耐高溫萌發(fā)菌胞外酶活性與天麻種子萌發(fā)的關(guān)系

趙芳娟 鄧百萬 解修超 常寧 寧靜 楊學(xué)英

摘要：為探究耐高溫萌發(fā)菌在模擬夏季高溫條件下漆酶、木聚糖酶、淀粉酶和纖維素酶的活性與天麻種子萌發(fā)的關(guān)系。對4株萌發(fā)菌進行遞增式耐高溫馴化，采用2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）法、二硝基水楊酸（DNS）法測定萌發(fā)菌胞外酶活性，水瓊脂法進行天麻種子萌發(fā)試驗。結(jié)果表明，各菌株之間的酶活性及各菌株之間天麻種子萌發(fā)率存在明顯差異，經(jīng)過馴化的耐高溫萌發(fā)菌4種酶活性和天麻種子萌發(fā)率均極顯著高于各自對應(yīng)親本萌發(fā)菌（P<0.01），其中漆酶、木聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶活性最高的分別是耐高溫萌發(fā)菌SH-1、MDA-1、MDC-1、SH-1，酶活性依次為1 000.00、1062.35、402.90、40.91 U/L，天麻種子萌發(fā)率最高的是耐高溫萌發(fā)菌SH-1，萌發(fā)率為71.76%，酶活性與天麻種子萌發(fā)率相關(guān)性最高的是木聚糖酶，相關(guān)系數(shù)為0.720。說明天麻種子萌發(fā)受溫度、胞外酶種類及活性等多種因素共同調(diào)控，耐高溫萌發(fā)菌表現(xiàn)出了更高的酶活性，促進天麻種子萌發(fā)，且木聚糖酶是影響天麻種子萌發(fā)的關(guān)鍵胞外酶。

關(guān)鍵詞：小菇屬萌發(fā)菌;耐高溫;胞外酶;天麻種子;萌發(fā)率

中圖分類號：S567.23+9.01;S182 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）04-0205-06

收稿日期：2021-10-11

基金項目：陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃（編號：2015QTGC-033）。

作者簡介：趙芳娟（1995—），女，陜西咸陽人，碩士研究生，主要從事微生物資源保育與開發(fā)研究。E-mail：975218223@qq.com。

通信作者：鄧百萬，碩士，教授，主要從事微生物資源保護與開發(fā)利用研究。E-mail：2210309868@qq.com

天麻（Gastrodia elata Bl.），多年生草本，是以無性繁殖和有性繁殖交替進行的無根無綠色葉片的異養(yǎng)型植物，有性繁殖需與紫萁小菇等天麻種子萌發(fā)菌共生萌發(fā)[1-2]，具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、降血壓等功效[3]。萌發(fā)菌為擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）小菇屬（Mycena）真菌，和蜜環(huán)菌均為天麻生長過程中的必要共生菌[4-5]。相較于蜜環(huán)菌而言，關(guān)于天麻萌發(fā)菌的研究較少，目前對萌發(fā)菌的研究都集中在采集、分離、篩選、復(fù)壯、培養(yǎng)條件和生物學(xué)特性等方面，例如，對萌發(fā)菌菌種制作和遺傳多樣性研究[6-7]、天麻種子萌發(fā)中的基因表達變化和脅迫條件影響天麻種子萌發(fā)率研究[8-9]以及萌發(fā)菌原生質(zhì)體的制備[10]，也有學(xué)者們對萌發(fā)菌化學(xué)成分進行研究[11]。

萌發(fā)菌品質(zhì)直接影響天麻種子的萌發(fā)率，而高溫也是影響種子萌發(fā)的重要因素之一，且當(dāng)外界溫度高于30℃時，菌絲失去活力甚至死亡[11]。由于受種子成熟時間的限制，天麻種子萌發(fā)時間為6—7月，而天麻主產(chǎn)區(qū)漢中夏季高溫現(xiàn)象頻繁出現(xiàn)，高于30 ℃的天氣可長達十幾天。所以，耐高溫萌發(fā)菌對實現(xiàn)天麻種子高溫條件下萌發(fā)至關(guān)重要。萌發(fā)菌廣泛分布于各地，主要生長于溫帶和寒溫帶較為潮濕的枯枝爛葉上，因此，萌發(fā)菌對包括溫度在內(nèi)的環(huán)境因子具有很廣泛的適應(yīng)性。大型真菌分泌胞外酶可以直接影響真菌對于營養(yǎng)物質(zhì)的利用情況，其活性與溫度等環(huán)境生長因子密切相關(guān)，其胞外酶種類及活性也與真菌的種類有關(guān)[12]。萌發(fā)菌胞外酶對植物細胞壁的降解能力以及植物的生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用，也與天麻種子萌發(fā)密切相關(guān)。徐錦堂等的研究表明，天麻種子萌發(fā)的直接營養(yǎng)來源是萌發(fā)菌，不同產(chǎn)地的萌發(fā)菌對天麻種子萌發(fā)率的影響不同[13]，預(yù)示著萌發(fā)菌胞外酶種類、活性及溫度對其生長及天麻種子萌發(fā)有很大影響。因此，研究萌發(fā)菌胞外酶活性對溫度的響應(yīng)對于萌發(fā)菌的生長發(fā)育和天麻種子萌發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義，以期為天麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

試驗所用萌發(fā)菌均為陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心保藏菌株，分別為MDC、MDA、8C、SH，將馴化得到的耐高溫萌發(fā)菌MDC、MDA、8C、SH依次命名為MDC-1、MDA-1、8C-1、SH-1，所用天麻種子為漢中產(chǎn)區(qū)2021年5月收獲的新鮮紅桿天麻種子。

1.2 供試培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮） 200 g，葡糖糖20 g，蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀5 g，硫酸鎂3 g，瓊脂粉16 g，水1 000 mL，pH值自然。

水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂粉16 g，水1 000 mL，pH值自然。

1.3 試驗藥品

3，5-二硝基水楊酸、羧甲基纖維素鈉、酒石酸鉀鈉購自生工生物工程（上海）股份有限公司;木聚糖購自上海源葉生物科技有限公司;2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）購自Sigma公司;苯酚購自天津市大茂化學(xué)試劑廠;過硫酸鉀購自天津市天力化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均為分析純。

1.4 儀器與設(shè)備

單人超凈工作臺（ZHJH-C111213）購自蘇州凈化設(shè)備儀器有限公司;高壓滅菌鍋（LDZX-75KBS）購自上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;紫外分光光度計（UV2550）購自日本島津公司;超聲波清洗器（KQ5200DE）購自昆山市超聲儀器有限公司。

1.5 試驗時間與地點

耐高溫萌發(fā)菌遞增式馴化試驗于2019年6月至2021年4月進行，天麻種子萌發(fā)試驗于2021年6—8月進行，胞外酶活性測定試驗在2021年7月進行，以上試驗地點均在陜西省漢中市漢臺區(qū)東一環(huán)路陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心（陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院）。

1.6 試驗設(shè)計

1.6.1 耐高溫萌發(fā)菌遞增式馴化 本試驗參考馬慧穎等的遞進式循環(huán)耐高溫馴化方法[14-15]，略有改動，使萌發(fā)菌菌絲逐步適應(yīng)高溫環(huán)境，進行耐高溫馴化。將實驗室4 ℃保存的菌株從試管接至平板培養(yǎng)基，在24 ℃下暗培養(yǎng)10 d后轉(zhuǎn)板，再進行菌絲活化?；罨蟮木z進行耐高溫遞增式馴化，以24.0、26.0、28.0、30.0、30.5、31.0、31.5、32.0、32.5、33.0、33.5、34.0 ℃遞增梯度逐漸減緩的方式進行馴化，得到4株可以在34 ℃生存的耐高溫萌發(fā)菌。將馴化得到的耐高溫萌發(fā)菌與親本進行兩兩接觸試驗，觀察是否有拮抗現(xiàn)象。

1.6.2 胞外酶活性測定

1.6.2.1 粗酶液的制備 將馴化的耐高溫萌發(fā)菌與親本接在平板培養(yǎng)基上，模擬夏季高溫晝夜溫度，為防止未馴化萌發(fā)菌在34 ℃時發(fā)生燒菌死菌現(xiàn)象，且30 ℃為萌發(fā)菌的脅迫溫度[11]，因此培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為25 ℃與30 ℃各8 h循環(huán)，共22個循環(huán)，約 15 d。取菌絲下培養(yǎng)基1 g于研缽中，加5 mL去離子水，研磨1 min，吸取2 mL研磨液于2 mL離心管中，離心（8 000 r/min，3 min）得到上清液即為粗酶液。取上清液1 mL于10 mL試管中并定容至 10 mL，用于后續(xù)試驗。

1.6.2.2 胞外酶活性測定 依據(jù)文獻方法設(shè)置漆酶活性反應(yīng)體系[16-18]，略有調(diào)整：1 mL粗酶液加入 2 mL ABTS溶液，40 ℃水浴預(yù)熱反應(yīng)3 min，取出立即補足10 mL，用分光光度計記錄3 min內(nèi)421 nm處吸光度的變化。以沸水浴滅活的粗酶液為對照，做3組重復(fù)。1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 μmol底物定義為1個酶活單位，U。酶活性以X表示，U/L。

木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶活性用二硝基水楊酸（DNS）法測定[17]，略有調(diào)整。木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶活性DNS用量分別改為1、1、1.5 mL。1 min 生成1 μmoL木糖或葡萄糖所需要的酶量定義為1個酶活單位，U。酶活性以X表示，U/L。

1.6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 依據(jù)DNS法測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，為y=1.652 3x-0.033 6 （r2=0.991 8），用于淀粉酶及纖維素酶活性的測定，木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.246 2x-0.031 9 （r2=0.997 5），用于木聚糖酶活性的測定。

1.6.4 酶活性計算方法 木聚糖酶從木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的木糖含量折算成酶活單位（U/L），纖維素酶和淀粉酶從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的葡萄糖含量折算成酶活單位（U/L）[18]。

木聚糖酶、纖維素酶和淀粉酶活性：X=m·n/（M·V酶·t）;漆酶活性：X=106·V總·ΔD421 nm/（ε·V酶·Δt）。

式中：m指根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程代入D值計算對應(yīng)葡萄糖或木糖的質(zhì)量，mg;M指木糖或葡萄糖的摩爾質(zhì)量;V酶指反應(yīng)添加的酶液體積，L;V總指反應(yīng)總體積，L;t指酯反應(yīng)時間，min;n指酶液稀釋倍數(shù);ΔD421 nm為漆酶吸光度;Δt指時間，本試驗為3 min;ε為消光系數(shù)，36 000 L/（mol·cm）。

1.6.5 天麻種子萌發(fā)研究

1.6.5.1 天麻種子預(yù)處理 去除天麻蒴果殘留雜質(zhì)，流水沖洗后用濾紙吸干表面水分。后續(xù)操作在無菌操作臺進行，將天麻碩果置于0.1%氯化汞溶液中8 min，無菌水沖洗掉表面殘留氯化汞;再置于10%雙氧水中2 min，撈出無菌水沖洗掉表面殘留雙氧水;再將其放入75%乙醇中40 s，撈出無菌水沖洗掉表面殘留乙醇，用無菌濾紙吸干表面水分，將種子撒到滅菌的培養(yǎng)皿中，封好4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.5.2 天麻種子活力及萌發(fā)率的測定 10 mL試管依次加入天麻種子與配制的1%紅四氮唑溶液，混勻，放置于無光的30 ℃恒溫箱內(nèi)，48 h后用電子顯微鏡觀察天麻種子染色情況。種子被染成鮮紅色或粉紅色，則證明種子有活力;未被染成紅色，則證明種子無活力[19]。

取備用的天麻種子，用滅過菌的散粉刷蘸取適量天麻種子，輕輕抖落在水瓊脂培養(yǎng)基上，將馴化后的耐高溫萌發(fā)菌及親本萌發(fā)菌接種于水瓊脂培養(yǎng)基中央，每株菌做6組重復(fù)。將其置于25 ℃與30 ℃各8 h循環(huán)的恒溫箱中暗培養(yǎng)觀察，統(tǒng)計其萌發(fā)率。

1.6.6 數(shù)據(jù)處理 酶活性及天麻種子萌發(fā)率作圖及相關(guān)數(shù)據(jù)分析采用Excel 2010 軟件進行，用SPSS 26.0 的One-Way ANOVA進行相關(guān)數(shù)據(jù)方差分析，采用SPSS 26.0 的Pearson進行酶活性與天麻種子萌發(fā)率的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐高溫萌發(fā)菌馴化試驗

培養(yǎng)溫度為24 ℃時，萌發(fā)菌長勢旺盛，菌絲潔白，菌落形態(tài)規(guī)則，無色素產(chǎn)生。但是當(dāng)培養(yǎng)溫度超過 30 ℃ 時，萌發(fā)菌生長緩慢，菌絲偶有變黃、稀疏，菌落形狀不規(guī)則，并有少量色素產(chǎn)生。將馴化得到的耐高溫萌發(fā)菌與親本萌發(fā)菌在24 ℃下進行兩兩接觸試驗，結(jié)果如圖1所示，萌發(fā)菌進行耐高溫馴化后與親本進行兩兩接觸試驗皆出現(xiàn)了不同程度的拮抗線。

2.2 天麻種子萌發(fā)情況

2.2.1 天麻種子活力測定 用電子顯微鏡觀察染色天麻種子，可觀察到天麻種子4種不同的狀態(tài)：無種胚（圖2-A）;種胚被染成鮮紅色，種子有活力（圖2-B）;種胚被染成黃色，種子無活力（圖2-C）;異常胚無染色，無活力（圖2-D）。種子活力=（種子總數(shù)-無種胚種子數(shù)-種胚黃色種子數(shù)-異常胚種子數(shù)）/種子總數(shù)×100%。

試驗結(jié)果統(tǒng)計可得：天麻種子總數(shù)為936粒，種胚黃色的種子為7粒，無種胚的種子為21粒，異常胚的種子為4粒。天麻種子活力為96.58%。

2.2.2 天麻種子萌發(fā) 肉眼觀察到種胚膨大后，每隔5 d用電子解剖鏡觀察平板上天麻種子萌發(fā)情況，可觀察到天麻種子從種胚膨大到種子萌發(fā)的不同狀態(tài)：菌絲包裹浸染天麻種子（圖3-A）、種胚膨大尚未完全突破種皮（圖3-B）、種胚膨大突破種皮（圖3-C）、種胚生長即將形成分生原基（圖3-D）、種胚出現(xiàn)分生原基（圖3-E）、芽體形成（圖3-F）。本試驗將種胚出現(xiàn)分生原基即視為萌發(fā)，統(tǒng)計天麻種子萌發(fā)率。天麻種子萌發(fā)率=萌發(fā)天麻種子/（天麻種子總數(shù)×天麻種子活力）。

2.3 萌發(fā)菌胞外酶活性與天麻種子萌發(fā)

2.3.1 漆酶活性與天麻種子萌發(fā)關(guān)系 真菌漆酶屬于胞外酶，具有降解木質(zhì)素并為真菌生長發(fā)育提供營養(yǎng)的能力，測定漆酶活性的方法較多，目前ABTS法測定漆酶活性是一種較為理想的方法[20]。漆酶活性與天麻種子萌發(fā)率的皮爾曼相關(guān)系數(shù)為0.564，相關(guān)性不顯著（P=0.146>0.05）。由圖4可知，8株萌發(fā)菌均表現(xiàn)出不同程度的種子萌發(fā)率及漆酶活性。多重比較結(jié)果顯示，8株萌發(fā)菌的漆酶活性及對應(yīng)天麻種子萌發(fā)率均具有極顯著差異（P<0.01）。耐高溫萌發(fā)菌MDA-1、MDC-1、8C-1、SH-1的漆酶活性與其對應(yīng)的天麻種子萌發(fā)率均極顯著高于親本萌發(fā)菌，漆酶活性分別高150.00、38.89、555.56、555.56 U/L，萌發(fā)率分別高9.09、12.43、9.41、17.19百分點。其中，耐高溫萌發(fā)菌SH-1的漆酶活性和天麻種子萌發(fā)率最好，分別為1 000.00 U/L和71.76%，極顯著高于其余菌株的漆酶活性及天麻種子萌發(fā)率;耐高溫萌發(fā)菌MDA-1、MDC-1 與親本萌發(fā)菌MDA、MDC、8C的漆酶活性較小，依次為316.67、222.22、166.67、183.33、111.11 U/L，對應(yīng)天麻種子萌發(fā)率依次為68.82%、53.24%、59.73%、40.81%、40.19%。

2.3.2 木聚糖酶活性與天麻種子萌發(fā)關(guān)系 木聚糖廣泛存在于植物細胞壁中，就多糖而言其含量僅次于纖維素，是自然界最重要的半纖維素，廣義的木聚糖酶是指可以水解半纖維素木聚糖的一組酶的總稱[21]。木聚糖酶活性與天麻種子萌發(fā)率皮爾曼相關(guān)系數(shù)為0.720，相關(guān)性顯著（P=0.044<0.05）。由圖5可知，8株萌發(fā)菌的木聚糖酶活性各不相同，多重比較結(jié)果顯示各菌株之間的木聚糖酶活性具有極顯著差異，耐高溫萌發(fā)菌MDA-1、MDC-1、8C-1、SH-1木聚糖酶活性分別極顯著高于親本萌發(fā)菌450.91、131.67、114.89、275.96 U/L。其中，耐高溫萌發(fā)菌 MDA-1木聚糖酶活性最高 （1 062.35 U/L），極顯著高于其余菌株，對應(yīng)的天麻種子萌發(fā)率為68.82%;耐高溫萌發(fā)菌SH-1的木聚糖酶活性次之（905.43 U/L），對應(yīng)的天麻種子萌發(fā)率最高（71.76%）。

2.3.3 淀粉酶活性與天麻種子萌發(fā)關(guān)系 淀粉酶是一類可以作用于淀粉、多糖衍生物等并把它們分解成小分子的水解酶。淀粉酶活性與天麻種子萌發(fā)率皮爾曼相關(guān)系數(shù)為0.437，相關(guān)性不顯著（P=0.279>0.05）。由圖6可知，8株萌發(fā)菌均表現(xiàn)出不同程度的淀粉酶活性，除耐高溫萌發(fā)菌MDA-1與SH-1外，其余菌株多重比較兩兩之間均差異極顯著。耐高溫萌發(fā)菌MDA-1、MDC-1、8C-1、SH-1 的淀粉酶活性均極顯著高于親本萌發(fā)菌41.88、282.86、112.43、127.65 U/L。其中，耐高溫萌發(fā)菌MDC-1淀粉酶活性極顯著高于耐高溫萌發(fā)菌SH-1 146.24 U/L，萌發(fā)率極顯著比耐高溫萌發(fā)菌SH-1低18.52百分點。

2.3.4 纖維素酶活性與天麻種子萌發(fā)關(guān)系 纖維素是植物細胞壁的主要構(gòu)成成分，纖維素酶能夠有效降解植物細胞壁。纖維素酶活性與天麻種子萌發(fā)率皮爾曼相關(guān)系數(shù)為0.634，相關(guān)性不顯著（P=0.092>0.05）。由圖7可知，8株萌發(fā)菌均表現(xiàn)出不同程度的纖維素酶活性。親本萌發(fā)菌纖維素酶活性相差不大，MDA、MDC、SH之間未達到極顯著差異，耐高溫萌發(fā)菌的纖維素酶活性均極顯著高于親本萌發(fā)菌9.30、8.72、4.24、16.34 U/L。耐高溫萌發(fā)菌SH-1纖維素酶活性最高，為 40.91 U/L，萌發(fā)率為71.76%，極顯著高于其余菌株;耐高溫萌發(fā)菌MDA-1、MDC-1的纖維素酶活性次之，分別為34.26、33.65 U/L，萌發(fā)率為68.82%、53.24%。

3 結(jié)論

馴化后的耐高溫萌發(fā)菌與親本萌發(fā)菌兩兩接觸均出現(xiàn)拮抗線，可初步判斷耐高溫菌株與親本菌株存在差異。在平板上通過25 ℃與30 ℃各8 h循環(huán)，對約15 d之后獲得的胞外粗酶進行酶活性測定，相同培養(yǎng)條件下進行天麻種子萌發(fā)率測定，結(jié)果表明，各菌株之間的酶活性及菌株之間天麻種子萌發(fā)率存在明顯差異，經(jīng)過馴化的耐高溫萌發(fā)菌4種酶活性和天麻種子萌發(fā)率均顯著高于各自對應(yīng)親本萌發(fā)菌，4種酶活性與天麻種子萌發(fā)率相關(guān)性從高到低依次為木聚糖酶、纖維素酶、漆酶、淀粉酶。

天麻種子的萌發(fā)，需要萌發(fā)菌菌絲與種子接觸后，侵入皮層細胞壁促進天麻種子萌發(fā)形成原球莖，與天麻種子共生萌發(fā)。因此，萌發(fā)菌細胞壁降解酶的活性也就決定著天麻種子的萌發(fā)表現(xiàn)，其中植物細胞壁的重要組成部分為纖維素、半纖維素、果膠。萌發(fā)菌水解纖維素的纖維素酶活性最高的是耐高溫萌發(fā)菌SH-1，為40.91 U/L，其次是耐高溫萌發(fā)菌MDA-1，為34.26 U/L;水解半纖維素的木聚糖酶活性最高的為耐高溫萌發(fā)菌 MDA-1，為1 062.35 U/L，其次是耐高溫萌發(fā)菌SH-1，為905.43 U/L;分解淀粉的淀粉酶活性最高的是耐高溫萌發(fā)菌MDC-1，為402.90 U/L，其次是耐高溫萌發(fā)菌SH-1與MDA-1，分別為256.65、255.98 U/L;降解木質(zhì)素的漆酶活性最高的是耐高溫萌發(fā)菌 SH-1，為1 000.00 U/L。依據(jù)萌發(fā)菌的酶降解植物細胞壁的能力，簡單預(yù)測耐高溫萌發(fā)菌SH-1與MDA-1的天麻種子萌發(fā)率最好，用水瓊脂法進行天麻種子萌發(fā)率測定，其耐高溫萌發(fā)菌SH-1、MDA-1 萌發(fā)率最高，依次為 71.76%、68.82%。因此，結(jié)合前期酶活性試驗與天麻種子萌發(fā)率試驗結(jié)果進行分析，說明天麻種子萌發(fā)率并不由單一的1種胞外酶決定，天麻種子萌發(fā)受溫度、胞外酶種類及活性多種因素共同調(diào)控，且水解植物細胞壁的木聚糖酶及其活性是影響天麻種子萌發(fā)的關(guān)鍵胞外酶，在30 ℃的脅迫溫度條件下，經(jīng)過耐高溫馴化后的4株萌發(fā)菌均表現(xiàn)出更高的酶活性，促進天麻種子萌發(fā)，以期為天麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考。

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