基于非靶向代謝組學分析兩種酵母培養(yǎng)物的成分差異

doi：10.6048/j.issn.1001-4330.2024.05.020

摘" 要：【目的】比較兩種酵母培養(yǎng)物及其代謝成分的差異，為指導酵母培養(yǎng)物的生產(chǎn)及應(yīng)用提供參考。

【方法】材料為1種自研酵母培養(yǎng)物與達農(nóng)威益康 XP酵母培養(yǎng)物，利用非靶標代謝組學UHPLC-QTOF-MS技術(shù)，分析比較二者代謝產(chǎn)物成分及差異。

【結(jié)果】（1）在二級類別注釋下，正、負離子模式分別注釋到614、497個化合物，主要代謝類別為有機酸，核苷、核苷酸及其衍生物，氨基酸及其衍生物，兩種酵母培養(yǎng)物均無特有代謝成分，只在含量上有顯著（Plt;0.05）差異。（2）共237個差異代謝物在正離子模式檢出，176個顯著（Plt;0.05）上調(diào)表達，61個顯著（Plt;0.05）下調(diào)表達；136個差異代謝物在負離子模式檢出，64個顯著（Plt;0.05）上調(diào)表達，72個顯著（Plt;0.05）下調(diào)表達。（3）差異代謝物的 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析主要集中在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等代謝通路。

【結(jié)論】自研酵母培養(yǎng)物與達農(nóng)威益康XP的代謝產(chǎn)物含量存在顯著差異，但其發(fā)酵原料及工藝更簡便，并含有多種具藥理、生理作用的代謝成分，有潛在應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：酵母培養(yǎng)物；非靶標代謝組學；差異代謝物；釀酒酵母

中圖分類號：S188""" 文獻標志碼：A""" 文章編號：1001-4330（2024）05-1218-09

收稿日期（Received）：

2023-10-15

基金項目：

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金重點項目（2023D01D11）；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團重點領(lǐng)域科技攻關(guān)計劃（2022AB013）；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團重點領(lǐng)域科技攻關(guān)計劃（2020AB013）

作者簡介：

林青（1985-），女，山東煙臺人，副研究員，研究方向為微生物生態(tài)，（E-mail）qinglinxj@163.com

通訊作者：

婁愷（1968-），男，河南人，研究員，博士，碩士生導師，研究方向為微生物生態(tài)，（E-mail）loukai@tsinghua.org.cn

霍向東（1974-），男，甘肅人，副研究員，博士，研究方向為微生物資源，（E-mail）xiangdonghuo@163.com

0" 引 言

【研究意義】酵母培養(yǎng)物（Yeast Culture，YC ）是一種由酵母及其生長培養(yǎng)基組成的酵母發(fā)酵產(chǎn)物［1］，具有無毒無污染、營養(yǎng)物質(zhì)豐富、提高動物生產(chǎn)性能和免疫力等特點［2］。酵母培養(yǎng)物是一類非標產(chǎn)品，我國目前尚未出臺相關(guān)國家標準，因此市場現(xiàn)有產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊?！厩叭搜芯窟M展】潘韻等［3］研究了7種酵母培養(yǎng)物的成分和對仔豬的應(yīng)用效果，結(jié)果表明3個產(chǎn)品的質(zhì)量標準、風味和顏色及應(yīng)用效果顯著優(yōu)于其他產(chǎn)品，益康XP酵母培養(yǎng)物在奶牛泌乳［4］、母豬繁殖［5］、雞產(chǎn)蛋［6］、斷奶仔豬［7］和羔羊生長［8］性能等方面均有顯著效果。有研究將益康XP作為對照，進行酵母培養(yǎng)物的有效組分分析［9］?！颈狙芯壳腥朦c】酵母培養(yǎng)物成分復(fù)雜，除能檢測到的成分外，仍有許多“未知營養(yǎng)生長因子”在發(fā)揮作用［10］。而且，酵母培養(yǎng)物的成分和性能還因不同生產(chǎn)菌種、培養(yǎng)基成分和發(fā)酵工藝條件等因素產(chǎn)生巨大差異［11］，需進一步探究其作用機理的復(fù)雜性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】代謝組學是研究有機體及細胞內(nèi)各種低分子量代謝物組成和動態(tài)變化，反映機體生理代謝狀態(tài)，揭示在遺傳因素和環(huán)境變化影響下，代謝物發(fā)生的變化規(guī)律和相關(guān)反應(yīng)機制［12-14］。利用非靶標代謝組學技術(shù)比較差異代謝物，分析二者成分特點及優(yōu)勢代謝產(chǎn)物，為了解酵母培養(yǎng)物發(fā)酵特性及酵母培養(yǎng)物的生產(chǎn)與應(yīng)用提供參考。

1" 材料與方法

1.1" 材 料

菌種：菌株Saccharomyces cerevisiae來自新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應(yīng)用研究所。

原料：玉米粉、麩皮、豆粕、糖蜜、糖化酶（100 U/g）、淀粉酶（200 U/g）由新疆天康飼料科技有限公司生物添加劑分公司提供。達農(nóng)威益康 XP 酵母培養(yǎng)物購自達農(nóng)威生物發(fā)酵工程技術(shù)（深圳）有限公司。

試劑：甲醇、乙酸銨、乙腈、氨水（色譜純），吡啶、氯仿（色譜純），甲氧銨鹽（分析純），BSTFA（含 1% TMCS， v/v），L-2-氯苯丙氨酸（純度≥98%），標準品：L-2-氯苯丙氨酸，飽和脂肪酸甲酯（純度≥98%）。

儀器：氣相色譜（7890-B），色譜柱（DB-5MS），超高效液相色譜（1290-UHPLC），質(zhì)譜儀（PEGASUS HT），高分辨質(zhì)譜（Triple TOF-6600），超聲儀（YM-080S），離心機（Heraeus Fresco-17），烘箱（DHG-9023A），超低溫冰箱（Forma-900 series），分析天平（BSA-124S-CW），真空干燥儀（LNG-T98）研磨儀（JXFSTPRP-24）。

1.2" 方 法

1.2.1" 酵母培養(yǎng)物的制備

菌種活化：將凍干保藏的菌株Saccharomyces cerevisiae在PDA固體培養(yǎng)基活化，28℃培養(yǎng)48 h。

液體發(fā)酵：將活化好菌株接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基，200 r/min，28℃培養(yǎng)24 h，作為種子液按5%接種量接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基，200 r/min，28℃培養(yǎng)24 h。

固態(tài)發(fā)酵：調(diào)配玉米粉、麩皮、豆粕、糖蜜成碳氮比為1∶16固體發(fā)酵底物，將上述液體發(fā)酵物按20%接種量接入固體發(fā)酵底物，同時添加糖化酶100 U/g和淀粉酶200 U/g，充分混勻，30℃厭氧發(fā)酵3 d，50℃烘干后，液氮速凍 15 min，-80℃保存。將自研酵母培養(yǎng)物設(shè)置為A組，達農(nóng)威益康 XP 酵母培養(yǎng)物設(shè)置為B組，每組設(shè)置3個平行處理，采用 UHPLC-QTOF-MS技術(shù)，比較兩種酵母培養(yǎng)物的成分組成和代謝物差異。代謝物的提取及后續(xù)分析均委托上海阿趣生物科技有限公司完成。

參考魯曉宇等［15］方法配制，代謝物提取和色譜質(zhì)譜參數(shù)設(shè)定。

1.3" 數(shù)據(jù)處理

使用ProteoWizard 3.0軟件將原始數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換為mzXML。峰數(shù)據(jù)處理后，鑒定峰的物質(zhì)。使用 KEGG數(shù)據(jù)庫注釋鑒定到的代謝物。使用SIMCA 13.0軟件，對數(shù)據(jù)進行對數(shù)、中心化處理，進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法判別分析（partial least square discriminant analysis，PLS-DA），獲得代謝物的VIP 值。使用 SPSS 20.0 軟件統(tǒng)計分析， 計算各代謝物顯著性（P 值）和差異倍數(shù)（FC 值）。差異代謝物的篩選設(shè)定閾值為 VIPgt;1.0，P lt;0.01，F(xiàn)C（A/B）gt; 2 或lt; 0.5，MS2 scoregt;0.9。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 酵母培養(yǎng)物中代謝物成分差異比較

研究表明，在正離子和負離子模式下分別篩選出7 752和 6 709 個化合物，通過與數(shù)據(jù)庫匹配，分別注釋到4 940 和4 511 個化合物。正離子模式下，前614個化合物分類為30個二級類別，核苷、核苷酸及其衍生物（13%），有機酸（13%），氨基酸及其衍生物（10%），藥物（10%）等為占比10%以上的主要類別。負離子模式下，前497個化合物分類為30個二級類別，有機酸（15%），核苷、核苷酸及其衍生物（14%），氨基酸及其衍生物（10%）等為占比10%以上的主要類別。兩種酵母培養(yǎng)物代謝產(chǎn)物豐富，主要代謝類別為有機酸，核苷、核苷酸及其衍生物，氨基酸及其衍生物，在二級類別注釋下，兩種酵母培養(yǎng)物均無特有代謝物成分，代謝產(chǎn)物只在含量比例上有所差異。圖1

2.2" 兩種酵母培養(yǎng)物的PCA和PLS-DA分析

研究表明，從兩種酵母培養(yǎng)物的6個樣本中，共保留了14 461個有效峰。在正離子和負離子模式下，A組與B組組間分離明顯，組內(nèi)平行性好，2組樣本具有不同的代謝譜。PCA模型中，樣本均在95%置信區(qū)間，正離子、負離子模式下，前2個主成分的R2 X分別為0.566和0.627，模型對X變量解釋能力較好。圖2

R2 X、R2 Y是模型分別對 X、Y 矩陣的解釋率，Q2表示模型預(yù)測能力。樣本全部處于95%置信區(qū)間內(nèi)，兩種酵母培養(yǎng)物聚類分離效果非常顯著，劃分在左右兩個象限內(nèi)。正離子模型中，R2 X=0.746，R2 Y=1.000，Q2 =0.990，負離子模型中，R2 X=0.772，R2 Y=1.000，Q2 =0.992，兩個模型中3個參數(shù)數(shù)值均接近于1 ，模型的預(yù)測能力及擬合準確性較高。圖3

兩種離子模式下，原模型的R2Y值和Q2值接近1，建立模型可以反映樣本數(shù)據(jù)的真實情況，原模型解釋A、B組間差異較好。置換檢驗結(jié)果隨機模型Q2lt;原模型Q2，兩種離子模式下，Q2回歸線的截距分別為-0.33和-0.41，原模型穩(wěn)健性良好，無過擬合現(xiàn)象，具有統(tǒng)計學意義，兩種酵母培養(yǎng)物的代謝物存在顯著差異。圖4

2.3" 差異代謝物的篩選與鑒定

研究表明，正離子模式中，在兩種酵母培養(yǎng)物中共檢測到 237 種差異代謝物，有 176 種顯著上調(diào)表達，包括染料木素、甘氨酰-L-亮氨酸、大豆苷元等，有 61 種顯著下調(diào)表達，包括1-棕櫚酰甘油、三甲氧苯酰胺等；負離子模式中，檢測到 136 種差異代謝物，顯著上調(diào)表達的有 64 種，包括白楊素、甲苯賴氨酸氯甲基酮等，顯著下調(diào)表達的有72種，包括N6，N6，N6-三甲基-L-賴氨酸、硫酸雄甾酮等。兩種離子模式下，A組樣本共有240種代謝物顯著上調(diào)，B組樣本共有133種代謝物顯著上調(diào)。圖5

正負離子模式下，log FC值gt;4的代謝物共有14種，自研酵母培養(yǎng)物比達農(nóng)威酵母培養(yǎng)物中代謝產(chǎn)物相對含量高于16倍以上的成分，其中染料木素log FC最大值為6.10，在自研酵母培養(yǎng)物中的含量是達農(nóng)威酵母培養(yǎng)物的68.59倍。log FC值lt;-4的代謝物共有8種，達農(nóng)威酵母培養(yǎng)物比實驗組酵母培養(yǎng)物中代謝產(chǎn)物相對含量高于16倍以上的成分，其中N6，N6，N6-三甲基-L-賴氨酸log FC最大值為-9.75，在達農(nóng)威酵母培養(yǎng)物中的含量是自研酵母培養(yǎng)物的861.08倍。表1

2.4" 差異代謝物 KEGG 富集通路

研究表明，正離子模式中，兩組酵母培養(yǎng)物差異代謝物主要富集在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路，硫胺素代謝通路，生物素代謝通路，嘌呤代謝通路，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路等；負離子模式中，主要注釋和富集在半乳糖代謝通路，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路，乙醛酸和二羧酸代謝通路，檸檬酸循環(huán)，丙酮酸代謝通路，半胱氨酸和蛋氨酸代謝通路等。圖6

3" 討 論

3.1

采用多元變量統(tǒng)計分析方法，減少數(shù)據(jù)維度［16］。酵母培養(yǎng)物是成分復(fù)雜的發(fā)酵類產(chǎn)品［17］，采用高效液相色譜檢測益康XP酵母培養(yǎng)物含有上百種代謝產(chǎn)物，除檢測出的營養(yǎng)物質(zhì)外，還有許多未知成分［18］。經(jīng)非靶標代謝組學UHPLC-QTOF-MS分析，研究兩種酵母培養(yǎng)物在正、負離子模式下，篩選出7 752和 6 709 個化合物，極大挖掘了更多代謝產(chǎn)物的信息，通過與數(shù)據(jù)庫匹配，分別注釋到4 940 和4 511 個化合物，兩種酵母培養(yǎng)物進行了充分的發(fā)酵代謝，產(chǎn)生十分豐富的代謝產(chǎn)物，同時也包含大量未知代謝產(chǎn)物。其中，有機酸，核苷、核苷酸及其衍生物，氨基酸及其衍生物是占比較高的代謝物類別，這些豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，可刺激反芻動物瘤胃微生物生長，維持瘤胃厭氧環(huán)境，并提高發(fā)酵效率［19］。添加適量外源短鏈脂肪酸可改進瘤胃pH值和微生物種群，使有益微生物在瘤胃定植并加強瘤胃的發(fā)育，

參與瘤胃上皮細胞微生物屏障的構(gòu)建，使之免受病

原微生物的侵害［20］。動物自身合成的核苷酸無法滿足應(yīng)激反應(yīng)及快速生長的需要，酵母在各種微生物中所含核苷酸的比例最高，酵母培養(yǎng)物作為外源核苷酸的補充，可調(diào)節(jié)機體免疫力，促進幼齡動物生長［21］。此外，氨基酸可為反芻動物瘤胃中的乳酸利用菌提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進其增長繁殖，將過剩的乳酸轉(zhuǎn)為短鏈脂肪酸，以維持pH值穩(wěn)定的瘤胃環(huán)境［22］。

3.2

酵母培養(yǎng)物的代謝產(chǎn)物組成因不同生產(chǎn)商的菌種、培養(yǎng)基配方和發(fā)酵工藝等因素產(chǎn)生差異［23］，是一類非標產(chǎn)品。在二級類別注釋下，含量差異較大的代謝物可作為兩種酵母培養(yǎng)物的特征代謝物。A組比B組相對含量高出16倍以上的差異代謝物有14種，其中染料木素、大豆苷元、白楊素和秦皮素是具藥理作用的活性成分，有抗腫瘤、抗氧化、抑菌、調(diào)血脂、改善腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成等廣泛藥理活性［24-26］。同時，甘氨酸-L-亮氨酸可通過不同傳遞載體將靶向藥物傳遞到所需器官或組織，在液體介質(zhì)的生化過程中起重要作用［27］。此外，尿素可降低粗蛋白降解率，抑制有害菌群活動，提高牛羊消化率，增加反芻動物日增質(zhì)量，從而提高青貯飼料的品質(zhì)［28］。L-阿拉伯糖可調(diào)節(jié)血糖和血脂，改善代謝綜合征，作為腸道細菌的碳源，可刺激有益菌繁殖，抑制致病菌增長，影響腸道微生物群落穩(wěn)態(tài)及宿主健康［29］。另外，5-甲氧基色胺是合成褪黑激素的中間體，褪黑激素則具有節(jié)律平衡，改善睡眠、增強免疫力、清除自由基和延緩衰老等重要作用［30］。二氫辣椒素是激活瞬時受體電位香草型 1受體的激動劑，對心臟驟停后的缺血-再灌注腦損傷有保護作用［31］。1-甲基腺苷是甲基修飾的核苷酸，在生理條件下帶有一個正電荷，其帶來的電化學相互作用對于 tRNA 的功能和結(jié)構(gòu)有著至關(guān)重要的作用［32］。B組比A組相對含量高出16倍以上差異代謝物有8種，其中，脫氫的硫酸雄甾酮可增強先天免疫系統(tǒng)，與其他腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)調(diào)節(jié)對應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)［33］。此外，4-羥基肉桂酸在氧化代謝應(yīng)激條件下，能維持氧化還原穩(wěn)態(tài)和能量代謝，具有神經(jīng)保護作用［34］。而2-氧代己二酸是飼糧中必需氨基酸色氨酸和賴氨酸的關(guān)鍵代謝物，在尿液中的定量分析可反映氨基酸是否代謝異常而引發(fā)疾病［35］。另外，溶血磷脂酸是一種活躍的磷脂信號分子，可促進細胞增殖和分化，加強細胞間的相互作用，參與多種病理生理過程［36］。

3.3

天冬氨酸是合成甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的起始物質(zhì)［37］。當碳源為糖蜜時，酵母在無氧條件下將其分解成半乳糖和葡萄糖混合物，隨后優(yōu)先快速利用優(yōu)勢碳源葡萄糖，而半乳糖作為非常規(guī)碳源，其代謝受葡萄糖抑制［38］。硫胺素即維生素B1，其功能形態(tài)焦磷酸硫胺素在細胞代謝中的行使多種輔助功能，米糠、麩皮、大豆及青綠牧草等飼料中含量較多，酵母本身也富含硫胺素［39］。生物素（Biotin）又名維生素H，是生物體內(nèi)的一種輔酶，參與細胞多種代謝活動，可強烈促進酵母菌生長。玉米漿、麩皮水解液、甘蔗糖蜜等碳源原料都含有一定量的生物素，但不同生物素來源及其含量差異對微生物代謝有明顯影響［40］。酵母培養(yǎng)物的生產(chǎn)通常在液體培養(yǎng)基進行有氧擴繁，隨后在固態(tài)培養(yǎng)基進行厭氧發(fā)酵。糖代謝途徑需經(jīng)過中心物質(zhì)丙酮酸，有氧時，通過檸檬酸循環(huán)徹底氧化，厭氧時，最終形成乙醇和CO2［37］。在檸檬酸循環(huán)中涉及檸檬酸、ɑ-酮戊二酸、琥珀酸、富馬酸、L-蘋果酸和草酰乙酸多種代謝物質(zhì)，也是糖類、脂類、氨基酸代謝聯(lián)系的樞紐。其中四碳二羧酸琥珀酸、富馬酸、L-蘋果酸和草酰乙酸因具有相似的化學結(jié)構(gòu)可相互轉(zhuǎn)化［41］。此外，釀酒酵母存在明顯的Crabtree效應(yīng)，即使氧氣供應(yīng)充足，釀酒酵母仍然會積累乙醇，這對檸檬酸循環(huán)十分不利，且基礎(chǔ)碳源濃度越高，Crabtree效應(yīng)越強［42］。

4" 結(jié) 論

在二級類別注釋下，正、負離子模式分別注釋到614、497個化合物，共237個差異代謝物在正離子模式檢出，兩種酵母培養(yǎng)物因碳氮源、發(fā)酵條件等不同因素，代謝產(chǎn)物含量存在顯著差異。與達農(nóng)威益康XP相比，自研酵母培養(yǎng)物發(fā)酵原料及工藝更簡便。

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Analysis of the composition differences between two yeast cultures based on untargeted metabolomics

LIN Qing1， SHI Hongling1， QIN Xinzheng1， LI Yue1， WANG Zihan1， GAO Yan1， ZENG Jun1， WANG Haozhong2， LOU Kai1， HUO Xiangdong1

（1. Xinjiang Laboratory of Special Environmental Microbiology / Institute of Applied Microbiology， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi 830091， China;2.College of Life Science and Technology， Xinjiang University， Urumqi 830046， China ）

Abstract：【Objective】 This project aims to compare the metabolic components differences between the XP and experimental group yeast culture，the findings will provide a reference for guiding the production and application of yeast culture.

【Methods】 The untargeted metabolomics UHPLC-QTOF-MS technology was used to analyze and compare the composition and differences of the metabolic components between the 2 yeast cultures.

【Results】" （1） Under the super classification annotation， a total of 614 and 497 compounds were noted in positive and negative ion modes respectively.The main metabolic classes were organic acids， nucleosides， nucleotides and their derivatives， amino acids and their derivatives and so on.There were no specific metabolic components in the two yeast cultures， only significant differences in content （Plt;0.05）.（2） In the positive ion mode， 237 differential metabolites were detected， of which 176 were significantly up-regulated（Plt;0.05） and 61 were significantly down-regulated （Plt;0.05） in expression.In the negative ion mode， 136 differential metabolites were detected， of which 64 were significantly up-regulated （Plt;0.05） and 72 were significantly down-regulated （Plt;0.05） in expression.（3） The KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes） enrichment pathway of differential metabolites mainly focused on alanine， aspartate and glutamate metabolism.

【Conclusion】" Due to different carbon and nitrogen sources and fermentation conditions， the yeast cultures have significant differences in the content of metabolites， but with their own advantages of the biological activity of main differential metabolites.

Key words：yeast culture; untargeted metabolomics; differential metabolite; Saccharomyces cerevisiae

Fund projects：Key Program of Natural Science Foundation of" Xinjiang Uygur Autonomous Region （2023D01D11）;

Key program of scientific and technological research plan of Xinjiang production and construction corps（2022AB013）;Key program of scientific and technological research plan of Xinjiang production and construction corps（2020AB013）

Correspondence author： LOU Kai（1968-），male，from Henan， researcher， master tutor， Ph.D.，research direction： microbial ecology，（E-mail）@tsinghua.org.cn

HUO Xiangdong （1974-）， male， from Gansu， associate professor， Ph.D.， research direction：microbial resources，（E-mail） xiangdonghuo@163.com