人體腸道中多雷擬桿菌的分離與鑒定

摘 要：目的：從健康人體腸道菌群中分離篩選出擬桿菌菌株，并進行鑒定培養(yǎng)。方法：從4位無腸道疾病史，且在研究前近1個月內(nèi)未使用抗生素的健康供體中采集糞便樣品，于添加有血紅素、維生素K1的腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中初篩，再于添加有脫纖維羊血、血紅素、維生素K1的布氏瓊脂培養(yǎng)基復(fù)篩，將篩選到的菌株進行形態(tài)學(xué)及培養(yǎng)特征的觀察、革蘭氏染色及顯微鏡的鏡檢、生理生化鑒定、菌落PCR反應(yīng)和16S rRNA保守序列測定與分析，以確定種屬。結(jié)果：篩選得到的NG01菌株經(jīng)厭氧培養(yǎng)后在血平板上產(chǎn)生灰白色、不透明、表面光滑、邊緣規(guī)則、濕潤、輕微隆起、呈圓形、中等大小的菌落，菌株專性厭氧，呈革蘭氏陰性，無芽孢，棒桿狀，排列無規(guī)則，能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖等，不發(fā)酵D-山梨醇、肌醇、核糖等，氧化酶和過氧化氫酶檢測均呈陰性。經(jīng)Blast序列比對，NG01菌株與Bacteroides dorei 175的16S rRNA相似度達到98.96%。結(jié)論：分離得到的NG01菌株在細(xì)菌形態(tài)、培養(yǎng)特性、生理生化反應(yīng)結(jié)果符合擬桿菌屬特征。

關(guān)鍵詞：腸道菌群；多雷擬桿菌；分離鑒定；16S rRNA測序

腸道菌群是人體腸道微生物區(qū)系的重要組成部分，其中含有將近1 000種菌^[1-2]，能夠?qū)κ澄锲鸬蕉蜗⑽盏淖饔?。擬桿菌屬在糞便中是優(yōu)勢菌種，占糞便微生物的30%～40%，每克糞便中該菌屬含量可達到10⁹～10¹¹個，比腸桿菌及腸球菌還要高出4～7個數(shù)量級^[3-4]。因此，糞便是篩選擬桿菌株的天然優(yōu)質(zhì)來源。擬桿菌屬又稱類桿菌屬，是呈棒桿狀、專性厭氧、不產(chǎn)芽孢的革蘭氏陰性菌^[5]。擬桿菌屬以脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis）為模式菌株，是人體腸道菌群的主要成員^[6]，有助于維持正常的腸道生理功能。21世紀(jì)益生菌研究領(lǐng)域空前發(fā)展，乳酸菌、雙歧桿菌、糞鏈球菌等作為第一代益生菌已應(yīng)用于微生態(tài)學(xué)制劑以及人體疾病預(yù)防和保健^[7]。擬桿菌憑借其自身獨特的性質(zhì)及理想的人體腸道來源，很有可能成為第二代益生菌的主力菌株，從而起到緩解疾病、恢復(fù)人體健康的作用^[8]。因此，開發(fā)利用尚未被人發(fā)現(xiàn)的擬桿菌，對促進與中國人腸道結(jié)構(gòu)特征兼容的益生菌產(chǎn)品的開發(fā)過程具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 磷酸緩沖液溶液（PBS），中國吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；酵母提取物、血紅素、維生素K1、脫纖維羊血、細(xì)菌生理生化特性鑒定用的葡萄糖發(fā)酵管、蔗糖發(fā)酵管、3% NaCl甘露糖、乳糖發(fā)酵管、山梨醇發(fā)酵管、肌醇發(fā)酵管、D-核糖、2%過氧化氫酶試劑、氧化酶試紙、厭氧培養(yǎng)袋、厭氧產(chǎn)氣包、氧氣指示劑，中國海博生物技術(shù)有限公司；TIANamp Bacteria DNA Kit 離心柱型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR Kit 聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒，中國杭州眾鑫儀器有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 腦心浸液肉湯（BHI）、布氏瓊脂培養(yǎng)基（Brucella Agar），中國海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 糞便樣品的采集和預(yù)處理 選擇4位1個月內(nèi)沒有藥物、抗生素、益生菌使用史的健康成人作為研究對象，其中男性2人、女性2人。研究對象自行采集晨起第一次排出的新鮮糞便中間段沒有接觸空氣和地面的部分，然后將其放入糞便樣本采樣管內(nèi)，以此為實驗樣品。配制磷酸緩沖液PBS：NaCl 8.0 g/L、KCl 0.2 g/L、Na₂HPO₄ 1.44 g/L、KH₂PO₄ 0.24 g/L，用磷酸將pH調(diào)至6.8，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。于超凈臺內(nèi)稱取10 g糞便于無菌容器中，加入80 mL無菌PBS緩沖液，充分?jǐn)嚢钁腋『笥脽o菌三層紗布過濾，得到糞便原液，取1 mL用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，其余立即置于厭氧環(huán)境中靜置備用。

1.2.2 改良培養(yǎng)基配制 BHI商品培養(yǎng)基粉末38.5 g/L，酵母提取物5 g/L，調(diào)pH至7.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，冷卻至50 ℃以下加入血紅素5 mg/L、維生素K1（VK1）1 mg/L，商品VK1濃度為0.02%，每支含量1 mL，因此，每200 mL BHI培養(yǎng)基需加入1支商品VK1。配制布氏瓊脂培養(yǎng)基：布氏瓊脂商品粉末6.75 g，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，脫纖維羊血56 ℃水浴保溫30 min，平板冷卻至50 ℃以下時加入5%脫纖維羊血、5 mg/L血紅素、1 mg/L VK1。

1.2.3 BHI初篩 菌液用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，分別稀釋10⁷、10⁸、10⁹倍，然后取96孔板加入180 μL BHI培養(yǎng)基及20 μL經(jīng)梯度稀釋后的菌液，于37℃厭氧培養(yǎng)，每個梯度平行3次。

1.2.4 布氏瓊脂血平板復(fù)篩 96孔板培養(yǎng)3～4 d后取出觀察，記錄有明顯渾濁的孔位，將這些渾濁的菌液稀釋10²、10³、10⁴倍，取100 μL涂布于布氏瓊脂血平板上，于37℃厭氧培養(yǎng)。

1.2.5 鏡檢 目前已知一系列擬桿菌屬的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征，普遍意義上該屬菌落呈灰白色、圓形、凸起，該菌屬專性厭氧，呈小桿狀，革蘭氏染色陰性，本研究根據(jù)這一系列傳統(tǒng)特征進行初篩。布氏瓊脂血平板培養(yǎng)1～2 d后取出，觀察菌落特征，記錄有明顯菌落產(chǎn)生的平板，挑取單菌落于BHI液體培養(yǎng)基內(nèi)進行37 ℃厭氧培養(yǎng)，另設(shè)對照組于有氧、微氧條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)1～2 d后觀察菌液是否渾濁，取需氧下澄清，而微氧、厭氧下渾濁的菌株，顯微鏡下鏡檢、染色觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.6 生理生化鑒定 （1）葡萄糖發(fā)酵實驗：取一內(nèi)盛2 mL無菌水的ep管，用接種針從平板上挑取已純化單菌落至無菌水中仔細(xì)混合成均勻細(xì)菌懸液，取3滴滴入葡萄糖發(fā)酵管中，接種完后用封口膜封口并放入36 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)18～24 h。結(jié)果觀察：陽性為黃色，陰性為藍色或藍綠色。（2）蔗糖發(fā)酵實驗：取蔗糖發(fā)酵管，接種方法、培養(yǎng)條件及結(jié)果觀察均同上。（3）甘露糖發(fā)酵實驗：取甘露糖發(fā)酵管，接種方法、培養(yǎng)條件及結(jié)果觀察均同上。（4）D-山梨醇發(fā)酵實驗：取山梨醇發(fā)酵管，接種方法、培養(yǎng)條件及結(jié)果觀察均同上。（5）肌醇發(fā)酵實驗：取肌醇發(fā)酵管，接種方法及結(jié)果觀察均同上，培養(yǎng)條件為28℃培養(yǎng)18～24 h。（6）乳糖發(fā)酵實驗：取乳糖發(fā)酵管，接種方法、培養(yǎng)條件同上。結(jié)果觀察：陽性為黃色，陰性為灰紫色、紫色或紫紅色。（7）核糖發(fā)酵實驗：取核糖發(fā)酵管，接種方法、結(jié)果觀察同上，培養(yǎng)條件為24～48 h。（8）過氧化氫酶實驗：滴加2～3滴3%過氧化氫酶試劑至菌落或培養(yǎng)基中。結(jié)果觀察：陽性為產(chǎn)生氣泡，陰性為無氣泡產(chǎn)生。（9）氧化酶實驗：將氧化酶試紙用蒸餾水浸濕，用細(xì)玻璃棒或一次性接種針挑取單個菌落涂在試紙上。結(jié)果觀察：在30 s內(nèi)變?yōu)樗{色或藍紫色為強陽性，2 min內(nèi)不變色為陰性。

1.2.7 菌落PCR擴增與測序 在無菌PCR管中加入20 μL Triton-×100，挑取單菌落于其中充分混合，另設(shè)不加菌落為空白對照組。PCR管于100℃恒溫水浴2 min，取1 μL上清液為模板，于25 μL PCR反應(yīng)體系中進行PCR反應(yīng)，引物采用16S引物（上游引物Eub338F為ACTCCTACGGGAGGCAGCAG，下游引物Eub518R為ATTACCGCGGCTGCTGG）^[9]。25 μL PCR擴增體系組成為基因組DNA模板1 μL、上游引物（10 μmol/L）1 μL、下游引物（10 μmol/L）1 μL、2xTaq Plus PCR MasterMix 12.5 μL、超純水 9.5 μL。PCR反應(yīng)循環(huán)程序：①94 ℃預(yù)變性3 min；②94 ℃變性30 s；③55 ℃退火30 s；④72 ℃ 延申1 min；⑤將上述3個步驟循環(huán)30次；⑥最后在72 ℃延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL反應(yīng)液在60 V、90 min條件下進行5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，隨后送至生工生物公司進行16S rRNA測序，測序結(jié)果于NCBI網(wǎng)站進行blast比對。最后利用MEGA 6.0軟件采用鄰接法、Bootstrap重復(fù)次數(shù)為1 000次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)親緣關(guān)系分析判斷篩得菌株的種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落特征觀察

經(jīng)厭氧培養(yǎng)后觀察在血平板上生長出的菌落形態(tài)，發(fā)現(xiàn)有兩株菌落為灰白色、不透明、表面光滑、邊緣規(guī)則、濕潤、輕微隆起、呈圓形、中等大小、直徑為1～2 mm，如圖1所示，這些條件符合公認(rèn)的擬桿菌菌落形態(tài)，編號這兩株菌株為NG01和NG02，其中NG01的菌落直徑稍小于NG02，且菌落數(shù)量多于后者。

2.2 菌體形態(tài)觀察及革蘭氏染色鏡檢

NG01和NG02菌液于顯微鏡下鏡檢如圖2所示，均呈小棒桿狀、無芽孢、排列無規(guī)則，常單獨存在，少見群集。革蘭氏染色后，菌體鏡檢結(jié)果呈紅色，如圖3所示，說明NG01、NG02菌株均為革蘭氏陰性，符合擬桿菌為革蘭氏陰性的特性。

2.3 厭氧實驗

將培養(yǎng)于BHI培養(yǎng)基中的NG01、NG02菌株分別置于有氧、微氧及無氧條件下培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)2種菌株在有氧、微氧環(huán)境下均無法生長，培養(yǎng)2 d后菌液仍澄清，而在無氧環(huán)境下能夠生長，菌液渾濁，如圖3所示。這與擬桿菌的專性厭氧特性相吻合。

2.4 菌落PCR電泳

NG01、NG02菌株的PCR電泳結(jié)果如圖4所示，可見樣品條帶清晰，說明PCR結(jié)果較好，產(chǎn)物濃度高，與Marker對照后，發(fā)現(xiàn)PCR得到的基因片段大小菌為200 bp左右（圖5）。

2.5 生理生化鑒定結(jié)果

如附表所示，NG01及NG02菌株能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖等，不能發(fā)酵D-山梨醇、肌醇、核糖等，不產(chǎn)生氧化酶及過氧化氫酶。

2.6 測序及分析結(jié)果

16S rRNA測序分析結(jié)果顯示，NG01及NG02序列相同，說明這2種菌株是屬于同一物種，下面只對NG01序列進行分析。經(jīng)過BioEdit進行序列剪輯合并校準(zhǔn)后，得到總序列，其總長度為192 bp，與PCR電泳結(jié)果相符合，序列為：ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGAGAGCCTGAACCAGCCAAG-TAGCGTGAAGGATGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTTCT-TTTATAAAGGAATAAAGTCGGGTATGCATACCCGTTTGC-ATGTACTTTATGAATAAGGATCGGCTAACTCCGTGCCAG-CAGCCGCGGTAAT。

Blast結(jié)果顯示，NG01菌株序列與Bacteroides vulgatus ATCC8482、Bacteroides vulgatus JCM5826及Bacteroides dorei 175序列相似性分別高達99.48%、99.48%、98.96%，人們普遍認(rèn)為，98%的16S rRNA序列同一性表明菌株是同一物種的成員^[9]，由此可見，NG01（NG02）菌株與Bacteroides vulgatus ATCC8482、Bacteroides vulgatus" JCM5826、Bacteroides dorei 175密切相關(guān)。如圖6所示，該進化樹顯示了菌株NG01的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，序列相似性水平和進化樹的分支模式都說明該菌株應(yīng)被歸入擬桿菌屬，分析枝長信息可得，菌株NG01與多雷擬桿菌的物種距離比較接近，說明菌株NG01為多雷擬桿菌。

3 結(jié)論

本試驗以健康人體糞便為研究對象，利用改良BHI培養(yǎng)基及改良布氏血平板篩選擬桿菌，而后結(jié)合傳統(tǒng)方法及現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)進行菌種鑒定。結(jié)果表明，篩選所得菌種為Bacteroidetes dorei NG01。

4 討論

人們對擬桿菌的最初認(rèn)識起源于其致病性，即當(dāng)宿主正常的微生態(tài)平衡失衡時可能會導(dǎo)致內(nèi)源性感染的出現(xiàn)^[10]。隨著微生態(tài)學(xué)的發(fā)展及研究的深入，研究人員逐漸認(rèn)識到擬桿菌是人類及許多動物體內(nèi)常見的菌群，甚至有益于健康，如有文獻報道稱擬桿菌減少會導(dǎo)致肥胖^[11]。此外，吳彥彬等^[12]在對擬桿菌的益生作用研究中發(fā)現(xiàn)，多形擬桿菌能根據(jù)宿主攝入物質(zhì)的類型靈活調(diào)節(jié)自己的基因組，從而通過降解作用使得宿主及自身充分吸收外界營養(yǎng)，最終達到維持整個腸道菌群健康的效果。模式菌株脆弱擬桿菌是哺乳動物內(nèi)數(shù)量最多的菌群，該菌群數(shù)量是人體健康狀況的一項重要指標(biāo)，與人的生長發(fā)育、新陳代謝都有關(guān)系，其數(shù)量下降將引起需氧菌與兼氧菌的細(xì)菌過度增長綜合征，使得腸道菌群失調(diào)，導(dǎo)致病理狀態(tài)，如霍亂引起腹瀉時該菌數(shù)量下降至10^-5個/g^[3，13]。1995年，張季階等^[14]通過分離出的一株脆弱擬桿菌（BF839）的臨床觀察表明，此菌株是人體益生菌，可以調(diào)節(jié)菌群、增強免疫力、促進兒童的生長發(fā)育、預(yù)防腸道及呼吸系統(tǒng)疾病、增進食欲和改善睡眠，科學(xué)家們還認(rèn)識到該菌可用于治療糖尿病、肥胖等疾病，具有被開發(fā)成新一代益生菌的潛力^[15]。擬桿菌屬與人類和動物健康息息相關(guān)，因此分離和鑒定以前未知的擬桿菌屬對人類健康具有重要意義。最近，Bacteroides coprocola、Bacteroides coprosis、Bacteroides finegoldii、Bacteroides tutois、Bacteroides plebeius等菌株逐漸被研究分離單培養(yǎng)，并進行表征^[16-19]。有研究表明，多雷擬桿菌對人類腸道系統(tǒng)的正常功能起著重要作用，其與影響細(xì)菌生長的膽汁濃度間存在一定的關(guān)系，從而調(diào)節(jié)腸道菌群^[20]。然而，除了許多有益功能外，它可能還具有條件致病性^[21]，《國際系統(tǒng)和進化微生物學(xué)雜志》也正在審查和分離多雷擬桿菌。因此，Bacteroides dorei NG01的分離與鑒定對擬桿菌屬益生菌的開發(fā)和腸道菌群健康的調(diào)節(jié)具有重要作用。

參考文獻

[1]D Liu.Molecular detection of human bacterial pathogens[M].Taylor amp; Framcos/CRC Press，2011.

[2]Fassarella M，Blaak E E，Penders J，et al.Gut microbiome stability and resilience：elucidating the response to perturbations in order to modulate gut health[J].Gut，2021（70）：595-605.

[3]張季階，于麗嫻，徐靈芝，等.一株無毒脆弱擬桿菌的分離鑒定[J].寧夏醫(yī)學(xué)雜志，1991（4）：216-218.

[4]梁紅霞，余志晟，劉如銦，等.基于擬桿菌16S rRNA基因進行微生物溯源的研究進展[J].中國環(huán)境科學(xué)，2018，38（11）：238-247.

[5]布坎南 R E，吉本斯 N E.伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊（8版）[M].北京：科學(xué)出版社，1984.

[6]Benno Y，Endo K，Mizutani T，et al. Comparison of fecal microflora of elderly persons in rural and urban areas of Japan[J].Applied and Environmental Microbiology，1989，55（5）：1100-1105.

[7]Cunningham M，Azcarate-peril M A，Barnard A，et al. Shaping the future of probiotics and prebiotics[J].Trends Microbiol，2021，29：667-685.

[8]Saarela M H.Safety aspects of next generation probiotics[J].Current Opinion in Food Science，2019（30）：8-13.

[9]LIU W T，MARSH T L，CHENG H，et al.Characterization of microbial diversity by determining terminalrestriction fragment length polymorphisms of genes encoding 16S rRNA[J].Appliedand Environmental Microbiology，1997，63（11）：4516-4522.

[10]Bornet E，Westermann A J.The ambivalent role of Bacteroides in enteric infections[J].Trends Microbiol，2022，30（2）：104-108.

[11]葛珊珊，彭曉光，王慕華，等.太原地區(qū)健康成年人腸道菌群結(jié)構(gòu)及其與BMI關(guān)系初探[J].山西科技，2020，35（2）：32-36.

[12]吳彥彬，李亞丹，李小俊，等.擬桿菌的研究及應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報，2007（1）：66-69.

[13]Ochoa-repáraz J，Mielcarz D W，Wang Y，et al.A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease[J].Mucosal Immunology，2010，3（5）：487-495.

[14]張季階，張洪梅，張翼，等.脆弱擬桿菌（BF839）菌液的臨床應(yīng)用研究[J].中國生物制品學(xué)雜志，1995（2）：63-65.

[15]馮淑貞，張和平.脆弱擬桿菌的研究進展[J].微生物學(xué)通報，2015，42（7）：1366-1371.

[16]Bakir M A，Sakamoto M，Kitahara M，et al.Bacteroides dorei sp. nov. isolated from human faeces[J].International Journal of Systematic amp; Evolutionary Microbiology，2006，56（7）：1639-1643.

[17]Kitahara M，Sakamoto M，Ike M，et al.Bacteroides plebeius sp.nov.and Bacteroides coprocola sp.nov. isolated from human faeces[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2005，55（5）：2143-2147.

[18]Bakir M A.Bacteroides finegoldii sp. nov. isolated from human faeces[J].International Journal of Systematic amp; Evolutionary Microbiology，2006，56（5）：931.

[19]Hayashi H，Shibata K，Bakir M A，et al.Bacteroides coprophilus sp. nov. isolated from human faeces[J].Int J Syst Evol Microbiol，2007，57（6）：1323-1326.

[20]Bakir M A，Sakamoto M，Kitahara M et al.Bacteroides dorei sp. nov. isolated from human faeces[J].International Journal of Systematic amp; Evolutionary Microbiology，2006，56（7）：1639-1643.

[21]Vatanen T，Kostic A，Hennezel E，et al.Variation in microbiome LPS immunogenicity contributes to autoimmunity in humans[J].Cell，2016，165（4）：842-853.

Isolation and Identification of Bacteroides dorei NG01 from Human Intestines

SU Xiao-ming¹，XIANG Sha-sha¹，SHI Li-hua¹，WANG Xin-yang¹，

SHEN Yu-biao¹，YING Jian²，CHEN Jie³，ZHU Xuan³

（¹Weifang Elbe-Health Co.，Ltd.，Weifang 261057，China;²Beijing Key Laboratory of Nutrition，Health and Food Safety，

COFCO Nutrition and Health Research Institue Co.，Ltd.，Beijing 102200，China;

³School of Food Science and Bioengineering，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310018，China）

Abstract：ObjectiveTo isolate and identify the unknown strain of Bacteroides from healthy human intestinal flora.MethodStool samples were collected from 4 healthy donors who had no history of intestinal disease and had not used antibiotics in the past month before the study，the intestinal bacteria were placed in brain heart infusion broth （BHI） medium supplemented with heme and vitamin K1 for initial screening，and then re-screened on Brinell agar medium supplemented with defibrinated sheep blood，heme and vitamin K1. The selected strains were subjected to observation of morphology and culture characteristics，Gram staining and microscopic examination，physiological and biochemical identification，colony PCR reaction and 16S rRNA conservative sequence determination and analysis to determine the species. ResultThe colonial morphology of selected NG01 strain was off-white，opaque，smooth surface，regular edges，moist，slightly raised，round，and medium-sized. The strain was obligate anaerobic，Gram-negative，no spores，rod-shaped，irregular arrangement，and can ferment glucose，sucrose，mannose，lactose，whereas couldn’t ferment D-sorbitol，inositol，ribose，and didn’t contain oxidase，catalase. The Blast sequence alignment showed that the 16S rRNA similarity between NG01 strain and Bacteroides dorei 175 reached 98.96%.ConclusionThe isolated NG01 strain conforms to the characteristics of Bacteroides in its bacterial morphology，culture characteristics，and physiological and biochemical reaction results.

Keywords： intestinal flora;Bacteroides dorei; isolation and identification; 16S rRNA sequencing