn)明顯絨毛，第12天達(dá)到最大值為5.84 mm，菌絲球表面呈現(xiàn)光滑狀態(tài)。

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間菌液pH值的變化情況

菌液pH值會(huì)隨著菌絲的生長(zhǎng)而變化，影響菌絲胞外酶活性及細(xì)胞膜內(nèi)外電位差，從而影響培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收。不同培養(yǎng)時(shí)間鹿茸菇培養(yǎng)液pH值的變化情況，如圖2所示。由圖2可知：由于菌絲生長(zhǎng)分解葡萄糖，使丙酮酸迅速積累，pH值在第0～2天呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；而后菌絲產(chǎn)生代謝生成堿性物質(zhì)，pH值在第2～6天小幅回升；酸性代謝物質(zhì)在培養(yǎng)液中持續(xù)累積，pH值在第6～10天下降至最低值1.93；第10天后，菌絲生長(zhǎng)步入平緩，還原糖消耗，部分老化菌絲自溶后釋放氨基酸等堿性物質(zhì)，pH值出現(xiàn)上升趨勢(shì)。

2.3 還原糖及氨基氮質(zhì)量濃度變化情況

還原糖與氨基氮質(zhì)量濃度變化曲線，如圖3所示。圖3中：ρr，ρn分別為還原糖、氨基酸的質(zhì)量濃度。

由圖3可知：鹿茸菇菌液中還原糖質(zhì)量濃度在第0～6天呈上升趨勢(shì)，第6天達(dá)到峰值5.02 mg·mL-1；鹿茸菇菌液中氨基氮質(zhì)量濃度在第2～4天呈下降趨勢(shì)，隨著菌絲生長(zhǎng)，胞外酶分泌增多，培養(yǎng)基內(nèi)氮源生成大于消耗，呈上升趨勢(shì)，在第10天達(dá)峰值0.89 mg·mL-1，后再次下降；第10天后，鹿茸菇菌絲生物量達(dá)到最大開(kāi)始趨于平緩，不斷消耗培養(yǎng)基內(nèi)大量含氮物質(zhì)，氨基氮質(zhì)量濃度呈下降趨勢(shì)。

2.4 不同培養(yǎng)時(shí)間菌液中胞外酶酶活性變化情況

在培養(yǎng)過(guò)程中，胞外酶會(huì)將基料中的營(yíng)養(yǎng)成分轉(zhuǎn)化為自身的物質(zhì)，胞外酶活力的高低決定著鹿茸菇對(duì)培養(yǎng)基物料中物質(zhì)的降解速率。不同培養(yǎng)時(shí)間鹿茸菇菌液中胞外酶酶活性變化情況，如圖4所示。圖4中：za為淀粉酶活性；zc為纖維素酶活性；zl為漆酶活性。由圖4可知：淀粉酶與纖維素酶活性均呈先上升后下降趨勢(shì)，淀粉酶活性于第6天達(dá)到峰值0.17 nkat；纖維素酶于第10天達(dá)到峰值 0.10 nkat；漆酶在培養(yǎng)過(guò)程時(shí)間內(nèi)，整體一直處于較快的上升趨勢(shì)，第0～6天增長(zhǎng)緩慢，第6～10天增長(zhǎng)迅速，第10～12天相對(duì)趨于穩(wěn)定。

2.5 不同培養(yǎng)時(shí)間液體菌種活力驗(yàn)證

為進(jìn)一步探究鹿茸菇液體菌種最佳培養(yǎng)時(shí)間，將培養(yǎng)時(shí)間為2，4，6，8，10，12 d的液體菌種再次進(jìn)行為期12 d的液體培養(yǎng)，不同培養(yǎng)時(shí)間菌絲生物量與菌絲球數(shù)量，如圖5所示。

由圖5可知：液體菌種再次培養(yǎng)8，10 d的得到的菌絲生物量最大，分別為0.41，0.42 mg·mL-1，與液體菌種培養(yǎng)2，4，6，12 d得到的菌絲生物量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第8天的液體菌種再次培養(yǎng)得到的菌絲球數(shù)量最大，為28 CFU·mL-1，與液體菌種培養(yǎng)2，4，6，8，10，12 d得到菌絲生物量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此，在液體培養(yǎng)第8～10天的鹿茸菇菌種更適宜作為發(fā)酵罐工廠化培養(yǎng)的種源。

3 結(jié)論

在鹿茸菇液體培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)培養(yǎng)第0～3天時(shí)，由于菌種需要適應(yīng)新的生長(zhǎng)環(huán)境，其菌絲生物量（圖1（a））、菌絲球數(shù)量（圖1（b））及菌絲球直徑（圖1（c））沒(méi)有明顯增長(zhǎng)，此結(jié)果與余昌霞等［9］對(duì)草菇、伍晉雨［18］對(duì)靈芝與金針菇的研究結(jié)果一致。在培養(yǎng)中后期，菌絲生物量、菌絲球數(shù)量、菌絲球直徑、氨基氮質(zhì)量濃度（圖3（b））等生理指標(biāo)在培養(yǎng)第10天均達(dá)到峰值。隨著培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分的減少及菌絲開(kāi)始老化和菌絲活性減弱，其生理指標(biāo)開(kāi)始逐漸下降，到第12天，菌絲普遍老化，并產(chǎn)生自溶現(xiàn)象，此結(jié)果與殷書(shū)平［10］研究的香菇理化指標(biāo)變化趨勢(shì)相似，第8～10天的鹿茸菇菌絲活力最高，此結(jié)果與單燦燦等［19］對(duì)鹿茸菇菌種活力的研究結(jié)果一致。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，菌絲生物量，菌絲球數(shù)量及菌絲球直徑在培養(yǎng)的時(shí)間為第0～10天均處于穩(wěn)定上升狀態(tài)，第10天之后開(kāi)始維持穩(wěn)定甚至有所下降，由此預(yù)測(cè)鹿茸菇菌絲最適宜接種并進(jìn)行下一步培養(yǎng)的時(shí)間約為第8～10天。

在液體培養(yǎng)及生理指標(biāo)檢測(cè)中，培養(yǎng)初期，胞外酶尚未分泌，菌絲增長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)中期，菌絲生長(zhǎng)逐漸旺盛，還原糖質(zhì)量濃度變化呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，在第6天達(dá)到峰值，此時(shí)由于菌絲大量繁殖，致使培養(yǎng)基中環(huán)境承載量即將達(dá)到飽和，菌絲對(duì)于碳源的利用逐漸大于產(chǎn)出，形成還原糖質(zhì)量濃度下降趨勢(shì)。培養(yǎng)液pH值在整個(gè)培育過(guò)程中的變化趨勢(shì)整體呈現(xiàn)先降低、后升高的趨勢(shì)，在無(wú)人為干擾情況下，鹿茸菇菌絲在生長(zhǎng)過(guò)程中通過(guò)代謝調(diào)節(jié)環(huán)境pH值，此過(guò)程在段應(yīng)策等［20］測(cè)定香菇最適生長(zhǎng)pH值實(shí)驗(yàn)中得到相似驗(yàn)證，在培養(yǎng)第10～12天時(shí)，由于菌絲老化，停止生長(zhǎng)繁殖，代謝減緩并開(kāi)始自溶釋放胞內(nèi)氨基酸等物質(zhì)，培養(yǎng)液pH值呈現(xiàn)一段上升趨勢(shì)。胞外酶會(huì)將培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分轉(zhuǎn)化為自身需要的物質(zhì)，胞外酶的酶活性大小影響著其對(duì)培養(yǎng)基成分的降解速率，同時(shí)也影響著鹿茸菇對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收率。在培養(yǎng)過(guò)程中，鹿茸菇中漆酶的酶活性相較于淀粉酶及纖維素酶的酶活性變化非常明顯（圖4），在第10天時(shí)達(dá)到快速增長(zhǎng)巔峰，隨后緩慢變化增加。漆酶是降解木質(zhì)素大分子物質(zhì)的主要酚氧化酶，能加速木質(zhì)素芳香族高分子化合物的分解，提供菌絲所需的營(yíng)養(yǎng)，漆酶酶活性越高，菌株分解木質(zhì)素的能力越強(qiáng)［21］。鹿茸菇的漆酶酶活性較另外兩種胞外酶變化更加明顯，因此，漆酶在鹿茸菇胞外酶中具有較高酶活。牛鑫等［22］在鹿茸菇漆酶基因測(cè)定中也同樣得出此結(jié)論，并從基因方面對(duì)此進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。由于漆酶分解木質(zhì)素會(huì)提供菌絲生長(zhǎng)的部分能量，使纖維素酶及淀粉酶變化幅度不高。纖維素酶及淀粉酶的微小變化趨勢(shì)與戴建清［7］研究的雙孢蘑菇的胞外酶變化趨勢(shì)具有相似性。

在菌種活力驗(yàn)證方面，將培養(yǎng)不同時(shí)間的菌種進(jìn)行二次培養(yǎng)，結(jié)果表明，再次培養(yǎng)的第8，10天鹿茸菇菌種生物量達(dá)到最大，分別為0.41，0.42 mg·mL-1?？蔓惸鹊龋?3］研究證明杏鮑菇工廠化最適合發(fā)酵種為培養(yǎng)第10天的菌種，與文中鹿茸菇的最佳發(fā)酵菌種時(shí)間相近，表明培養(yǎng)第8～10天的菌種進(jìn)行二次發(fā)酵，更有利于提升發(fā)酵水平，有利于鹿茸菇工廠化階段的菌種繁育，可為鹿茸菇工廠化生產(chǎn)液體菌種擴(kuò)繁提供重要參考。

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