芹菜素對(duì)二肽基肽酶IV的抑制作用及其機(jī)制

摘要：目的：探究芹菜素降血糖作用的機(jī)制。方法：考察不同濃度的芹菜素對(duì)糖尿病治療靶點(diǎn)二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase-4，DPP-4）的抑制活性，并進(jìn)一步利用酶動(dòng)力學(xué)、熒光光譜、分子對(duì)接等實(shí)驗(yàn)手段明確了芹菜素對(duì)DPP-4的抑制類型以及作用機(jī)制。結(jié)果：芹菜素對(duì)DPP-4具有可逆的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，其半數(shù)抑制濃度為（62.45±1.22）μg/mL；芹菜素主要通過(guò)氫鍵和范德華力作用與DPP-4形成基態(tài)復(fù)合物，造成DPP-4內(nèi)在熒光的猝滅；芹菜素可與DPP-4分子中VAL-207、ARG-358、TYR-662殘基形成較強(qiáng)的氫鍵，并與周圍眾多的疏水殘基存在疏水作用，共同維持該復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。結(jié)論：本試驗(yàn)結(jié)果可為芹菜及芹菜素類降血糖產(chǎn)品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：芹菜素；二肽基肽酶IV；抑制；互作；分子對(duì)接二肽基肽酶IV（DPP-4）是哺乳動(dòng)物的一種重要絲氨酸水解酶，可分解胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）和葡萄糖依賴性促胰島素肽（GIP）等腸促胰島素，從而阻斷其對(duì)胰島素分泌的促進(jìn)作用，因此被認(rèn)為是治療2型糖尿病的重要靶點(diǎn)[1-2]。芹菜素是人類日常飲食中重要的類黃酮之一，廣泛存在于多種水果、蔬菜以及茶葉中，其中尤以芹菜中含量較高，是芹菜中最主要的生物活性成分之一[3-6]。研究表明，芹菜素具有明顯的降血糖作用[7]。劉俊法[8]對(duì)糖尿病大鼠連續(xù)4 w進(jìn)行芹菜素腹腔注射給藥治療，發(fā)現(xiàn)可顯著降低糖尿病大鼠血糖水平。Mao等[9]研究表明，糖尿病大鼠在連續(xù)給藥3 w后，40 mg/kg芹菜素治療組血糖可較對(duì)照組降低50%以上。芹菜素可減輕高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠的胰島素抵抗（IR）[10-11]、改善葡萄糖耐量減低（IGT）[11-12]、保護(hù)胰島β細(xì)胞免受氧化損傷[13-14]、抑制α-葡萄糖苷酶活性[15-16]，從而起到調(diào)節(jié)血糖作用。Kalivarathan 等[17-18]對(duì)高脂高糖飲食大鼠進(jìn)行芹菜素腹腔注射給藥處理，發(fā)現(xiàn)芹菜素處理組大鼠血漿及海馬組織中DPP-4的活性均顯著低于對(duì)照組，而血漿GLP-1水平顯著提高，提示DPP-4活性可能得到抑制。本研究通過(guò)體外試驗(yàn)方法結(jié)合分子模擬，明確芹菜素對(duì)DPP-4的抑制作用及其分子機(jī)制，以進(jìn)一步闡釋芹菜素降血糖作用的機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料與試劑

芹菜素（純度≥98%）;Tris-HCl（pH 8.0，1.0 mol/L），北京索萊寶科技有限公司；二肽基肽酶IV（人，EC 3.4.14.5）、Gly-Pro-7-amido-4-甲基香豆素氫溴酸鹽（Gly-Pro-AMC）、二甲基亞砜（DMSO），美國(guó)Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

SpectraMax i3X酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices；F7000熒光分光光度計(jì)，日本Hitachi。

1.3方法

1.3.1芹菜素對(duì)DPP-4的抑制能力芹菜素對(duì)DPP-4的抑制評(píng)價(jià)方法參考Proenca等[19]的方法，并稍加修改。先用50 mmol/L的緩沖液配置濃度為1.73 mU/mL的DPP-4溶液和濃度為200 mmol/L的底物Gly-Pro-AMC溶液。準(zhǔn)確移取24 μL的DPP-4溶液，分別加入26 μL的待測(cè)樣品溶液，在37℃反應(yīng)15 min后，再加入50 μL的Gly-Pro-AMC溶液。放置37℃下反應(yīng)15 min后，酶標(biāo)儀在λex=360 nm、λem=460 nm下進(jìn)行熒光測(cè)定?？瞻捉M為不加樣品溶液，樣品空白組為不加酶，每次試驗(yàn)3次重復(fù)。芹菜素對(duì)DPP-4抑制率按式（1）計(jì)算。

1.3.2芹菜素對(duì)DPP-4的抑制類型判斷根據(jù)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)判斷抑制類型，具體方法參照Morikawa等[20]的方法。選擇不同濃度的芹菜素（0、50、100 μg/mL），首先固定Gly-Pro-AMC（最終濃度100 μmol/L），通過(guò)改變酶的濃度（0.21、0.42、0.63、0.84 mU/mL），以酶反應(yīng)速率為縱坐標(biāo)，酶濃度為橫坐標(biāo)判斷反應(yīng)是否可逆。然后再固定酶濃度，設(shè)定底物Gly-Pro-AMC濃度（50、100、150、200 μmol/L）繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線，從而確定抑制類型，計(jì)算公式為式（2）：

1.3.3熒光光譜測(cè)定在298K和310K溫度下，分別測(cè)定DPP-4的發(fā)射光譜，隨后加入不同濃度的芹菜素，保持終濃度為0～28 μg/mL，濃度間隔為4 μg/mL，混合并靜置3 min后進(jìn)行樣品測(cè)量。激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為290～400 nm，狹縫寬度為5 nm，掃描速度為1 200 nm/min。利用Stern-Vlomer方程判斷芹菜素對(duì)DPP-4的猝滅機(jī)理[21]，公式如式（3）：

1.3.4分子對(duì)接通過(guò)Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)下載Apigenin化合物（520-36-5）數(shù)據(jù)的sdf格式，通過(guò)Chem3D中的MM2模塊對(duì)所下載的化合物進(jìn)行幾何優(yōu)化以及能量最小化，并轉(zhuǎn)化為pdb格式，將小分子化合物導(dǎo)入AutoDock Tools-1.5.6軟件刪除水分子并添加原子電荷、分配原子類型，將所有柔性鍵默認(rèn)可旋轉(zhuǎn)，最后保存為pdbqt文件。從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載二肽基肽酶IV的晶體結(jié)構(gòu)PDB格式文件，采用Pymol 2.1軟件刪除蛋白分子中的無(wú)關(guān)小分子后，將蛋白分子導(dǎo)入AutoDock Tools-1.5.6軟件刪除水分子、添加氫原子以及設(shè)置原子類型，最后保存為pdbqt文件。將處理后的Apigenin化合物作為小分子配體，DPP4蛋白靶點(diǎn)作為受體，根據(jù)小分子與靶點(diǎn)的作用位點(diǎn)確定的Grid Box的中心位置（x=40.85，y=51.23，z=35.57）以及長(zhǎng)寬高（50×50×50），最后通過(guò)AutoDock 進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，化合物與蛋白的結(jié)合模式可視化采用Pymol 2.1軟件。

1.3.5數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)分析使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，不同質(zhì)量濃度測(cè)量3次，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，統(tǒng)計(jì)顯著性差異由P＜0.05判斷。

2結(jié)果與分析

2.1芹菜素對(duì)DPP-4的抑制效果

如圖1所示，隨著質(zhì)量濃度的增加，對(duì)DPP-4的抑制效果逐漸增強(qiáng)，呈濃度依賴性抑制，表現(xiàn)出了很好的DPP-4抑制能力，通過(guò)曲線擬合計(jì)算可以確定出其半數(shù)抑制濃度（IC₅₀）值為（62.45±1.22）μg/mL。

2.2芹菜素對(duì)DPP-4的抑制類型

由圖2（A）可知，不同質(zhì)量濃度下的直線都過(guò)原點(diǎn)，并且隨之濃度的增加，斜率逐漸降低，說(shuō)明芹菜素能可逆性地抑制DPP-4的活性[23]。進(jìn)一步采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖法確定出芹菜素對(duì)DPP-4的抑制類型。由圖2（B）可知，不同濃度下芹菜素對(duì)DPP-4的抑制動(dòng)力曲線交于X軸，根據(jù)式（2），表現(xiàn)為隨著芹菜素濃度的增加，最大反應(yīng)速率V_max依次減少，米氏常數(shù)K_m保持不變，因此芹菜素對(duì)DPP-4的抑制類型為典型的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

2.3芹菜素對(duì)DPP-4的熒光淬滅效應(yīng)

熒光光譜是研究小分子和蛋白質(zhì)作用的常見方法，可以確定其相互作用的方式、作用力等[24]。DPP-4中含有色氨酸和酪氨酸殘基，在一定激發(fā)波長(zhǎng)下，可以發(fā)生較強(qiáng)的熒光。由圖3可以看出，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)在280 nm時(shí)，DPP-4的最大發(fā)射波長(zhǎng)為332 nm。隨著芹菜素質(zhì)量濃度的增加，DPP-4的熒光強(qiáng)度呈規(guī)律性下降，說(shuō)明芹菜素與DPP-4酶之間存在相互作用。隨著芹菜素濃度的增加，發(fā)射峰發(fā)生藍(lán)移現(xiàn)象（332～328 nm），表明此時(shí)DPP-4發(fā)色基團(tuán)周圍的微環(huán)境發(fā)生了變化，芹菜素與DPP-4之間存在著相互作用，向疏水的環(huán)境中轉(zhuǎn)變[25]。

采用Stern-Volmer方程分析不同溫度下的熒光數(shù)據(jù)，從圖4（A）可以看出，芹菜素對(duì)DPP-4的Stern-Volmer曲線具有良好的線性，說(shuō)明其猝滅過(guò)程為單一的動(dòng)態(tài)或者靜態(tài)。隨著溫度的升高，其K_sv值降低，并且K_q遠(yuǎn)大于生物大分子最大散射碰撞猝滅常數(shù)2×10¹⁰L/（mol·s）。結(jié)果表明，芹菜素對(duì)DPP-4的猝滅過(guò)程為靜態(tài)猝滅。通過(guò)靜態(tài)猝滅公式，得到芹菜素對(duì)DPP-4的雙對(duì)數(shù)曲線圖，如圖4（B）。根據(jù)直線的斜率和截距計(jì)算出K_b和n值。由附表中芹菜素對(duì)應(yīng)的K_b值都隨之溫度的升高而降低，說(shuō)明抑制劑-酶復(fù)合物的穩(wěn)定性隨著溫度的升高而降低。另外，不同溫度下的n值接近于1，表明芹菜素與DPP-4只存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

通過(guò)公式計(jì)算出焓變?chǔ)、熵變?chǔ)、吉布斯自由能ΔG的變化，進(jìn)而判斷出芹菜素對(duì)DPP-4的相互作用力。當(dāng)ΔH＞0且ΔS＞0時(shí)，主要作用力為疏水作用力；當(dāng)ΔH＜0且ΔS＞0時(shí)，作用力為靜電相互作用；當(dāng)ΔH＜0且ΔS＜0時(shí)，主要作用力為范德華力和氫鍵。由附表可見，吉布斯自由能ΔG均為負(fù)值，說(shuō)明芹菜素與DPP-4的結(jié)合是自發(fā)進(jìn)行的，且ΔH、ΔS均為負(fù)值，表明芹菜素與DPP-4的結(jié)合主要為氫鍵和范德華力[26]。

2.4分子對(duì)接

分子模擬對(duì)接是研究小分子和蛋白質(zhì)作用的重要工具，可以確定二者的結(jié)合位點(diǎn)[27]。芹菜素與DPP4靶點(diǎn)蛋白的分子對(duì)接結(jié)果表明，芹菜素與DPP4存在很好的結(jié)合作用且匹配度高（結(jié)合能小于-5 kcal/mol）。將對(duì)接后芹菜素與DPP-4形成的復(fù)合物利用Pymol 2.1軟件進(jìn)行可視化，得到芹菜素與DPP-4的結(jié)合模式，根據(jù)結(jié)合模式可以很清晰地看到芹菜素與DPP-4口袋的相結(jié)合的氨基酸殘基。如圖5所示，芹菜素與DPP4結(jié)合位點(diǎn)存在相互作用的氨基酸有ARG-358、PHE-357、TYR-666、TYR-547、TYR-662、ASN-710、GLU-206、SER-209、VAL-207等。芹菜素屬于黃酮類化合物，具有一定的疏水性，能夠與PHE-357、TYR-666、TYR-547、TYR-662、VAL-207氨基酸形成很強(qiáng)的疏水相互作用，特別是PHE-357、TYR-547氨基酸的苯環(huán)部分與該化合物形成很強(qiáng)的π-π共軛相互作用，對(duì)錨定蛋白口袋中的小分子有著重要作用；另外，該化合物的酚羥基還能夠與VAL-207、ARG-358、TYR-662氨基酸形成很強(qiáng)的氫鍵相互作用，氫鍵距離分別為1.9、3.5、1.9，這對(duì)穩(wěn)定小分子也有著重要貢獻(xiàn)。結(jié)合圖5可以看到，該芹菜素分子一部分深入到DPP4口袋深處，另一部分也與DPP4的凹槽有很好的匹配。綜上，芹菜素與DPP4的位點(diǎn)匹配較好，能夠與DPP4蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物，與蛋白有著很好的關(guān)聯(lián)性，是潛在的活性化合物。

3結(jié)論

本研究系統(tǒng)考察了芹菜素對(duì)DPP-4的抑制及互作情況，借助分子模擬對(duì)接，更加精準(zhǔn)地揭示出芹菜素抑制DPP-4的分子機(jī)制。結(jié)果表明，芹菜素呈劑量依賴性抑制DPP-4的活性，并且具有明顯可逆的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。芹菜素可在氫鍵和范德華力作用力驅(qū)動(dòng)下，與DPP-4形成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)發(fā)生熒光猝滅效應(yīng)，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1。分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)一步表明，芹菜素位于酶的疏水口袋中，與殘基VAL-207、ARG-358、TYR-662形成較強(qiáng)的氫鍵，并與周圍眾多的疏水殘基存在疏水作用，共同促進(jìn)了小分子和蛋白口袋的結(jié)合。綜上，芹菜素能夠與DPP-4高效結(jié)合，是潛在的對(duì)DPP-4有較好抑制活性的化合物。本研究結(jié)果可為芹菜及芹菜素類降血糖產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。參考文獻(xiàn)

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Inhibitory Effect of Apigenin on DPP-4 and Its Interaction MechanismPAN Jun-kun，ZHANG Qiang，JIAO Zhong-gao

（Zhengzhou Fruit Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450009，China）

Abstract：ObjectiveTo elucidate the mechanisms for the hypoglycemic effect of apigenin.MethodThe inhibitory activity of apigenin on dipeptidyl peptidase-4 （DPP-4） at different concentrations was evaluated，and then the inhibition type and interaction mechanism were investigated by using kinetic analysis，fluorescence quenching experiment as well as molecular docking.ResultApigenin inhibited DPP-4 in a reversible and non-competitive mode with a half maximal inhibitory concentration （IC50） of （62.45±1.22） μg/mL. During interaction，they formed a ground-state complex with DPP-4 under the action of hydrogen bonds and van der Waals forces，and there was only one binding site on DPP-4 for apigenin. Apigenin could form strong hydrogen bonds with the residues VAL-207，ARG-358 and TYR-662 of DPP-4，and thus maintain the structure of the complex together with numerous hydrophobic residues.ConclusionThe results can provide scientific basis for the development of hypoglycemic products related to celery or apigenin.

Keywords： apigenin; dipeptidyl peptidase-4（DPP-4）; inhibition; interaction; molecular docking