一種復(fù)合菌對疲勞小鼠腸黏膜屏障的影響及其作用機制

摘要：目的：通過負重游泳實驗，觀察一種復(fù)合菌對小鼠的抗疲勞作用及其在疲勞狀態(tài)下對腸道粘膜屏障的影響，并初步探討其機制。方法：50只昆明小鼠（4～6周齡）隨機分為5組：空白組、疲勞模型組、嗜酸乳桿菌干預(yù)組、干酪乳桿菌干預(yù)組、復(fù)合菌干預(yù)組，每日進行灌胃、負重游泳。6 w后取小鼠眼球血及小腸組織，測定腸黏膜損傷程度相關(guān)指標(biāo)、細胞因子水平和蛋白水平的表達。研究期間每周測量1次小鼠體重。結(jié)果：研究結(jié)束時，各組小鼠體重均升高，各組間無顯著性差異（P＞0.05）；血清中腸黏膜物理屏障相關(guān)指標(biāo)DAO、D-LA水平以復(fù)合菌組最低，其次是干酪乳桿菌組，與空白組和疲勞模型組比較均有顯著性差異（P＜0.05或＜0.01），而Endotoxin水平各組間無顯著差異（P＞0.05）。血和小腸中炎性因子TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、MPO水平3個干預(yù)組與空白組和疲勞模型組相比均有顯著性差異（P＜0.05或＜0.01），而IL-6、IL-1β、sIgA水平與疲勞模型組相比無顯著性差異（P＞0.05）。小腸中蛋白水平MUC2、ZO-1、Occludin、Claudin-2的表達3個干預(yù)組和疲勞模型組相比較均有顯著性差異（P＜0.05或＜0.01）。結(jié)論：復(fù)合菌能顯著延長小鼠力竭游泳時間；嗜酸乳桿菌與干酪乳桿菌均在不同程度上抑制了血清及腸道細胞因子的釋放；促進了相應(yīng)蛋白水平的表達；初步認為復(fù)合菌通過增加對小鼠腸道屏障的保護作用發(fā)揮抗疲勞作用。

關(guān)鍵詞：疲勞；腸黏膜屏障；嗜酸乳桿菌；干酪乳桿菌；炎性因子腸道不僅是消化和營養(yǎng)吸收的重要器官，而且具有免疫調(diào)節(jié)、內(nèi)源性免疫功能和黏膜屏障功能，與身體健康密切相關(guān)。越來越多的實驗證據(jù)表明，疲勞會對不同器官造成損害，尤其是腸道，可誘導(dǎo)胃腸道炎癥[1]。過度疲勞可引起嚴重的原發(fā)性腸屏障功能障礙，促進細菌和內(nèi)毒素易位，引起全身炎癥反應(yīng)，對機體造成損害。據(jù)報道，腸道微生物群、黏膜屏障功能和免疫系統(tǒng)之間的相互作用在疲勞機制中發(fā)揮了作用[2]。因此，保護腸黏膜屏障功能是降低疲勞對機體損傷的重要環(huán)節(jié)。

益生菌是對胃腸道疾病具有廣泛治療潛力的活微生物，可以通過抑制病原體的黏膜黏附，改善上皮屏障功能，以及改變宿主的免疫活性，還可以調(diào)節(jié)腔內(nèi)發(fā)酵，穩(wěn)定腸道菌群，預(yù)防和緩解胃腸道功能紊亂[3]。此外，益生菌還可改善腸道運動障礙[4]。在動物模型中觀察到了其對腸屏障功能的增強作用。

乳酸菌（LAB）是一種重要的益生菌，作為微生物賦予宿主健康利益。乳酸菌對抗疲勞獨立作用的研究較少，但已被證明可以預(yù)防和減輕胃腸道紊亂，并使細胞因子水平正?；痆5]，這可能對疲勞人群有好處。因此，在前期研究基礎(chǔ)上[6]，本研究給予疲勞小鼠嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌干預(yù)，通過評價其腸黏膜屏障功能，血清和腸道中炎癥相關(guān)指標(biāo)和小腸緊密連接蛋白表達水平的變化，評估和比較獨立乳酸菌及復(fù)合菌對疲勞小鼠腸黏膜屏障的保護作用及其抗疲勞效果。

1材料與方法

1.1材料和試劑

嗜酸乳桿菌粉、干酪乳桿菌粉、復(fù)合菌粉，均由遼寧中世生物技術(shù)有限公司提供；腫瘤壞死因子-α（TNFα）、白細胞介素-1β （IL-1β）、白細胞介素-6 （IL-6）、白細胞介素-4 （IL-4）、白細胞介素-10 （IL-10）、黏蛋白-2 （MUC2）、緊密連接蛋白1 （ZO-1）、閉合蛋白（Occludin）、封閉蛋白-1 （Claudin-1）、封閉蛋白-2 （Claudin-2）、分泌型免疫球蛋白A（sIgA）、內(nèi)毒素（Endotoxin）、D-乳酸（D-LAC）、干擾素γ （IFN-γ）、髓過氧化物酶（MPO）、二胺氧化酶（DAO）、BCA蛋白檢測試劑盒，均購自南京建成有限公司。

1.2實驗動物分組及疲勞模型的建立

SPF級健康46 w齡雄性昆明小鼠[（38 ± 2） g]，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。所有小鼠在特定的無病原體條件下 （24～26°C，12/12 h 明暗交替的安靜環(huán)境，濕度50%～60%），自由采食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，將50只小鼠隨機分為5組，每組10只小鼠：空白組 （生理鹽水0.2 mL/d）、疲勞模型組（生理鹽水0.2 mL/d）、嗜酸乳桿菌干預(yù)組 （嗜酸乳桿菌1x10⁹ cfu）、干酪乳桿菌干預(yù)組 （干酪乳桿菌1×10⁹ cfu）、復(fù)合菌干預(yù)組 （嗜酸乳桿菌：干酪乳桿菌=1：1，1×10⁹ cfu），連續(xù)灌胃6 w，研究期間以普通飼料喂養(yǎng)。

除空白組外小鼠每日灌胃樣品30 min后負重游泳，將鼠尾部按小鼠體重5%負荷鉛放入同一水箱（水深不少于40 cm）中且互補接觸，游泳時間保證在120 s以上，并記錄游泳時間。力竭標(biāo)準(zhǔn)：小鼠協(xié)調(diào)動作消失，水淹沒鼻尖，身體下沉至再次浮出水面的時間超過10 s，并連續(xù)3次者，視為力竭。末次游泳后，靜息30 min后處死小鼠，采集眼球血、結(jié)腸、回腸組織進行相關(guān)指標(biāo)分析。所有動物實驗均按照國家《實驗動物護理和使用指南》進行。

1.3小鼠血清中腸黏膜屏障功能相關(guān)指標(biāo)測定

取凍存的血清上清液，按照小鼠 DAO、D-LAC ELISA 試劑盒產(chǎn)品說明書操作測定小鼠血清DAO、D-LAC含量。按照鱟試劑 （LAL）QCL 1000TM試劑盒說明書操作測定小鼠血清中內(nèi)毒素含量。

1.4小鼠小腸組織中4種緊密連接蛋白含量測定

取凍存的小腸組織上清液，運用BCA法測定小腸組織蛋白濃度，再根據(jù)ELISA檢測試劑盒說明檢測小鼠小腸組織中ZO-1、Occludin、Claudin-1、Claudin-2的含量。

1.5小鼠血清和腸道中炎癥相關(guān)指標(biāo)測定

取凍存的血清、小腸組織和腸黏液上清液，運用 BCA法測定小腸組織蛋白濃度，再根據(jù)小鼠ELISA 檢測試劑盒說明分別檢測血清、小腸組織和腸黏液上清液中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10、MPO、sIgA炎癥相關(guān)因子水平。

1.6統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)以X±SD 表示，采用Graphpad Prism 8.0.2統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。統(tǒng)計軟件進行單因素方差統(tǒng)計學(xué)分析和Tukey-Kramer多重比較檢驗，Plt;0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義的顯著性差異。

2結(jié)果與分析

2.1體重的變化情況

實驗開始時各組小鼠體重相當(dāng)，沒有顯著性差異（Pgt;0.05）。經(jīng)不同益生菌灌胃干預(yù)6 w后，各組小鼠的平均體重均逐漸增加，建模49 d后，空白組體重為（51.90±2.81）g，體重高于各游泳組體重值，模型組與各干預(yù)組之間體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）（表1） 。

2.2不同益生菌對小鼠力竭游泳時間的影響

如圖1所示，實驗期間，空白組作為不干擾組，不參與游泳。各治療組游泳時間呈波浪式增長，連續(xù)灌胃的前3周，各益生菌組較模型組相比力竭游泳時間無顯著性差異（Pgt;0.05）。當(dāng)灌胃5 w后，模型組與復(fù)合菌組間游泳時長存在極顯著性差異（Plt;0.01），而嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌組與模型組間無顯著性差異（Pgt;0.05）。灌胃6 w后，干酪乳桿菌和復(fù)合菌組與模型組相比存在極顯著性差異（Plt;0.01），嗜酸乳桿菌組游泳時間雖有所增加，但與模型組相比無差異（Pgt;0.05）。

2.3復(fù)合菌對疲勞小鼠腸黏膜屏障功能的影響

與空白組相比，力竭游泳6 w后，模型組小鼠血中DAO活性相比空白組升高 （Plt;0.05），說明長時間持續(xù)疲勞對小鼠腸黏膜屏障造成了損傷。在連續(xù)灌胃益生菌后，與模型組相比，小鼠血液DAO活性明顯低于模型組（Plt;0.01），其中，復(fù)合菌組效果最好，其次是干酪乳桿菌組，嗜酸乳桿菌組效果最弱，復(fù)合菌組與其余2組菌組比較存在顯著性差異（Plt;0.05）。游泳對照組小鼠與空白組相比，血清D-LA活性顯著升高 （Plt;0.01），灌胃益生菌各游泳組與游泳對照組相比，復(fù)合菌組D-LA活性顯著降低（Plt;0.01），干酪乳桿菌組D-LA含量雖有所降低，但無顯著性差異（Pgt;0.05），嗜酸乳桿菌組D-LA活性無顯著變化（Pgt;0.05） （圖2）。各組小鼠血清中內(nèi)毒素水平無顯著性差異（Pgt;0.05），說明益生菌對疲勞小鼠血中內(nèi)毒素水平?jīng)]有明顯的抑制作用（圖3）。

2.4復(fù)合菌對疲勞小鼠緊密連接蛋白的影響

模型組小鼠腸道各類蛋白含量與空白組相比存在極顯著性差異（Plt;0.01），表明疲勞可能使得小鼠腸道屏障受到損傷。灌胃各益生菌后與模型組相比小鼠腸ZO-1、Occludin和Claudin-2含量均有顯著性升高（Plt;0.05或Plt;0.01）；除嗜酸乳桿菌組外，其余2組益生菌組與模型組相比小鼠腸Claudin-1含量也均有顯著升高（Plt;0.01）（表2）。

2.5復(fù)合菌對疲勞小鼠血清炎性因子的影響

干預(yù)6 w后，模型組小鼠促炎因子TNF-α和IFN-γ水平顯著高于空白組（Plt;0.01），灌胃益生菌組小鼠血液中TNF-α和IFN-γ明顯降低，其中干酪乳桿菌組和復(fù)合菌組與模型組間存在極顯著差異（Plt;0.01）；而小鼠血清促炎細胞因子IL-1β和IL-6水平與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）（表3）。與空白組相比，抗炎因子IL-10和IL-4的含量均顯著下降（Plt;0.05），而益生菌組都有所升高（Plt;0.05），復(fù)合菌組與模型組相比存在極顯著差異（Plt;0.01）。這些作用與炎性因子作為炎癥介質(zhì)的作用導(dǎo)致的促炎因子下調(diào)和抗炎因子上調(diào)相一致[7]。

2.6復(fù)合菌對疲勞小鼠腸道免疫因子的影響

較空白組，疲勞使模型組小鼠腸黏膜sIgA的分泌量顯著降低，隨著益生菌的灌胃其分泌量有所上升，模型組與其余游泳組間無顯著性差異（Pgt;0.05）。說明疲勞后益生菌對小鼠腸黏膜sIgA分泌沒有明顯促進作用。模型組小鼠腸黏膜MPO活力水平較空白組明顯升高（Plt;0.05），灌胃益生菌后小鼠腸黏膜MPO活力水平明顯低于模型組（Plt;0.01），其中復(fù)合菌組水平最低。說明益生菌強化腸內(nèi)營養(yǎng)可以明顯抑制疲勞引起的腸黏膜中性粒細胞活化，降低腸黏膜炎癥浸潤情況（圖4）。

3討論

疲勞的生理狀態(tài)，包括特發(fā)性疲勞、慢性疲勞綜合征和不明確的疲勞，對機體都有不利影響，包括社會心理、身體、情感方面，并對健康相關(guān)的生活質(zhì)量產(chǎn)生負面影響。有研究表明，益生菌可以促進能量收集，并具有促進健康、提高性能和抗疲勞的作用[8]。本研究通過對干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和復(fù)合菌進行了初步的探索探究，證實了復(fù)合菌對腸黏膜屏障的保護作用和由此產(chǎn)生的抗疲勞效果，進一步對保護腸屏障機制進行了探討。本研究疲勞小鼠模型的結(jié)果顯示，無論是灌胃生理鹽水還是不同益生菌，小鼠體重和游泳時間都有不同程度的升高，而體重的變化和運動耐力是機體疲勞的最直接和最客觀的證據(jù)，說明益生菌對疲勞恢復(fù)具有一定促進作用。

疲勞中眾多因素的存在可能導(dǎo)致腸黏膜屏障的損傷[9]，從而造成多種腸道及全身性疾病。血液中內(nèi)毒素水平是衡量腸黏膜屏障功能的重要指標(biāo)，當(dāng)腸黏膜屏障受損時，腸源性內(nèi)毒素通過受損的腸黏膜屏障進入血液[10]。而實驗結(jié)果顯示，實驗各組間內(nèi)毒素水平?jīng)]有顯著差異，說明力竭游泳實驗后產(chǎn)生的疲勞反應(yīng)對昆明小鼠腸黏膜屏障功能沒有影響。血清D-乳酸水平和DAO活性水平被認為是腸通透性的敏感生物標(biāo)記物，用來檢測腸損傷程度[11]，本研究中復(fù)合菌的添加對疲勞小鼠血清中DAO和D-LA活力的上升表現(xiàn)出明顯的抑制作用。Deng等[12]研究結(jié)果也表明，益生菌（干酪乳桿菌）能夠明顯降低雞腸道DAO、D-LA的分泌。說明益生菌的施用改善了腸道通透性，保護了腸黏膜屏障功能。

此外，益生菌對腸道通透性的有益作用還可能與改善腸道緊密連接蛋白的表達有關(guān)，緊密連接蛋白是構(gòu)成腸黏膜物理屏障的最基本組成，其作為持續(xù)的細胞間屏障，防止腸道細菌、抗原和腔內(nèi)毒素從腔內(nèi)轉(zhuǎn)移到上皮下組織以及體循環(huán)，在維持腸道化學(xué)屏障的完整性中發(fā)揮著重要作用。實驗結(jié)果顯示，益生菌抑制了疲勞小鼠Occludin、Claudin-1、Claudin-2、ZO-1蛋白表達，復(fù)合菌表達效果最好。本研究結(jié)果與Wang等[13]的研究一致，提示復(fù)合菌能有效緩解疲勞引起的腸道屏障功能障礙，降低腸道通透性。

腸上皮細胞物理屏障的損傷會激活細胞內(nèi)一系列的免疫反應(yīng)，疲勞的自身抗體會觸發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致大量炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放。本研究結(jié)果顯示，長期力竭游泳后小鼠模型組血清促炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β、INF-γ水平都有所升高；在持續(xù)灌胃益生菌后，小鼠血清IL-6、IL-1β與模型組無顯著差異；而TNFα 和IFN-γ的含量明顯降低，復(fù)合菌效果最顯著，表明復(fù)合菌強化腸內(nèi)營養(yǎng)可以明顯抑制腸黏膜 TNFα 和IFN-γ的表達，從而改善疲勞。小鼠血清抗炎性因子IL-10、IL-4都有所降低，持續(xù)灌胃益生菌后嗜酸乳桿菌效果不明顯，而干酪乳桿菌和復(fù)合菌組抗炎因子含量有所回升，說明復(fù)合菌強化腸內(nèi)營養(yǎng)可以明顯促進腸黏膜IL-10、IL-4的表達。研究表明復(fù)合菌對疲勞后腸道炎癥反應(yīng)的抑制作用通過其對疲勞后小鼠血清中促炎性因子TNF-α 和IFN-γ水平的降低和促進抗炎因子IL-10、IL-4的升高得到進一步的證實。這與Montoya等[14]的報告研究相一致。結(jié)果中益生菌強化腸內(nèi)營養(yǎng)對疲勞引起的腸黏膜MPO活力的上升表現(xiàn)出明顯抑制作用。但對腸黏膜sIgA分泌量的降低沒有顯著的改善，sIgA是一種分泌到小腸腔內(nèi)的免疫分子，可以通過黏附細菌、病毒等大分子有害物質(zhì)使其失活，保護腸上皮細胞免受腸毒素和病原微生物侵害[15]，說明益生菌可以抑制中性粒細胞活性，降低炎性因子的釋放，主要通過細胞免疫途徑[16]，降低疲勞后腸黏膜炎癥反應(yīng)，一定程度上改善腸黏膜免疫屏障功能。

4結(jié)論

綜上，本試驗將3種灌胃益生菌：嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、復(fù)合菌進行對比探究顯示，初步證實了復(fù)合菌能夠明顯減緩由疲勞引起的腸黏膜屏障損傷，降低炎癥反應(yīng)，從而起到保護腸道黏膜屏障功能和抗疲勞的作用。這項研究的結(jié)果為疲勞人群進行益生菌干預(yù)的進一步研究、開發(fā)天然產(chǎn)物預(yù)防和治療疲勞相關(guān)腸道疾病提供了科學(xué)依據(jù)，但其相關(guān)機制還有待進一步探討。參考文獻

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Effects of A Compound Bacterium on Intestinal Mucosal

Barrier in Fatigue Mice and Its MechanismLIU Xin-qi1，2，CHEN Qian-ru1，2，PARK Mei-zi1，2，XU Qing3 ，GAO Qian1，2，LIU Ying-hua3

（1College of Food Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China;

2Qingdao Special Food Research Institute，Qingdao 266109，China;

3Department of Nutrition，F(xiàn)irst Medical Center，PLA General Hospital，Beijing 100853，China）Abstract：ObjectiveTo observe the anti-fatigue effect of a compound bacteria on mice and its effect on intestinal mucosal barrier under fatigue state through weight-bearing swimming experiment，and to preliminarily explore its mechanism.MethodTotally 50 Kunming mice （4—6 weeks of age） were randomly divided into 5 groups including blank group，fatigue model group，Lactobacillus acidophilus intervention group，Lactobacillus casei intervention group and compound bacteria intervention group.After 6 w，the blood of the eye and small intestine of the mice were collected，and the expressions of cytokines and proteins in intestinal mucosal injury degree were determined.The mice were weighed weekly during the study.ResultAt the end of the study，the body weight of mice in all groups increased，but there was no significant difference among the groups （P＞0.05）.The DAO and D-La levels of serum physical barrier related indexes of midgut mucosa were the lowest in the compound bacteria group，followed by Lactobacillus casei group，compared with blank group and fatigue model group （P＜0.05 or＜0.01），but there was no significant difference in Endotoxin levels among groups（P＞0.05）.The levels of inflammatory factors TNF-α，IFN-γ，IL-4，IL-10 and MPO in blood and small intestine of the intervention group were significantly different from those of the blank group and the fatigue model group （P＜0.05 or＜0.01），while there were no significant differences in IL-6，IL-1β and sIgA levels between fatigue model group and fatigue model group （P＞0.05）.The expression of MUC2，ZO-1，Occludin and Claudin-2 protein levels in small intestine in the three intervention groups were significantly different from that in the fatigue model （P＜0.05 or＜0.01）.ConclusionCompound bacteria can significantly prolong the exhaustive swimming time of mice.Both Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei inhibited the release of serum and intestinal cytokines to varying degrees.It promoted the expression of corresponding protein level.It is preliminarily concluded that compound bacteria play an anti-fatigue effect by increasing the protective effect of intestinal barrier in mice.

Keywords：fatigue;intestinal mucosal barrier;Lactobacillus acidophilus; Lactobacillus casei; inflammatory cytokines