基于Berthelot比色法快速測(cè)定糙米中γ-氨基丁酸含量的體系優(yōu)化

摘 要：目的與方法：Berthelot比色法是目前測(cè)定植物組織中γ-氨基丁酸（GABA）含量的最廣泛和最常用方法，但測(cè)定結(jié)果常常受組織特異性、提取方法和顯色條件等的影響。為能準(zhǔn)確快速地測(cè)定糙米中的GABA含量，本研究基于實(shí)驗(yàn)室已優(yōu)化的Berthelot比色法測(cè)定植物葉片中GABA含量的技術(shù)體系，以蒸餾水為提取劑，從提取料液比、提取溫度、提取時(shí)間、顯色水浴溫度和時(shí)間對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化。結(jié)果：采用Berthelot比色法測(cè)定糙米中GABA含量的最佳提取方法為料液比1 g：20 mL、水浴溫度60 ℃和水浴時(shí)間30 min，最適顯色反應(yīng)條件為顯色水浴溫度60 ℃和顯色時(shí)間10 min。結(jié)論：優(yōu)化后的測(cè)定體系將盡可能地實(shí)現(xiàn)糙米中GABA的充分提取和快速測(cè)定，是一個(gè)準(zhǔn)確可靠、快速經(jīng)濟(jì)和科學(xué)高效的測(cè)定體系。

關(guān)鍵詞：糙米；γ-氨基丁酸（GABA）；Berthelot比色法；測(cè)定體系優(yōu)化

γ-氨基丁酸（GABA）是一種天然的四碳非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛分布于動(dòng)物、植物及微生物中，已成為近些年來的研究熱點(diǎn)^[1-10]。2009年，GABA被我國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品，作為21世紀(jì)倡導(dǎo)的綠色食品和有機(jī)食品的理想配料，并規(guī)定GABA的人體理想保健攝入量是30～100 mg/d^[11-12]。然而，通常生物體內(nèi)的GABA含量甚微，這就迫使人們?nèi)パ邪l(fā)富含GABA的農(nóng)產(chǎn)品或強(qiáng)化食品，作為占世界一半人口主糧的稻米自然而然地成為了首選，在市場(chǎng)上便出現(xiàn)了不同產(chǎn)地和不同品牌的富含GABA的大米。

為了更好地研究生物體、農(nóng)產(chǎn)品或強(qiáng)化食品中GABA的生理活性、保健功能及作用機(jī)制，首要工作就是構(gòu)建一套簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確廉價(jià)和高通量的GABA測(cè)定體系。由于GABA的酸性極強(qiáng)，且自身結(jié)構(gòu)在紫外光區(qū)、可見光區(qū)和熒光區(qū)吸收不靈敏，導(dǎo)致在建立GABA檢測(cè)方法時(shí)存在一定的局限性，大部分方法都需要經(jīng)過衍生過程才能檢測(cè)^[13-14]。大量研究證明，采用Berthelot比色法檢測(cè)樣品中的GABA含量具有較高靈敏度、簡(jiǎn)單易行和快速高通量等優(yōu)點(diǎn)，但需根據(jù)不同樣品的性質(zhì)進(jìn)行自我優(yōu)化^[15]。本研究組在2018—2020年間，對(duì)基于Berthelot比色法測(cè)定植物葉片中GABA含量的體系從測(cè)定波長(zhǎng)、顯色穩(wěn)定性、顯色試劑用量、顯色條件、色素雜質(zhì)去除和提取條件等方面進(jìn)行了較系統(tǒng)的優(yōu)化，建立了一套十分簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確和廉價(jià)的高通量測(cè)定植物葉片中GABA含量的技術(shù)體系^[16]。但在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)，將已優(yōu)化的植物葉片中GABA含量的測(cè)定體系應(yīng)用于糙米中GABA含量的測(cè)定時(shí)，出現(xiàn)了在葉片測(cè)定時(shí)沒有遇到的一些問題，如提取不充分、測(cè)定時(shí)間過長(zhǎng)和顯色效果不好等，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果波動(dòng)性大和重復(fù)性差，這應(yīng)該是葉片和糙米在有機(jī)物組成上的較大差異造成的（如干葉片含纖維素較多，提取較易和較充分；糙米以淀粉為主，提取時(shí)易吸水糊化而阻礙內(nèi)層提?。榱四軠?zhǔn)確測(cè)定出糙米中的GABA含量，就必須針對(duì)現(xiàn)有測(cè)定體系中產(chǎn)生的新問題展開深入系統(tǒng)地研究，以期建立適用于快速、準(zhǔn)確和高效測(cè)定糙米中GABA含量的最佳體系。通過查閱文獻(xiàn)和分析問題，本研究基于Berthelot比色法的基本原理和操作流程，圍繞提取料液比、提取溫度、提取時(shí)間、顯色水浴溫度和顯色水浴時(shí)間等步驟設(shè)置了較系統(tǒng)的優(yōu)化試驗(yàn)，分析其對(duì)糙米中GABA含量測(cè)定的影響，從而尋求出最佳的測(cè)定條件、建立好完善的測(cè)定體系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樂食麥GABA胚芽糙米，上海聚香樓食品有限公司，GABA≥220 mg/kg；GABA標(biāo)準(zhǔn)品，合肥巴斯夫生物科技有限公司，純度≥99%；四硼酸鈉、重蒸酚、次氯酸鈉、無水乙醇和蒸餾水等使用試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 GABA的提取 先用DHG-9101-3SA電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱在80 ℃下將GABA胚芽糙米烘干至恒重，后經(jīng)CY-150型高速多功能粉碎機(jī)粉碎得糙米粉末，采用FA1604型電子天平（精度萬分之一）稱取0.1500 g的糙米粉末于5 mL離心管中，以料液比（g/mL）為1∶20的比例加入蒸餾水（斷水自控電熱蒸餾水器制備），80 ℃恒溫水浴鍋振蕩提取0.5 h，提取液經(jīng)TGL-16C微量高速離心機(jī)以11 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min后，吸取一定體積上清液置5 mL離心管內(nèi)待用。

1.2.2 GABA的含量測(cè)定 采用Berthelot比色法測(cè)定糙米中的GABA含量，基本原理是以苯酚和次氯酸鈉與GABA的游離氨發(fā)生顯色反應(yīng)生成藍(lán)綠色的吲哚酚類物質(zhì)，先通過測(cè)定顯色樣品的吸光度（O.D.），接著根據(jù)同步平行采用GABA標(biāo)樣獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線來查找出樣品的GABA濃度，最后根據(jù)待測(cè)液體積和樣品質(zhì)量來計(jì)算出樣品中的GABA含量。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在基于“1.2.1 GABA的提取”和“1.2.2 GABA的含量測(cè)定”的基礎(chǔ)上，依據(jù)操作流程，設(shè)置相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)處理。以蒸餾水作為提取溶劑，對(duì)提取料液比、提取溫度、提取時(shí)間、顯色水浴溫度和顯色水浴時(shí)間5個(gè)因素進(jìn)行不同梯度的試驗(yàn)設(shè)計(jì)（附表），4次重復(fù)。在UV-5100紫外可見分光光度計(jì)上進(jìn)行比色（波長(zhǎng)為645 nm），先測(cè)定不同試驗(yàn)處理下糙米GABA的O.D.值，后計(jì)算出GABA含量，并采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析不同試驗(yàn)處理對(duì)糙米GABA含量測(cè)定的影響，從而逐步確定出每一個(gè)優(yōu)化項(xiàng)目的最佳參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同料液比的糙米中GABA提取效果差異

從圖1可以看出，GABA的提取效果隨著料液比的增加先顯著驟增后趨于平穩(wěn)，當(dāng)提取劑較少時(shí)（料液比低于1：17.5），測(cè)定的GABA含量顯著較低，即GABA的提取不完全，這可能是因?yàn)榇蟛糠值奶崛┍徊诿追壑械牡矸畚蛎?，?dǎo)致包裹在內(nèi)層的GABA難以外滲出來；當(dāng)料液比為1∶17.5～1∶27.5時(shí)，GABA的提取效果基本保持不變，無顯著差異。因此，為了節(jié)約提取劑用量和便于后期的計(jì)算，建議選擇料液比為1∶20。

2.2 不同水浴提取溫度的糙米中GABA提取效果差異

糙米中GABA的提取效果隨著水浴提取溫度的逐漸升高表現(xiàn)出先顯著增大后趨于基本一致，首個(gè)平穩(wěn)點(diǎn)為60 ℃，60～80 ℃間的水浴提取溫度對(duì)糙米中GABA含量值無顯著影響（圖2）。為此，推薦選用溫度為60 ℃，從而降低電能的消耗、節(jié)約用電成本和減少對(duì)糙米中高溫敏感型有機(jī)物的破壞等。

2.3 不同提取時(shí)間的糙米中GABA提取效果差異

圖3表明，當(dāng)提取時(shí)間為30 min時(shí)，糙米中GABA的提取較完全和含量為最高；當(dāng)提取時(shí)間延長(zhǎng)至45 min時(shí)，GABA的含量則顯著降低，這表明GABA會(huì)隨著提取時(shí)間的增加而降解；當(dāng)提取時(shí)間在45～90 min時(shí)，不同處理下的糙米中GABA含量無顯著差異，這意味著GABA的降解比較迅速，主要發(fā)生在提取時(shí)間的30～45 min內(nèi)；綜合上述情況，在糙米中GABA的水浴提取時(shí)，適宜的提取時(shí)長(zhǎng)為30 min，過長(zhǎng)GABA將發(fā)生降解。

2.4 不同顯色水浴溫度下糙米中GABA含量的差異

顯色反應(yīng)時(shí)，水浴的溫度與時(shí)間是影響反應(yīng)進(jìn)程的關(guān)鍵因素。本研究中（圖4），當(dāng)顯色水浴時(shí)間為20 min時(shí)，糙米中GABA含量隨著水浴溫度的升高表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢(shì)，在水浴溫度為60 ℃時(shí)達(dá)到峰值，顯著高于除50 ℃外的其他處理；當(dāng)溫度高于60 ℃時(shí)，GABA含量顯著降低，這可能是由于溫度過高，破壞了GABA的分子間作用力和分子結(jié)構(gòu)，使GABA逐漸分解或析出，導(dǎo)致GABA含量值下降。鑒于本試驗(yàn)結(jié)果，在測(cè)定糙米中GABA含量時(shí)，建議選擇60 ℃為顯色水浴溫度。

2.5 不同顯色水浴時(shí)間糙米中GABA含量的差異

當(dāng)水浴溫度為60 ℃，顯色水浴時(shí)間為5 min時(shí)的糙米中GABA含量顯著低于10 min后的各水浴時(shí)間處理，且10 min后的各水浴時(shí)間處理間無顯著差異（圖5）；綜合考慮時(shí)耗、能耗及成本的情況下，在顯色水浴溫度為60 ℃時(shí)，最佳的水浴顯色時(shí)間為10 min。

3 討論與結(jié)論

GABA廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，但含量甚微，人們常通過一些強(qiáng)化措施增加農(nóng)產(chǎn)品或加工食品中的GABA來滿足人類健康的需求^[17-20]。Berthelot比色法雖是目前測(cè)定植物組織中GABA含量的最廣泛和最常用方法，但在具體使用中易受組織中的色素、顯色液的穩(wěn)定性及游離氨等的干擾，更與組織特異性有關(guān)^[21-26]。萬藍(lán)婷等^[16]為排除不良因素對(duì)植物葉片中GABA含量測(cè)定結(jié)果的影響，圍繞測(cè)定波長(zhǎng)、顯色穩(wěn)定性、顯色試劑用量、顯色條件、色素雜質(zhì)去除和提取條件等進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，提高了植物葉片中GABA含量測(cè)定的精準(zhǔn)度和靈敏度，但優(yōu)化后的測(cè)定體系在測(cè)定糙米中GABA含量時(shí)出現(xiàn)了未預(yù)料到的問題。

為了能準(zhǔn)確快速地測(cè)定糙米中GABA含量，研究人員開展了部分針對(duì)性的研究，取得了一些成果。在糙米中GABA的提取方面，段智紅等^[27]采用HPLC法測(cè)定海稻米中GABA含量的最佳提取料液比為1 g：15 mL；韓延麗等^[28]采用Berthelot比色法測(cè)定糙米中GABAG的料液比為1 g：7 mL（室溫在每分鐘200次的振蕩器上振蕩4 h）。本研究獲得Berthelot比色法測(cè)定糙米中GABA的最佳提取料液比為1 g：20 mL。同時(shí)，本研究還對(duì)提取時(shí)的水浴溫度和時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，篩選出最適水浴溫度為60 ℃、水浴時(shí)間為30 min，此方法下的GABA提取最充分、含量最高，這比曹磊和陳恩成等^[29-30]將發(fā)芽糙米樣品分別置于60 ℃和70 ℃水浴鍋內(nèi)振蕩提取2 h要縮短75%的提取時(shí)間、節(jié)省75%的用電量，更加高效和經(jīng)濟(jì)，有利于實(shí)現(xiàn)大批量樣品的快速提取。就顯色反應(yīng)條件而言，陳恩成和李秀娟等^[30，24]認(rèn)為，沸水浴中加熱10～15 min可達(dá)理想的反應(yīng)條件，而本研究表明最佳顯色條件為水浴溫度60 ℃、顯色時(shí)間10 min，即顯色反應(yīng)溫度較低，顯色水浴時(shí)間縮短33%，可避免高溫下GABA提取損失，同時(shí)減少用電量的消耗。

綜上可知，本研究確定了以蒸餾水為提取劑，采用Berthelot比色法測(cè)定糙米中GABA含量的最佳提取方法為料液比1 g：20 mL、水浴溫度60 ℃、水浴時(shí)間30 min，最適顯色反應(yīng)條件為顯色水浴溫度60 ℃、顯色時(shí)間10 min。與目前普遍使用的測(cè)定體系相比，優(yōu)化后的測(cè)定體系將更有利于實(shí)現(xiàn)糙米中GABA的充分提取和快速測(cè)定，是一個(gè)準(zhǔn)確高效、快速經(jīng)濟(jì)的技術(shù)體系，可用于大批量糙米中GABA含量的鑒定、篩選與評(píng)價(jià)，將為富含GABA糙米的品種改良與培育及GABA強(qiáng)化食品的研制與推廣提供準(zhǔn)確可靠的科學(xué)依據(jù)和技術(shù)保障。

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System Optimizationon on Berthelot Colorimetric Method for

Determinating GABA Content in Brown Rice

FANG Qi，LAN Qiu-xia，WAN Lan-ting，CHENG Jian-feng

（College of Agronomy，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China）

Abstract： Objective and MethodBerthelot colorimetric method is the most widely and commonly used method for the determination of GABA content in plant tissues，but the results are often affected by some factors such as tissue specificity，extraction methods and color conditions.In order to accurately and rapidly determine the GABA content in brown rice，in this study，on the basis of the optimized Berthelot colorimetric method for the determination of GABA content in plant leaves，distilled water was used as the extraction agent，and the determination system was optimized from the ratio of solid to liquid，extraction temperature and time，and color-developing temperature and time in water bath.ResultThe optimum extraction method of GABA content in brown rice by Berthelot Colorimetric Method was solid-liquid ratio of 1 g ：20 mL，60 ℃ and 30 min in water bath.The optimum color reaction conditions were 60 ℃ and 10 min in water bath.ConclusionThe optimized determination system will achieve the full extraction and rapid determination of GABA in brown rice as much as possible，which is an accurate，reliable，rapid，economic，scientific and efficient determination system.

Keywords：brown rice;γ-Aminobutyric Acid（GABA）;Berthelot Colorimetric Method;determination system optimization