基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討白果抗氧化作用機(jī)制

摘要：目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)初步探討白果抗氧化的作用機(jī)制。方法：通過TCMSP數(shù)據(jù)庫收集白果活性成分及靶點(diǎn)；利用GeneCards、OMIM和NCBI數(shù)據(jù)庫對(duì)抗氧化靶點(diǎn)進(jìn)行收集；利用STRING數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)藥物和疾病靶標(biāo)進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析（PPI），并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件，拓?fù)浞治龅玫胶诵陌悬c(diǎn)；基于核心靶點(diǎn)通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，建立“活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選得到核心成分和核心靶點(diǎn)。利用AutoDock Vina進(jìn)行分子對(duì)接對(duì)核心成分和核心靶點(diǎn)的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：共獲得白果活性成分15個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)142個(gè)，疾病靶點(diǎn)11 255個(gè)，共有靶點(diǎn)139個(gè)。經(jīng)過蛋白互作及拓?fù)浞治?，得到核心靶點(diǎn)13個(gè)，核心靶點(diǎn)涉及139個(gè)基因功能條目和71條通路（Plt;0.05）。將“活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)浞治?，共篩選出表沒食子兒茶素沒食子酸酯、槲皮素、β-胡蘿卜素、山柰酚、芒柄花素、異鼠李素、β-谷甾醇和（+）-兒茶素共8個(gè)核心成分，以及CASP3、CCND1、MYC、CTNNB1、MAPK8、FOS、EGFR、VEGFA、IL6、ESR1共10個(gè)核心靶點(diǎn)。結(jié)論：白果抗氧化具有多成分、多靶點(diǎn)和多通路的作用特點(diǎn)，白果活性成分可能通過上調(diào)VEGFA、ESR1蛋白的表達(dá)，下調(diào)CASP3、CCND1、MYC、CTNNB1、MAPK8、EGFR、IL6蛋白的表達(dá)，激活癌癥、傳染病、信號(hào)傳導(dǎo)、內(nèi)分泌代謝等相關(guān)通路來實(shí)現(xiàn)抗氧化作用。

關(guān)鍵詞：白果；抗氧化；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對(duì)接；作用機(jī)制白果為植物銀杏的種核，藥食同源，具有很高的營養(yǎng)和藥用價(jià)值 [1-3]，具有抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等藥理活性[4]。白果中藥治療疾病存在多成分、多靶點(diǎn)、多通路同時(shí)作用的特性[5]。白果抗氧化作用較為明確，但其具體的作用機(jī)制研究還不夠清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)適用于中藥復(fù)雜成分的解析和開發(fā)[6]，可對(duì)白果抗氧化的作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)全面的分析。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接對(duì)白果活性成分、作用靶點(diǎn)、信號(hào)通路等進(jìn)行系統(tǒng)分析，探究白果抗氧化的分子機(jī)制，為白果的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1數(shù)據(jù)庫與軟件

TCMSP數(shù)據(jù)、PubChem數(shù)據(jù)庫、Uniprot數(shù)據(jù)庫、人類基因組數(shù)據(jù)庫（GeneCards）、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）、美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）基因數(shù)據(jù)庫、功能關(guān)聯(lián)蛋白網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫（STRING）、DAVID數(shù)據(jù)庫、微生信、Perl軟件、Cytoscape3.9.1軟件、Chem 3D 20.0軟件、AutoDock Vina軟件、Pymol軟件、AutoDockTools-1.5.7軟件、Open Babel軟件、Chem Draw 20.0軟件、Origin 2021軟件。

1.2白果活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)TCMSP檢索白果的所有化學(xué)成分，根據(jù)口服生物利用度（OB＞30%）和類藥性（DL＞0.18）為篩選條件，得到白果活性成分。利用TCMSP獲取白果活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，并結(jié)合UniProt數(shù)據(jù)庫對(duì)靶基因進(jìn)行注釋，合并后去除重復(fù)靶點(diǎn)，即為白果活性成分的靶點(diǎn)。

1.3白果抗氧化相關(guān)靶點(diǎn)的收集

在GeneCards、OMIM和NCBI數(shù)據(jù)庫中，以“antioxidant activity”“antioxidation” “oxidation resistance” “anti-oxidant” “oxidative stress”為關(guān)鍵詞搜索，獲得抗氧化相關(guān)靶點(diǎn)。將所有收集的抗氧化相關(guān)靶點(diǎn)合并，除去重復(fù)后得到抗氧化相關(guān)靶點(diǎn)。利用Venny 2.1.0 在線分析工具，繪制白果活性成分相關(guān)靶點(diǎn)與抗氧化相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩（Venny）圖，通過取交集的方法獲取白果活性成分抗氧化的共同靶點(diǎn)。

1.4蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將白果活性成分抗氧化的靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，限定物種為 “Homo sapiens”，設(shè)置最低相互作用閾值中等置信度（gt;0.4），其余參數(shù)為默認(rèn)，得到PPI數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1，運(yùn)用CytoNCA插件計(jì)算度中心性（DC），介度中心性（BC）和接近中心性（CC），先以DC大于2倍中位數(shù)進(jìn)行篩選，再篩選出DC，BC及CC大于中位數(shù)的靶點(diǎn)，經(jīng)過兩次篩選得到的靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)，構(gòu)建核心靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5白果核心靶點(diǎn)的GO功能和KEGG通路富集分析

將核心靶點(diǎn)上傳DAVID數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行基因本體（GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析，以Plt;0.05為篩選條件。獲得生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）、分子功能（MF）和KEGG關(guān)鍵信號(hào)通路的富集信息，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

1.6白果抗氧化“活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建涉及的活性成分與20條通路及其相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件，得到“活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。利用插件CytoNCA計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中成分節(jié)點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治觯聪蚝Y選白果抗氧化的有效成分及關(guān)鍵基因。

1.7白果活性成分抗氧化核心成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證將“活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖反向篩選的有效成分與網(wǎng)絡(luò)圖中DC≥10的關(guān)鍵基因進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。將PubChem下載有效成分2D結(jié)構(gòu)，利用Chem 3D 20.0軟件進(jìn)行能量最小化處理后導(dǎo)出3D結(jié)構(gòu)。從PDB數(shù)據(jù)庫下載關(guān)鍵基因的三維結(jié)構(gòu)。利用Pymol軟件對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行去水、移除溶劑分子、去原配體等預(yù)處理，利用AutoDockTools-1.5.7對(duì)核心成分和核心靶點(diǎn)進(jìn)行加氫、電荷計(jì)算等操作。運(yùn)行AutoDock Vina進(jìn)行分析對(duì)接，根據(jù)結(jié)合能用Origin軟件繪制熱圖，分析結(jié)合能的大小，使用Pymol軟件對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化。

2結(jié)果與分析

2.1白果活性成分和作用靶點(diǎn)的篩選

在TCMSP中，以O(shè)B和DL值為篩選條件，共得化合物21個(gè)，將對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)利用UniProt數(shù)據(jù)庫對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行注釋得到活性成分15個(gè)（附表），對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)142個(gè)。

2.2白果抗氧化相關(guān)靶點(diǎn)的收集

將GeneCards、OMIM和NCBI數(shù)據(jù)庫收集到的靶點(diǎn)合并去除重復(fù)后，共獲得11 255個(gè)抗氧化相關(guān)靶點(diǎn)。利用在線分析工具Venny 2.1.0將白果活性成分靶點(diǎn)與抗氧化靶點(diǎn)繪制韋恩圖，得到共有靶點(diǎn)139個(gè)（圖1）。

2.3PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將得到的139個(gè)白果活性成分抗氧化的潛在靶點(diǎn)，上傳至STRING，設(shè)置最低相互作用閾值置信度（gt;0.4），構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件，利用CytoNCA插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的DC、BC和CC值。先以DC大于2倍中位數(shù)38進(jìn)行篩選，再篩選出DC、BC及CC大于中位數(shù)50.5、326.245 145及0.594 237 95的靶點(diǎn)，經(jīng)過兩次篩選得到13個(gè)靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，按照DC值排序?yàn)镸YC、ALB、IL6、CTNNB1、ESR1、CASP3、CCND1、HIF1A、EGFR、PPARG、VEGFA、FOS、MAPK8。圖2表明蛋白與蛋白的相互作用，線條越多表明關(guān)聯(lián)度越大，作用也就越強(qiáng)。圖3中靶點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)越大顏色越深，代表degree值越大，表示與其相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白數(shù)量越多，在網(wǎng)絡(luò)中所處的位置越核心。

2.4GO生物功能及KEGG通路富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫，對(duì)13個(gè)白果活性成分抗氧化靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析（圖4、圖5），結(jié)果顯示，富集的GO條目共139個(gè)，其中富集在BP的條目有101個(gè)，主要包括凋亡過程的負(fù)調(diào)控、基因表達(dá)的正調(diào)控、細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)和肝再生等；富集在CC的條目有13個(gè)，富集部位涉及大分子復(fù)合物、細(xì)胞核、核質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)等；富集在MF的條目有25個(gè)，主要涉及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、酶結(jié)合和蛋白磷酸酶結(jié)合等。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，富集的KEGG通路有71條。白果抗氧化KEGG通路富集前20的條目主要涉及癌癥、傳染病、信號(hào)傳導(dǎo)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和內(nèi)分泌代謝疾病等幾大類通路，富集的KEGG通路共71條，主要集中于癌癥通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、結(jié)直腸癌、內(nèi)分泌抵抗、甲狀腺激素信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路和酒精性肝病等。

2.5白果“活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將核心靶點(diǎn)及其相關(guān)的活性成分與前20條通路及其相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件，刪除3條重復(fù)，得到“活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖（圖6），其中綠色菱形節(jié)點(diǎn)代表通路，橙色六邊形代表靶點(diǎn)，藍(lán)色圓形代表白果活性成分。節(jié)點(diǎn)大小與連接度（degree）呈正相關(guān)，利用插件CytoNCA計(jì)算網(wǎng)絡(luò)圖中成分節(jié)點(diǎn)的DC、BC和CC。該網(wǎng)絡(luò)包含41個(gè)節(jié)點(diǎn)（包括8個(gè)化合物，13個(gè)靶點(diǎn)，20條通路）和152條邊。從通路角度分析，連接度較高的通路為hsa05200（癌癥通路）、hsa05167（卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染）和hsa05205（癌癥中的蛋白多糖）等。從靶點(diǎn)角度分析，篩選出10個(gè)DC≥10的靶點(diǎn)，分別為CASP3、CCND1、MYC、CTNNB1、MAPK8、FOS、EGFR、VEGFA、IL6、ESR1。從化合物角度分析，該網(wǎng)絡(luò)圖共篩選出8種化合物，這8種化合物即為白果抗氧化的主要活性成分，分別為（-）-epigallocatechin-3-gallate（表沒食子兒茶素沒食子酸酯）、Quercetin（槲皮素）、beta-carotene（β-胡蘿卜素）、kaempferol（山柰酚）、formononetin（芒柄花素）、isorhamnetin（異鼠李素）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）和（+）-catechin［（+）-兒茶素］。從上述結(jié)果可以看出，化合物可以通過不同的靶點(diǎn)、調(diào)控不同的通路，同時(shí)也存在不同的化合物共同作用于同一靶點(diǎn)、調(diào)控同一通路的現(xiàn)象，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路共同作用的特性。

2.6分子對(duì)接驗(yàn)證

將“活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖篩選出的活性成分（8個(gè)）與DC≥10的靶點(diǎn)（10個(gè)）進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接結(jié)果見圖7。結(jié)合能越低說明配體和受體結(jié)合越穩(wěn)定，結(jié)合能小于0說明可以自發(fā)結(jié)合，一般以結(jié)合能小于-5 kcal/mol作為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[6]，結(jié)果顯示，白果的主要成分與核心靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)合能均小于-5 kcal/mol。說明白果主要成分和靶點(diǎn)都能較好的結(jié)合，結(jié)合能越低表明構(gòu)象越穩(wěn)定。該結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選結(jié)果相一致。利用Pymol軟件將對(duì)接的最佳構(gòu)象進(jìn)行可視化分析。由圖8可知，白果活性成分與靶點(diǎn)蛋白通過氫鍵和疏水作用力等緊密結(jié)合。圖4白果抗氧化核心靶點(diǎn)的GO富集分析

3討論

在正常生理狀態(tài)下，機(jī)體的氧化程度和抗氧化能力維持動(dòng)態(tài)平衡，氧化應(yīng)激是指氧化能力和抗氧化能力之間的失衡，氧化劑作用的增強(qiáng)，會(huì)導(dǎo)致氧化還原信號(hào)傳導(dǎo)中斷或分子損傷等[7-8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激與衰老、腫瘤、心腦血管疾病、免疫炎癥疾病、糖尿病、腎臟系統(tǒng)疾病、阿爾茲海默病和帕金森等疾病都有密切的關(guān)系[9]。中草藥和食品中含有大量的抗氧化成分，被譽(yù)為天然的抗氧化劑[10]。天然抗氧化劑的開發(fā)利用對(duì)氧化應(yīng)激疾病的預(yù)防與治療具有重要的意義。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建“核心靶點(diǎn)-核心靶點(diǎn)相互作用”“活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”等網(wǎng)絡(luò)圖。深入挖掘白果抗氧化的主要成分、核心靶點(diǎn)和作用機(jī)制，最后用分子對(duì)接對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

3.1白果抗氧化的活性成分

基于“活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖的篩選，發(fā)現(xiàn)表沒食子兒茶素沒食子酸酯、槲皮素、β-胡蘿卜素、山柰酚、芒柄花素、異鼠李素、β-谷甾醇和（+）-兒茶素為主要的抗氧化活性成分。大量研究表明，表沒食子兒茶素沒食子酸酯[11-12]、槲皮素[13]、β-胡蘿卜素[14]和山柰酚[15]、芒柄花素[16]、異鼠李素[17]、β-谷甾醇[18]和（+）-兒茶素[19]均具有良好的抗氧化性。表沒食子兒茶素沒食子酸酯是茶多酚中生物活性最強(qiáng)的成分，可以通過清除活性氧，抑制細(xì)胞內(nèi)生物大分子的過氧化來抑制細(xì)胞凋亡[20]，表沒食子兒茶素沒食子酸酯可通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族、c-fos、c-myc、p53的基因表達(dá)來保護(hù)細(xì)胞免受高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[21]，與本研究結(jié)果相符。槲皮素是一種強(qiáng)抗氧化劑，是活性氧（ROS）的有效清除劑之一，槲皮素也可以通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化酶HOMX1的表達(dá)來減少氧化應(yīng)激對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損害，從而發(fā)揮抗氧化作用[22]。

β-胡蘿卜素是自然界中活性最高的一種類胡蘿卜素，其分子結(jié)構(gòu)中特殊的共軛多烯體系是具有抗氧化作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，可通過清除自由基、抗氧化作用來預(yù)防和治療疾病[23]。山柰酚可通過調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)、抑制轉(zhuǎn)錄因子及基質(zhì)金屬蛋白酶發(fā)揮抗炎作用，其抗炎作用的發(fā)揮與MAPK信號(hào)通路激活相關(guān)[24]。MAPK信號(hào)通路是真核細(xì)胞中廣泛的調(diào)控機(jī)制之一，通過激活轉(zhuǎn)錄因子c-fos、c-Jun、c-myc等，增強(qiáng)AP-1的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控INF-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等炎癥因子的表達(dá)，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[25]。

芒柄花素屬于異黃酮類化合物，可通過升高人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的ROS水平，激活JNK信號(hào)通路，增加Bax/Bcl-2表達(dá)的比例，導(dǎo)致線粒體損傷，激活Caspase-3，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)出抗腫瘤作用[26]；也可在心肌和腦組織缺血后，抑制組織中的ROS的升高和細(xì)胞凋亡來發(fā)揮對(duì)心、腦缺血損傷的保護(hù)作用[16]。異鼠李素表現(xiàn)有良好的護(hù)肝作用，可以減輕多種原因引起的肝細(xì)胞的壞死和凋亡。周健等[27]通過建立非酒精性脂肪肝病體外細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)異鼠李素可以提高細(xì)胞的抗氧化能力，降低游離脂肪酸誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積，來減輕非酒精性脂肪肝病的發(fā)展，異鼠李素可能可以作為治療非酒精性脂肪肝病的有效藥物。乙型肝炎病毒感染可引起人肝纖維化，研究表明，異鼠李素可以顯著抑制肝纖維化、抑制肝星狀細(xì)胞活化、細(xì)胞外基質(zhì)沉積和自噬，其作用機(jī)制涉及TGF-β1介導(dǎo)的Smad3和p38MAPK信號(hào)通路[28]。

β-谷甾醇是一種植物甾醇，β-谷甾醇對(duì)CCL4誘導(dǎo)的慢性肝病具有肝保護(hù)作用，主要表現(xiàn)為抑制氧化應(yīng)激、HSCs激活標(biāo)志物的表達(dá)、組織病理學(xué)改變以及抗纖維化作用，是一種很有前途的預(yù)防肝毒性的藥物[29]。心肌缺血再灌注會(huì)破壞機(jī)體的氧化與抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡，是一種不可逆性損傷，有研究表明，β-谷甾醇可通過上調(diào)SOD水平、下調(diào)ROS和MDA水平來緩解氧化應(yīng)激損傷；通過下調(diào)IL-1β、IL-6和TNF-α水平，改善炎癥反應(yīng)進(jìn)一步下調(diào)ERK1/2，上調(diào)Bcl-2/Bax來抑制心肌細(xì)胞凋亡，以此來達(dá)到改善心肌缺血再灌注的心臟損傷[30]。（+）-兒茶素是兒茶素的異構(gòu)體之一，具有多種藥理作用，抗氧化是（+）-兒茶素生物活性的基礎(chǔ)。（+）-兒茶素可通過下調(diào)SREBP-1、DGAT2的表達(dá)和下調(diào)PPARα和CPT1的表達(dá)，減少甘油三酯的合成，促進(jìn)脂肪酸氧化，提高SOD活性，改善細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)來減少乙醇誘導(dǎo)下的HepG2細(xì)胞損傷，同等條件下表沒食子兒茶素沒食子酸酯對(duì)HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用優(yōu)于（+）-兒茶素[31]。

3.2白果抗氧化的潛在作用靶點(diǎn)

本研究通過對(duì)“活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖的拓?fù)浞治?，得到白果抗氧化?0個(gè)核心靶點(diǎn)為CASP3、CCND1、MYC、CTNNB1、MAPK8、FOS、EGFR、VEGFA、IL6和ESR1。CASP3基因?qū)儆诎腚装彼岬鞍酌讣易逯械闹匾蓡T，是細(xì)胞凋亡和染色質(zhì)凝聚的主要執(zhí)行者。CASP3可被ROS激活，CASP激活是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的重要步驟之一，降低CASP3基因的表達(dá)氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷[32]。CCND1基因編碼的蛋白質(zhì)屬于細(xì)胞周期蛋白家族，有研究表明，氧化應(yīng)激水平增加的同時(shí)增殖相關(guān)基因（CDK-2、CDK-6、CCND1和CCNE1）的表達(dá)顯著降低[33]，中藥成分可通過下調(diào)CCND1的表達(dá)，來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖進(jìn)程來達(dá)到抗腫瘤的作用[34]。MYC基因?qū)儆谠┗颍渌鶎俚腗YC基因家族可促進(jìn)細(xì)胞增殖、永生化和去分化等。MYC基因的上調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激和心臟功能障礙[35]。

CTNNB1是一種原癌基因，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系，在多種癌癥的腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。王平等[36]研究表明，下調(diào)卵巢癌HO8910細(xì)胞中的CTNNB1基因的表達(dá)，可通過激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，上調(diào)細(xì)胞中的Caspase-3蛋白活性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。MAPK8是一種促凋亡激酶，可通過降低MAPK8的表達(dá)來保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[37]。FOS可參與線粒體功能和氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)，因此，F(xiàn)OS可能是腦卒中治療的潛在新靶點(diǎn)。值得注意的是，F(xiàn)OS在細(xì)胞凋亡中的作用具有兩面性，研究表明，F(xiàn)OS可以減少細(xì)胞凋亡，而另一些研究表明FOS可以增加細(xì)胞凋亡[38]。EGFR屬于酪氨酸激酶受體家族成員，與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有重要的關(guān)系，研究表明，中藥干預(yù)EGFR基因下調(diào)可改善氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙[39]。

VEGFA是VEGF家族的一員，抑制VEGFA的表達(dá)可導(dǎo)致脊髓內(nèi)ROS水平升高，沉默VEGFA可以提高ROS水平，加重貝伐珠單抗誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷，研究證明上調(diào)VEGFA的表達(dá)可以減少機(jī)體氧化應(yīng)激損傷[40]。IL-6是一種重要的炎癥因子，過量存在的IL-6可釋放自由基（OR）、蛋白酶等，加速炎性介質(zhì)生成，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)效應(yīng)。IL-6基因的上調(diào)可導(dǎo)致炎癥的發(fā)生和組織損傷[41]。ESR1是雌激素受體的兩種主要類型之一，研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過上調(diào)雞卵巢生殖激素受體［類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR）、雄激素受體（AR）和ESR1］來抵抗叔丁基過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致的生產(chǎn)性能下降和卵巢炎癥等[42]。本研究發(fā)現(xiàn)，白果有效成分可以與CASP3、CCND1、MYC和CTNNB等多個(gè)靶點(diǎn)相互作用，為了驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果的可靠性，用分子對(duì)接技術(shù)分析核心成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些成分和靶點(diǎn)都能很好地結(jié)合。

3.3白果抗氧化的分子機(jī)制

KEGG通路富集結(jié)果顯示，白果抗氧化核心靶點(diǎn)主要富集在癌癥、傳染病、肝損傷及內(nèi)分泌代謝相關(guān)通路，氧化應(yīng)激是相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展的共同原因，緩解氧化應(yīng)激是治療這幾類疾病的常用策略，通過對(duì)本研究的結(jié)果分析，白果中的多種成分可經(jīng)多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮抗氧化作用，從而達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。MAPK信號(hào)通路與心腦等器官的抗氧化應(yīng)激損傷相關(guān)，該通路的激活減輕了氧化應(yīng)激帶來的損傷。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS經(jīng)p38MAPK信號(hào)通路使穩(wěn)定狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2磷酸化，與Keap分離后轉(zhuǎn)至細(xì)胞核，與重組蛋白形成異二聚體并與抗氧化元件結(jié)合，啟動(dòng)HO-1基因的轉(zhuǎn)錄，HO-1是一種重要的抗氧化酶，具有很好的抗氧化應(yīng)激的作用[43]。VEGFA為MAPK信號(hào)通路上游的關(guān)鍵基因，MAPK信號(hào)通路與細(xì)胞增殖分化、環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種細(xì)胞過程息息相關(guān)。與細(xì)胞增殖、應(yīng)激、炎癥等信號(hào)通路交匯[44]?？傊?，通路的富集結(jié)果分析提示白果抗氧化復(fù)雜的作用機(jī)制。

4結(jié)論

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選白果的主要活性成分、作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)白果中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯、槲皮素、β-胡蘿卜素、山柰酚、芒柄花素、異鼠李素、β-谷甾醇和（+）-兒茶素可能通過上調(diào)VEGFA和ESR1蛋白的表達(dá)，下調(diào)CASP3、CCND1、MYC、CTNNB1、MAPK8、EGFR和IL6蛋白的表達(dá)，激活癌癥、傳染病、信號(hào)傳導(dǎo)、內(nèi)分泌代謝等相關(guān)通路來實(shí)現(xiàn)抗氧化作用，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)的預(yù)測(cè)與現(xiàn)有文獻(xiàn)結(jié)果較為相近，表明了該方法的科學(xué)性，為白果抗氧化作用機(jī)制的研究提供依據(jù)，但是受限于數(shù)據(jù)庫的完整性、分析軟件和機(jī)體環(huán)境的差異，關(guān)于白果抗氧化還需要進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的完善為白果抗氧化作用機(jī)制提供理論依據(jù)，才能更好地指導(dǎo)白果的開發(fā)與利用。參考文獻(xiàn)

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Network Pharmacology and Molecular Docking TechnologyHONG Meng-jie LU Sheng-lun LIU Yu-jia JING Si-qun CHEN Jie YU Bai-yin

（1 Department of Biologic and Geographic Sciences，Kashi University，Kashi 844000，China；

2 Henry Fok School of Biology and Agriculture，Shaoguan University，Shaoguan 512000，China；

3 Medical College，Henan Vocational University of Science and Technology，Zhoukou 466000，China）Abstract：ObjectiveTo investigate the mechanism of Ginkgo Semen in antioxidation based on network pharmacology and molecular docking technology. MethodThe active ingredients and targets of Ginkgo Semen were collected through TCMSP database. GeneCards，OMIM and NCBI databases were adopted to predict antioxidation targets. Protein-Protein interaction analysis （PPI） of drugs and disease targets was constructed by STRING data platform and imported into Cytoscape 3.9.1 for further topological analysis to obtain core targets. The GO function and KEGG pathway were analyzed by DAVID database. The \"active ingredient-core target-pathway\" network diagram was established to screen the core ingredients and core targets using topological analysis. AutoDock Vina was employed to perform molecular docking to verify the interaction between core ingredients and core targets. ResultA total of 15 active ingredients，142 corresponding targets and 11 255 antioxidation related targets were obtained. 139 shared targets were selected through venn diagram. After protein-protein interaction and topological analysis，13 core targets，139 gene function items and 71 pathways （Plt;0.05） were identified. （-）-epigallocatechin-3-gallate，quercetin，beta-carotene，kaempferol，formononetin，isorhamnetin，beta-sitosterol and （+）-catechin were core ingredients act on core targets，such as CASP3，CCND1，MYC，CTNNB1，MAPK8，F(xiàn)OS，EGFR，VEGFA，IL6 and ESR1 after topological analysis of the network diagram of \"active ingredients-core targets-pathways\". The result of molecular docking suggested that the core active ingredients had good affinity with the core targets. ConclusionGinkgo Semen has the characteristics of multi-component，multi-target and multi-pathway in antioxidation activity. In our study，the antioxidative effects of Ginkgo Semen might be accomplished by upregulating VEGFA and ESR1 expressions and downregulating CASP3，CCND1，MYC，CTNNB1，MAPK8，EGFR and IL6 expressions through several signaling pathways including intervening cancer，infectious diseases，signal transduction，endocrine metabolism and other related pathways. Our preliminary results provide ideas and theoretical basis for the follow-up study on the antioxidant mechanism of Ginkgo Semen.

Keywords：Ginkgo Semen; antioxidation; network pharmacology; molecular docking; mechanism