不同栽培基質(zhì)配方對銀耳胞外酶活性的影響

馬運(yùn)龍 林占熺 陳超前 黃暖云 林興生

摘 要：為探明不同栽培基質(zhì)配方對銀耳胞外酶活性的影響，以棉籽殼和木屑原料為對照，利用鮮綠洲1號、鮮巨菌草等菌草為主要原料工廠化栽培銀耳，比較不同配方銀耳不同生長期胞外酶活性。結(jié)果表明：銀耳在不同栽培基質(zhì)下羧甲基纖維素酶、濾紙纖維素酶、淀粉酶、漆酶和木聚糖酶等胞外酶活力大小為棉籽殼（C1）>鮮綠洲1號（L1）>鮮巨菌草（J1）>木屑（C2），以鮮菌草為原料工廠化栽培銀耳的營養(yǎng)基質(zhì)利用能力強(qiáng)于木屑，鮮菌草可以替代木屑作為原料工廠化栽培銀耳。

關(guān)鍵詞：銀耳;鮮菌草;胞外酶

中圖分類號：S 646.14 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ??文章編號：0253-2301（2021）11-0023-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.11.004

Effects of Different Cultivation Substrate Formulations on theExtracellular Enzyme Activities of Tremella Fuciformis

MA Yun-long1， LIN Zhan-xi1， CHEN Chao-qian1， HUANG Nuan-yun2， LIN Xing-sheng1*

（1. National Engineering Research Center of JUNCAO Technology， Fujian Agriculture and

Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 2. Fujian Xiangyun Biotechnology

Development Co.， Ltd.， Sanming， Fujian 365106， China）

Abstract： In order to explore the effects of different cultivation substrate formulations on the activities of extracellular enzymes of Tremella fuciformis， the cottonseed shell and sawdust were used as the control， and the fungi such as fresh Lvzhou No.1 and fresh Pennisetum giganteum were used as the main raw materials for the industrial cultivation of Tremella fuciformis， thus to compare the activities of extracellular enzymes of Tremella fuciformis in different growth stages. The results showed that the activities of extracellular enzymes such as carboxymethyl cellulase， filter paper cellulase， amylase， laccase and xylanase under different cultivation substrates of Tremella fuciformis were as follows： cottonseed shell （C1） > fresh Lvzhou No.1 （L1） > fresh Pennisetum giganteum （J1） > sawdust （C2）. The utilization ability of nutrient matrix in the industrial cultivation of Tremella fuciformis by using fresh fungi as the raw material was stronger than that of sawdust， and fresh fungi could replace sawdust as raw material for the industrial cultivation of Tremella fuciformis.

Key words： Tremella fuciformis; Fresh fungi; Extracellular enzyme

銀耳Tremella fuciformis Berk，是一種食藥同源的大型真菌[1-2]，可段木栽培和代料栽培。以棉籽殼為原料栽培銀耳，雖然產(chǎn)量高，其質(zhì)量不如段木或木屑銀耳[3-5]，可能產(chǎn)生農(nóng)藥殘留[6]及棉酚危害[7-9]等問題，導(dǎo)致銀耳價格較低;以木屑為原料栽培銀耳，品質(zhì)較好，產(chǎn)量比棉籽殼栽培的低，但由于林木的再生能力弱，多地限制砍伐樹木用于栽培菌類，嚴(yán)重制約了銀耳產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[5]。1986年福建農(nóng)林大學(xué)發(fā)明了菌草技術(shù)[10]，利用五節(jié)芒、蘆葦、巨菌草、類蘆等干菌草栽培食藥用菌，并初步探索出菌草栽培銀耳技術(shù)[11-13]。傳統(tǒng)食用菌理論認(rèn)為，腐生菌類所需的營養(yǎng)物質(zhì)來自已經(jīng)死亡的及無生活力的有機(jī)物，只能從枯死的木本和草本植物中吸收營養(yǎng)并形成子實體，活性植物細(xì)胞具有抗性，且含水量高達(dá)90%以上，菌絲無法生長，原料干燥目的是殺死植物細(xì)胞，使其生理含水量降低。本研究旨在探討利用未經(jīng)干燥的鮮菌草栽培銀耳[1，4]。

銀耳的生長離不開對栽培基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)的利用，木質(zhì)纖維素、淀粉等物質(zhì)是食用菌生長的主要能量來源[14]，但它們不能直接被菌絲吸收利用。食用菌通過分泌胞外酶，把木質(zhì)纖維素分解成可被菌絲吸收的小分子碳水化合物，進(jìn)而為菌絲的生長提供能量[15]。胞外酶的活力可以反映出菌絲在不同時期對栽培基質(zhì)的利用情況，本研究以棉籽殼和木屑原料作為對照，以鮮綠洲1號Arundo Donax Lvzhou No.1、鮮巨菌草Pennisetumgiganteumz.x.lin為主要原料工廠化栽培銀耳，通過比較不同配方工廠化栽培銀耳的胞外酶在不同時期的變化規(guī)律，分析銀耳生長過程中對不同栽培基質(zhì)的利用情況，了解鮮菌草配方與棉籽殼或木屑配方對營養(yǎng)物質(zhì)利用的差異，為鮮菌草工廠化栽培銀耳配方優(yōu)化及其生產(chǎn)工藝提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

銀耳XY04（A4）菌株，由福建省祥云生物科技發(fā)展有限公司提供。

1.2 栽培配方

L1：鮮綠洲1號54%，棕櫚仁粕20%，蓮子殼10%，麥麩14%，石膏1%，石灰1%;J1：鮮巨菌草54%，棕櫚仁粕20%，蓮子殼10%，麥麩14%，石膏1%，石灰1%;C1：棉籽殼71%，麥麩28%，石膏1%;C2：木屑71%，麥麩28%，石膏1%。

按比例稱取原料，投入攪拌機(jī)中加入適量水，攪拌40 min，控制含水率在58%左右，拌勻后裝瓶，每瓶裝料560 g，打孔封口，于滅菌鍋中滅菌6 h，移入無菌房，冷卻后接種。

1.3 工廠化栽培條件

接種后的栽培瓶移入養(yǎng)菌房中，保持溫度20～23℃，相對濕度80%～85%，25 d后，栽培瓶開蓋，移入出菇房中，控制溫度23～25℃，相對濕度80%，待耳片舒展時濕度控制在90%，于采收前5 d降低室內(nèi)濕度，42 d時進(jìn)行采收。

1.4 樣品收集

接種后，各配方每6 d取樣一次，每次取3瓶作為生物學(xué)重復(fù)，共取樣7次。取出栽培料后，搓碎拌勻，取100 g栽培料，用液氮速凍后于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 胞外酶活性測定

1.5.1 粗酶液制備 稱取10 g解凍后的栽培料，研磨后移入三角瓶中，加入50 mL 蒸餾水，于25℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中150 r·min-1浸提90 min，浸提液用雙層紗布進(jìn)行過濾，濾液用蒸餾水定容至50 mL，9000 ?r·min-1離心15 min，上清液即為粗酶液。

1.5.2 羧甲基纖維素酶活性測定 向試管中依次加入預(yù)熱的粗酶液0.5 mL和1% C8H11O5Na溶液1 mL，以煮沸滅活的粗酶液為對照組，于50℃水浴30 min。迅速加入DNS溶液1.5 mL，沸水浴反應(yīng)7 min，立即用流水冷卻，用蒸餾水定容至10 mL，于540 nm處測定吸光度值。酶活力單位的定義為：在50℃、pH 4.5的條件下，1 min水解底物生成1 μg葡萄糖為1個酶活力單位

U[16]。

1.5.3 濾紙纖維素酶活性測定 向試管中加入預(yù)熱的粗酶液0.5 mL和CH3COONa緩沖液（pH 4.5）1 mL，再加入（50±0.5）mg濾紙1條（1 cm×6 cm），以高溫滅活的粗酶液為對照組，于50℃水浴1 h。立即加入DNS溶液1.5 mL，沸水浴反應(yīng)7 min，立即用流水冷卻，用蒸餾水定容至10 mL，于540 nm處測定吸光度值。酶活力單位的定義為：在50℃，pH 4.5條件下，1 mL酶液1 min水解底物生成1 μg葡萄糖為1個酶活力單位U[17]。

1.5.4 淀粉酶活力測定 取可溶性淀粉溶液4 mL于試管中，加入磷酸緩沖液1 mL，再加入0.5 mL粗酶液，以煮沸滅活的粗酶液為對照組，于50℃水浴30 min。取反應(yīng)液1 mL，迅速加入盛有0.5 mL稀鹽酸和5 mL稀碘液的試管中，于660 nm處測定吸光度值。酶活力單位的定義為：在60℃、pH 6.0條件下，1 min水解1 μg可溶性淀粉，定義為1個淀粉酶活力單位U[18]。

1.5.5 漆酶活力測定 取1 mmol·L-1 ABTS溶液0.1 mL于96孔板中，加入CH3COONa緩沖液（pH 4.5）0.15 mL，于30℃預(yù)熱5 min，加入粗酶液50 μL，立即記錄吸光度值，每隔30 s記錄1次，共記錄3 min。酶活力單位的定義為：在30℃、pH 4.5條件下1 min氧化1 μmolABTS所需酶量定義為1個酶活力單位U[19-20]。

1.5.6 木聚糖酶活力測定 取1% 木聚糖溶液0.75 mL于試管中，加入粗酶液0.25 mL，以煮沸滅活的粗酶液作為對照組，50℃保溫30 min，立即向試管中加入DNS試劑1.5 mL，沸水浴7 min，流水冷卻至室溫，用蒸餾水定容至10 mL，于540 nm處測定吸光度值。酶活力單位的定義為：在50℃、pH 5.2條件下，1 min水解底物生成1 μg木糖所需的酶量定義為1個酶活力單位U[21]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 25軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 羧甲基纖維素酶活力變化

羧甲基纖維素酶是纖維素降解酶系的代表之一，該酶活力的變化能反映出銀耳對栽培基質(zhì)中纖維素的利用情況。由圖1可知，不同配方隨著栽培時間的增加，羧甲基纖維素酶活性呈現(xiàn)出先升高，后降低，再升高的過程，其中，第1次峰值，L1和J1出現(xiàn)在第24 d，且L1顯著高于J1，C1和C2出現(xiàn)在第18 d，C1顯著高于C2，但它們均在第30 d下降至最低值，C1顯著高于J1，J1顯著高于L1，L1顯著高于C2。結(jié)合銀耳的生長特性分析，在第24 d至30 d羧甲基纖維素酶活力的降低可能與銀耳原基形成有關(guān)，在第30 d之后，子實體的生長需要消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)，因此酶活力迅速升高，為子實體提供足夠的養(yǎng)分，從原基形成（第24 d）至子實體成熟（第42 d），C1、 L1 、J1的羧甲基纖維素酶活力均顯著高于C2。

2.2 濾紙纖維素酶活力變化

濾紙纖維素酶活力也是反應(yīng)纖維素降解酶系的重要標(biāo)志。由圖2可知，濾紙纖維素酶活力隨著栽培時間的延長，總體上呈現(xiàn)上升之后保持平穩(wěn)的趨勢。在菌絲生長第12 d，C1的酶活力顯著高于其他配方，L1、J1、C2差異不顯著。C2的濾紙纖維素酶活力在24 d后低于其他配方且差異顯著，J1的酶活力波動較大，其他配方酶活力升高之后較為平穩(wěn)。L1的酶活力均低于C1，但變化趨勢與之相同。綜合羧甲基纖維素酶和濾紙纖維素酶的數(shù)據(jù)來看，C1、L1、J1的纖維素酶活力均高于C2。

2.3 淀粉酶活力變化

淀粉酶可以分解栽培基質(zhì)中的淀粉等多糖類物質(zhì)，使其水解成可供菌絲吸收利用的單糖等小分子物質(zhì)，是菌絲生長過程中參與碳水化合物代謝的關(guān)鍵酶之一。由圖3可知，隨著栽培時間的延長，L1和J1的淀粉酶活力逐漸升高，至子實體成熟期開始達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，而C1和C2則是先升高后緩慢降低，在原基形成階段達(dá)到峰值。在菌絲生長期，C1的淀粉酶活力顯著高于其他配方，C2次之，在第30 d，不同配方淀粉酶活力無顯著差異，在子實體生長后期，L1和J1的酶活力較接近，且顯著高于C1和C2。菌草配方L1和J1的淀粉酶活力在菌絲生長和原基形成期（30 d前）低于棉籽殼和木屑配方，而在子實體生長期，菌草配方的淀粉酶活力繼續(xù)升高，顯著高于棉籽殼和木屑配方，并保持平穩(wěn)。

2.4 漆酶活力變化

漆酶是一種多酚氧化酶，在栽培料中主要降解木質(zhì)素。由圖4可知，4個配方的漆酶活力均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，但達(dá)到峰值的時間不同。C1和C2在菌絲生長期的活力高于L1和J1，在第24 d達(dá)到峰值，之后迅速下降，而L1和J1則分別在第30 d和第36 d達(dá)到峰值，且下降較緩慢。在菌絲生長24 d，漆酶活力C1顯著高于C2，C2顯著高于L1和J1。在第36 d至42 d時，L1、J1菌草配方的漆酶活力顯著高于C1棉籽殼和C2木屑配方。

2.5 木聚糖酶活力變化

木聚糖酶活力可以顯示出銀耳菌絲對半纖維素的降解能力。由圖5可知，不同配方木聚糖酶活力隨栽培時間延長逐漸升高。在菌絲生長18 d，木聚糖酶活力C1 顯著高于L1、C2和J1，L1和C2差異不顯著，J1最低，與其他差異顯著。各配方的木聚糖酶活力均在出菇期達(dá)到峰值，從第30 d至42 d（出菇期），C2顯著低于J1、C1和L1。

3 討論與結(jié)論

3.1 不同配方工廠化栽培銀耳的胞外酶變化趨勢

胞外酶活性的高低決定了銀耳菌絲在不同時期對栽培基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)的利用情況。綜合各組酶活數(shù)據(jù)分析，在菌絲生長期，C1的胞外酶活力均高于其他配方，而J1則最低，但是在子實體成熟期，則是J1最高，C2的酶活力最低。從變化趨勢分析，C1和C2的變化趨勢相同，這兩個配方無論是升高和下降的趨勢，還是達(dá)到峰值的時間，均顯示出強(qiáng)的同步性。兩個鮮菌草配方與兩個對照配方相比，變化的趨勢不同。

3.2 不同配方栽培銀耳與前人研究結(jié)果的對比

在菌絲生長期，C1對木質(zhì)纖維素和淀粉的利用能力高于其他配方，這可能是C1產(chǎn)量高的原因，趙超等[22]研究表明，胞外酶的活力與子實體產(chǎn)量顯著相關(guān)。酶活力的變化趨勢與王長文[17]的研究結(jié)果相同，纖維素和木質(zhì)素酶活力均是先升高后降低的趨勢;各配方半纖維素酶活力呈現(xiàn)出持續(xù)升高的趨勢，這與王慶福[23]的研究結(jié)果類似;淀粉酶的變化趨勢則與陳岡等[24]的研究結(jié)果不同，他認(rèn)為銀耳的淀粉酶活力是升高降低再升高再降低的趨勢，但是在本研究中，棉籽殼配方的淀粉酶活力只有一個峰值，這可能與栽培配方和培養(yǎng)條件不同有關(guān)。劉欣怡等[25]研究了鮮菌草和干菌草栽培平菇的胞外酶活性，以木屑配方為對照，發(fā)現(xiàn)從菌絲滿袋期開始，漆酶的活力先升高后降低，而半纖維素酶則是菌草配方呈逐漸降低趨勢，木屑配方呈先升高后降低的趨勢，其變化趨勢與銀耳中的酶活力變化趨勢不同，這可能與不同食用菌品種有關(guān)。

總體上，不同配方工廠化栽培銀耳的羧甲基纖維素酶、濾紙纖維素酶、淀粉酶、漆酶和木聚糖酶等胞外酶活力為棉籽殼（C1）>鮮綠洲1號（L1）>鮮巨菌草（J1）>木屑（C2），說明鮮綠洲1號、鮮巨菌草等鮮菌草工廠化栽培銀耳的營養(yǎng)基質(zhì)利用能力強(qiáng)于木屑，鮮菌草可替代木屑栽培銀耳。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）