體內(nèi)干擾Zfy 基因?qū)H精子發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

doi：10.6048/j.issn.1001-4330.2024.05.026

摘" 要：【目的】研究體內(nèi)干擾Zfy基因?qū)H睪丸、附睪組織中Zfy蛋白表達(dá)以及精子發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響。

【方法】選取健康種公驢，將一側(cè)睪丸注射空載體作為對照組，另一側(cè)睪丸注射Zfy干擾載體作為干擾組。采集睪丸、附睪組織，分別制作冰凍切片、固定液中固定及液氮中保存。使用冰凍切片觀察載體綠色熒光蛋白在組織中的表達(dá)情況。使用免疫組化和HE染色觀察干擾組和對照組Zfy蛋白表達(dá)情況。通過RT-qPCR檢測干擾Zfy基因?qū)ΣG丸、附睪中精子生成相關(guān)基因SYCP3、STRA8、TNP2、FAS表達(dá)水平的影響。

【結(jié)果】綠色熒光蛋白主要在驢曲細(xì)精管中的圓形精子細(xì)胞和部分長形精子細(xì)胞中表達(dá)，干擾載體成功轉(zhuǎn)入；干擾組驢睪丸Zfy蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)；干擾Zfy基因使驢睪丸中SYCP3基因表達(dá)量顯著下調(diào)、附睪中TNP2和FAS基因表達(dá)量顯著下調(diào)、而睪丸和附睪中STRA8基因表達(dá)量沒有明顯差異。

【結(jié)論】驢Zfy基因主要在驢圓形精子中表達(dá)，干擾Zfy基因可顯著抑制驢睪丸中Zfy蛋白表達(dá)、SYCP3基因表達(dá)和附睪中TNP2、FAS基因表達(dá)。

關(guān)鍵詞：驢；基因干擾；Zfy基因；免疫組化；圓形精子細(xì)胞

中圖分類號：S822""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號：1001-4330（2024）05-1277-07

收稿日期（Received）：

2023-09-30

基金項目：

新疆維吾爾自治區(qū)重點研發(fā)計劃項目“驢高效繁殖關(guān)鍵技術(shù)集成與示范”（2020B01002-2-1）；山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項目（SD2019XM008）;新疆維吾爾自治區(qū)科技重大專項“草食家畜高效繁殖技術(shù)研究與示范”

作者簡介：

李夢雨（1996-），女，新疆人，碩士研究生，研究方向為動物遺傳育種，（E-mail）1132629130@qq.com

通訊作者：

賈斌（1965-），男，新疆石河子人，教授，博士，碩士生/博士生導(dǎo)師，研究方向為分子遺傳與抗病育種，（E-mail）jiabin@shzu.edu.cn

0" 引 言

【研究意義】Zfy基因位于Y染色體的短臂（Yp11.3），包含11個外顯子和1個隨機重復(fù)區(qū)域。編碼的蛋白質(zhì)富含13個“鋅-指”結(jié)構(gòu)，并具有轉(zhuǎn)錄因子功能，成為Y染色體鏈接的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子（Y chromosome linked zinc-finger protein transcriptional factor），X染色體長臂（Xp21.3-Xp22.1）上有其等位基因Zfx［1］。最初，Zfy基因被認(rèn)為是睪丸決定因子（Testis Determining Factor，TDF）的候選基因，在雄性個體睪丸生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用［2］。性別決定由另一個存在與Y染色體上的SRY基因負(fù)責(zé)［3］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在Y染色體短臂缺失的小鼠模型中轉(zhuǎn)入Zfy基因能確保第二次減數(shù)分裂的發(fā)生［4］；Yasuhiro等［5-6］則發(fā)現(xiàn)，Y染色體Zfy2基因負(fù)責(zé)調(diào)控小鼠圓形精子細(xì)胞轉(zhuǎn)化為精子。Zfy基因在精子形成中具有重要作用，尤其是在減數(shù)分裂和Y精子形成時期。【本研究切入點】在小鼠、湖羊和豬的睪丸中，干擾Zfy基因能夠顯著偏移子一代的性別比例，以達(dá)到控制后代性別的目的［7-9］。需要通過基因調(diào)控探究干擾Zfy基因后對睪丸組織中Zfy蛋白表達(dá)以及精子發(fā)育相關(guān)基因的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過體內(nèi)注射Zfy基因干擾載體，觀察驢睪丸中Zfy蛋白表達(dá)情況，分析睪丸和附睪中精子生成相關(guān)基因SYCP3（聯(lián)會復(fù)合體蛋白3基因）、STRA8（視黃酸激活基因）、TNP2（過渡蛋白2基因）和FAS（Ⅰ型跨膜受體蛋白）的表達(dá)，為驢的性別控制研究提供理論支持。

1" 材料與方法

1.1" 材 料

1.1.1" 試驗動物

選取青河縣夢圓種植養(yǎng)殖合作社3歲健康種公驢。

1.1.2" 主要試劑及儀器

Anti-Zfy抗體（Abcam）、PV-6001二步法免疫組化檢測試劑盒、DAPI染液（中山金橋生物技術(shù)有限公司）、中性福爾馬林固定液（西隴科學(xué)技術(shù)有限公司）、蘇木精、伊紅（北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司）、石蠟切片機（型號為LM2235，德國萊卡）、體視顯微鏡、LightCycler 96 全自動熒光定量PCR儀（Roche）、倒置熒光顯微鏡（BIO-RAD DNA Engine）

1.2" 方 法

1.2.1" 干擾載體的構(gòu)建

試驗根據(jù)NCBI中公布的驢Zfy基因CDS區(qū)序列，設(shè)計并篩選shRNA干擾片段并命名為Y-1，shRNA寡核苷酸序列如下：Y-1-F：5'-TGGATACAGAGTTGGGTATTTTCAAGAGAAATACCCA ACTCTGTATCCTTTTTTC-3';Y-1-R：5'-TCGAGAAAAAAGGATACAGAGTTGGGTATTTCTCTT GAAAATACCCAACTCTGTATCCA-3'。將干擾序列連接到PLL3.7質(zhì)粒中，經(jīng)轉(zhuǎn)化后挑取單個菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)行測序鑒定，獲得含有目的片段的干擾載體。

1.2.2" 驢睪丸注射

采用單點注射法分別注射3 mg載體，左側(cè)睪丸注射空載體，右側(cè)睪丸注射Y-1干擾載體。間隔24 h注射第2次，第2次注射結(jié)束后24 h，采集新鮮睪丸組織及附睪組織分別置于-20℃冷凍用于制作冰凍切片、置于固定液固定用于HE染色和免疫組化，以及液氮中凍存用于提取總RNA。

1.2.3" 驢睪丸冰凍切片制作

采集試驗組、對照組的驢睪丸組織進(jìn)行OCT包埋，迅速在-20℃的冰凍切片機中切成18 μm的組織切片，貼附在粘附性載玻片上，立即用熒光顯微鏡觀察藍(lán)色DAPI和綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。

1.2.4" 驢睪丸組織HE染色和組織學(xué)特性測定

采集新鮮睪丸組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，在石蠟切片機上切成3.5 μm的連續(xù)切片，烘干后置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

HE染色：將組織切片進(jìn)行烤片、脫蠟完成后進(jìn)行蘇木精染色5 min，沖洗30 s，1%鹽酸酒精酸化1 s，自來水浸泡3 min返藍(lán)，沖洗30 s，伊紅染色3 min，沖洗30 s，脫色晾干并封片。

免疫組化：參照PV-6001二步法免疫組化檢測試劑盒進(jìn)行，將脫蠟完成的切片進(jìn)行水化和修復(fù)，使用0.5%過氧化氫室溫避光孵育10 min，PBS清洗，滴加稀釋倍數(shù)為1：200的一抗（Anti-Zfy兔多克隆抗體）50 μL，4℃過夜孵育，清洗后滴加二抗（酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物）50 μL室溫孵育30 min，清洗后DAB顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染后使用1%鹽酸酒精酸化，封片后置于顯微鏡下觀察。

1.2.5" 驢睪丸、附睪組織相關(guān)通路基因mRNA表達(dá)水平檢測

選擇FAS、STRA8、TNP2、SYCP3基因，設(shè)計實時熒光定量PCR引物，并送至上海生工合成。提取睪丸和附睪組織中的mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過熒光定量PCR 儀進(jìn)行RT-qPCR檢測，采用 2 - ΔΔCt方法計算基因表達(dá)的相對比值，比較干擾前后驢睪丸和附睪中精子生成相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平。

實時熒光定量PCR（RT-qPCR）引物如下：FAS-F（5'-3'）：GCCTGCTGTCAGTCATGTCCTC; FAS-R（5'-3'）：TGTGGCTTGTCTGTGTAGTCCTTC擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為125 bp，退火溫度為60℃；STRA8-F（5'-3'）：GCCTGCTGTCAGTCATGTCCTC; STRA8-R（5'-3'）： TGTGGCTTGTCTGTGTAGTCCTTC擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為80 bp，退火溫度為59℃；TNP2-F（5'-3'）：ATCACAGTCATACCACGCACTCC; TNP2-R（5'-3'）： CCTCTTCACCGCCTTCCTCTTG擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為122 bp，退火溫度為61℃；SYCP3-F（5'-3'）：GCGACTCTTGAAGGACCACG; SYCP3-R（5'-3'）：ACCTCCTCCTCTGAACCACTC擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為152 bp，退火溫度為55℃。

1.3" 數(shù)據(jù)處理

免疫組化結(jié)果使用ImagePro Plus 6.0 （Media Cybernetics，美國）統(tǒng)計分析載體Y-1組和空載體對照組的平均光密度值，檢測蛋白相對表達(dá)量差異，數(shù)值經(jīng)SPSS 20.0 獨立樣本T檢驗分析和GraphPad Prism 5.0作圖。統(tǒng)計結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。P＜0.05 表示顯著差異，P＜0.01 表示極顯著差異。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 驢Zfy基因干擾載體的構(gòu)建

研究表明，與插入片段結(jié)果一致，Zfy基因重組干擾載體構(gòu)建成功。

2.2" 驢睪丸轉(zhuǎn)染效果觀察

研究表明，注射的干擾載體成功進(jìn)入了驢睪丸曲細(xì)精管中，并表達(dá)出綠色熒光蛋白。綠色熒光顯示分布在圓形精子細(xì)胞和部分管腔中央的長形精子細(xì)胞中。圖1

2.3" 驢睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及Zfy蛋白的表達(dá)

研究表明，Zfy蛋白表達(dá)均位于細(xì)胞胞漿中，特異性抗體染色后為淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒，呈彌漫性分布。蛋白的表達(dá)沿著曲精細(xì)管管腔中央開始向周圍，顏色呈現(xiàn)有規(guī)律的先逐漸加深然后再逐漸變淺。靠近管腔正中心的長形精子和緊挨著的一圈圓形精子著色濃密較深，蛋白表達(dá)量較高。圖2

空載體組為平均光密度0.167±0.009，干擾載體注射組為0.133±0.004，差異極顯著（Plt;0.01）。圖3

2.4" 驢睪丸、附睪組織精子發(fā)育相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測

研究表明，驢睪丸組織干擾組與對照組相比，SYCP3基因表達(dá)量下降了74.95%，差異極顯著（Plt;0.01），STRA8、TNP2和FAS基因表達(dá)量均差異不顯著（Pgt;0.05）。附睪組織干擾組與對照組相比，TNP2和FAS基因表達(dá)量分別下降了59.12%和58.47%，差異極顯著（Plt;0.01）；SYCP3基因和STRA8基因表達(dá)量均差異不顯著（Pgt;0.05）。圖4～5

3" 討 論

3.1

試驗顯示，干擾載體成功轉(zhuǎn)染入睪丸曲精細(xì)管的生精細(xì)胞，攜帶的綠色熒光蛋白表達(dá)于生精細(xì)胞中，與Cheng等［10］研究相符，證明部分細(xì)胞器和物質(zhì)信息可以穿透血睪屏障以及胞質(zhì)橋。免疫組化結(jié)果分析表明，注射48 h后，驢睪丸組織的Zfy蛋白表達(dá)量顯著下降，這表明干擾載體成功抑制了Zfy蛋白的表達(dá)，這與Takizawa等［11］在小鼠睪丸中的RNA干擾試驗結(jié)果一致。研究還發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白可以調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程，與DNA結(jié)合，從而調(diào)控DNA上相關(guān)基因的表達(dá)。當(dāng)Zfy基因被沉默后，性別相關(guān)基因SYCP3的表達(dá)降低。

3.2

聯(lián)會復(fù)合蛋白3（SYCP3）編碼的蛋白組成一個高度延伸的四聚體結(jié)構(gòu)，通過其N端區(qū)域的棒狀結(jié)構(gòu)具有結(jié)合DNA的能力。在進(jìn)化中，SYCP3的一級結(jié)構(gòu)尤其是最后6個氨基酸表現(xiàn)出保守性［12-13］。體外分析表明，SYCP3與DNA結(jié)合和自主組裝驅(qū)動了減數(shù)分裂時期染色體的緊縮［14］。SYCP3主要在初級精母細(xì)胞中表達(dá)，并參與第1次減數(shù)分裂偶線期同源染色體配對過程中聯(lián)會復(fù)合物的形成。在雄鼠中，SYCP3的降解會導(dǎo)致SC結(jié)構(gòu)和聯(lián)會形成失敗，進(jìn)而使使得減數(shù)分裂時期細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致雄鼠完全不育。而在雌鼠中，這會導(dǎo)致高非整倍體率使胚胎發(fā)生宮內(nèi)死亡，從而導(dǎo)致生育能力降低［15-16］。對敲除SYCP3基因的純合雄性小鼠試驗表明，試驗鼠睪丸體積明顯變小，而且伴隨著大量生精細(xì)胞凋亡［17］。試驗中，通過干擾Zfy基因的轉(zhuǎn)錄后水平，成功地降低了睪丸組織中SYCP3基因的表達(dá)量，降低幅度為74.95%。SYCP3是同源染色體聯(lián)會配對成功的重要因素，由于其表達(dá)量下降或基因缺失會造成減數(shù)分裂的停滯。Zfy基因的沉默引起了Y精子上與聯(lián)會復(fù)合體相關(guān)基因mRNA的表達(dá)降低，致使精液中Y精子畸形率高。

3.3

李賢新等［18］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠TNP2基因的表達(dá)與小鼠精子發(fā)生過程有很強的一致性。TNP2在圓形精子中特異表達(dá)，其缺失可能導(dǎo)致精子頭部畸形，從而影響精子的獲能以及頂體與卵細(xì)胞的融合［19］。在精原細(xì)胞成熟期間，睪丸特異的生精細(xì)胞組蛋白變異逐步代替體細(xì)胞的組蛋白。而在精子變態(tài)早期，轉(zhuǎn)型蛋白TNP2又替代了生精細(xì)胞中的組蛋白［20］。附睪是精子成熟的重要場所。試驗中，干擾組附睪組織TNP2基因表達(dá)量下降了59.12%，由于

TNP2參與精子變態(tài)發(fā)育過程中轉(zhuǎn)型蛋白或魚精蛋白為主導(dǎo)的精子細(xì)胞核蛋白的轉(zhuǎn)換，TNP2基因的下調(diào)可能導(dǎo)致精子頭部畸形，從而影響頂體精子與卵細(xì)胞的結(jié)合、精子獲能以及在雌性生殖道的遷移。Kleene等［21］研究表明，F(xiàn)AS介導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)對生殖細(xì)胞凋亡具有重要作用。FAS屬于腫瘤壞死因子與神經(jīng)生長因子受體家族，與其天然受體FasL特異性結(jié)合能夠誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。該種Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)的“Ⅱ型”細(xì)胞凋亡途徑是哺乳動物睪丸生精細(xì)胞凋亡的一條主要途徑。試驗中，附睪組織中FAS表達(dá)量下降了58.47%，差異極顯著，干擾Zfy基因可能會造成Y精子的發(fā)育異常，進(jìn)而導(dǎo)致凋亡增加，但與預(yù)期相反，F(xiàn)AS基因的下調(diào)可能抑制了細(xì)胞凋亡。抗凋亡蛋白BCL-2能夠明顯抑制FasL/Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［22］。干擾Zfy基因?qū)е碌腇AS基因表達(dá)量下調(diào)的具體機制仍需深入研究。

4" 結(jié) 論

構(gòu)建的Zfy基因干擾載體能成功進(jìn)入到驢睪丸組織中，并顯著下調(diào)睪丸組織中Zfy蛋白的表達(dá)。體內(nèi)干擾Zfy基因使睪丸組織中SYCP3基因的表達(dá)量降低了74.95%，差異極顯著（Plt;0.01），并且導(dǎo)致附睪組織中TNP2和FAS基因的表達(dá)量分別下降了59.12%和58.47%，差異極顯著（Plt;0.01）。干擾后抑制了驢精子發(fā)育相關(guān)基因睪丸組織中SYCP3基因、附睪組織中TNP2和FAS基因的表達(dá)，引起精子的受精幾率產(chǎn)生差異。

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Effect of interfering donkey Zfy gene in vivo on expression of spermatogenesis related genes

LI Mengyu1， ZHANG" Zhidong2， LYU Yihang1， SUN Yujiang3， ZHENG Xinbao4，5， XIAO Haixia4，5， JIA Bin1

（1.College of Animal Science and Technology， Shihezi University， Shihezi Xinjiang 832003， China； 2. Ili Kazakh Aotonomous Prefecture Animal Husbandry Station， Yining Xinjiang 835100， China; 3.Qingdao Agricultural University， Qingdao Shandong 266169， China;4.Institute of Animal Science， Xinjiang Academy of Animal Sciences， Urumqi 830000， China; 5. Key Laboratory of Livestock and Poultry Resources （Sheep amp; Goat） Evaluation and Utilization， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Urumqi 830000， China）

Abstract：【Objective】 To explore the effect of interfering with the Zfy gene in vivo on the expression of Zfy protein in donkey testis and its epididymis tissues， as well as the expression of genes related to sperm development.

【Methods】"" Two healthy male donkeys were selected. An empty vector was injected into one testicle as the control group， and a Zfy interference vector was injected into the other testicle as the interference group. Testis and epididymis tissues were collected and processed into frozen sections， fixed in fixative solution， and stored in liquid nitrogen. The expression of green fluorescent protein in tissues was observed using frozen sections. The expression of Zfy protein in the interference and control groups was observed using immunohistochemistry. The impact of Zfy interference on the expression levels of sperm development-related genes SYCP3， STRA8， TNP2，" and FAS in the testis and epididymis was detected using RT-qPCR.

【Results】" The experimental results showed that the green fluorescent protein was mainly expressed in round sperm cells and part of long sperm cells in convoluted spermatic tubules， indicating the successful transfer of the interference vector. The expression level of Zfy protein in the interference group was significantly down-regulated， and interference with Zfy gene led to a significant decrease in SYCP3 gene expression in the testis and a significant decrease in TNP2 and FAS gene expression in the epididymis. However， there was no significant difference in the expression level of the STRA8 gene between the testis and epididymis.

【Conclusion】 The Zfy gene in donkeys is mainly expressed in round sperm cells. Interference with the Zfy gene significantly inhibits the expression of Zfy protein， SYCP3 gene in the testis， and TNP2 and FAS gene expression in the epididymis.

Key words：donkey;gene interference; Zfy gene;" immunohistochemistry; round sperm cell

Fund projects：Key R amp; D Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region： \"Integration and Demonstration of Key Technologies for Efficient Donkey Breeding\" （2020B01002-2-1）; 2019 Agricultural Major Application Technology Innovation Project of Shandong Province （SD2019XM008）; Major Science and Technology Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region \"Herbivorous Livestock Efficient Breeding Technology Research and Demonstration\"

Correspondence author：JIA Bin （1965-）， male， from Shihezi，Xinjiang，professor，Ph.D.，doctoral supervisor， research direction： molecular genetics and breeding for disease resistance， （E-mail）jiabin@shzu.edu.cn