高通量測序結(jié)合生物信息學分析鑒定microRNA在顱內(nèi)動脈瘤中的潛在作用

摘要：目的 "通過二代測序技術(shù)以及生物信息學方法篩選在顱內(nèi)動脈瘤（IA）中失調(diào)的miRNA，并探索其可能參與的生物學功能。方法 "在GEO數(shù)據(jù)庫編號為GSE66239的公共數(shù)據(jù)集中篩選IA和顳淺動脈組織間差異表達的miRNA，另外收集2021-2022年牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院收治的因顱內(nèi)動脈瘤破裂出血行開顱動脈瘤夾閉術(shù)患者的IA組織和顳淺動脈組織，進行miRNA測序分析，驗證公共數(shù)據(jù)集的結(jié)果。通過miRDB 數(shù)據(jù)庫和miRWalk數(shù)據(jù)庫對miRNA的靶基因進行預(yù)測，使用R軟件包clusterProfiler進行miRNA靶基因的功能富集分析，使用STRING數(shù)據(jù)庫進行蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）分析，并通過Cytescape軟件進行可視化，提取PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。基于GSE122897數(shù)據(jù)集中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用單樣本基因集富集分析（ssGSEA）評估IA和對照組織免疫微環(huán)境中16種免疫細胞的浸潤分數(shù)和12種免疫狀態(tài)評分。結(jié)果 "在GSE66239數(shù)據(jù)集中，相比于正常顳淺動脈組織，IA組織中有54個miRNA上調(diào)，1010個miRNA下調(diào)；臨床標本中，相比于正常顳淺動脈組織，IA組織中有23個miRNA上調(diào)，29個miRNA下調(diào)。hsa-miR-3176、hsa-miR-1246和hsa-miR-539-3P在GSE66239數(shù)據(jù)集及臨床標本中均呈現(xiàn)出IA組織的低表達。在miRDB數(shù)據(jù)庫和miRWalk數(shù)據(jù)庫中分別預(yù)測到738個和116個hsa-miR-539-3P靶向的mRNA，交集后得到9個靶向mRNA，407個和711個hsa-miR-1246靶向的mRNA，交集后得到34個mRNA，482個和3486個hsa-miR-3176靶向的mRNA，交集后得到187個mRNA。功能富集分析顯示hsa-miR-3176、hsa-miR-1246和hsa-miR-539-3P的靶基因主要與MAPK信號通路、FGF通路、CD8+T細胞受體下游通路、S1P通路、G蛋白信號通路、ERBB信號通路、白介素信號、神經(jīng)遞質(zhì)釋放等通路有關(guān)。由hsa-miR-3176，hsa-miR-1246和hsa-miR-539-3P靶基因所構(gòu)成的PPI網(wǎng)絡(luò)當中包含121個節(jié)點，117條互作關(guān)系；其中ERBB4、FGF1、CBL、GNAO1、GNAZ、PTPRT、KCNB1、KCNJ2、POLR2J2和CD247為PPI網(wǎng)絡(luò)當中的Top10 核心基因，這些核心基因均由hsa-miR-3176調(diào)控。功能富集分析結(jié)果顯示，這些核心基因與ERBB信號通路、Rap1信號通路、MAPK信號通路、PI3K-AKT信號通路、CXCR4信號通路、CXCR3信號通路、CD8+T細胞受體信號通路等生物學過程相關(guān)。與顳淺動脈組織相比，IA當中CD8+T細胞、巨噬細胞、肥大細胞、中性粒細胞、輔助性T細胞、Th1細胞、TIL細胞以及調(diào)節(jié)性T細胞的浸潤量增加，APC共刺激評分、APC共抑制評分、CCR評分、免疫檢查點評分、HLA評分、促炎評分、副炎癥評分、T細胞共刺激評分、T細胞共抑制評分、2型免疫反應(yīng)評分均升高。相關(guān)性分析顯示，核心基因與免疫細胞浸潤以及免疫狀態(tài)評分具有相關(guān)性。結(jié)論 "hsa-miR-3176，hsa-miR-1246和hsa-miR-539-3P在IA組織中呈低表達，且其低表達會導(dǎo)致顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：顱內(nèi)動脈瘤；微小RNA；炎癥微環(huán)境

中圖分類號：R732.2+1 " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標識碼：A " " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2023.24.001

文章編號：1006-1959（2023）24-0001-13

Identification of the Potential Role of microRNA in Intracranial Aneurysms Based on

High-throughput Sequencing Combined with Bioinformatics Analysis

ZHANG De-guo1，LIANG Shao-dong1，LI Hong-zhe1，ZHAO You-zhi1，LIU Kui-li1，ZHUANG Ya-yan1，HU Huan-xue2

（1.Department of Neurosurgery，Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157000，Heilongjiang，China;

2.Department of Cardiology，Mudanjiang First People's Hospital，Mudanjiang 157000，Heilongjiang，China）

Abstract：Objective "To screen the dysregulated miRNAs in intracranial aneurysms （IA） by next-generation sequencing and bioinformatics methods， and to explore their possible biological functions.Methods "The differentially expressed miRNAs between IA and superficial temporal artery tissues were screened in the public data set numbered GSE66239 in the GEO database. In addition， IA tissues and superficial temporal artery tissues of patients with rupture and hemorrhage of intracranial aneurysm who underwent craniotomy aneurysm clipping in Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical University from 2021 to 2022 were collected for miRNA sequencing analysis to verify the results of the public data set. The target genes of miRNAs were predicted by miRDB database and miRWalk database. The functional enrichment analysis of miRNA target genes was performed using the R software package clusterProfiler. The protein-protein interaction network （PPI） analysis was performed using the STRING database， and visualized by Cytescape software to extract the core genes in the PPI network. Based on the transcriptome data in the GSE122897 dataset， single-sample gene set enrichment analysis （ssGSEA） was used to evaluate the infiltration scores of 16 immune cells and 12 immune status scores in the immune.Results "In the GSE66239 dataset， 54 miRNAs were up-regulated and 1010 miRNAs were down-regulated in IA tissues compared with normal superficial temporal artery tissues. In clinical specimens， compared with normal superficial temporal artery tissue， 23 miRNAs were up-regulated and 29 miRNAs were down-regulated in IA tissue. hsa-miR-3176， hsa-miR-1246 and hsa-miR-539-3P showed low expression in IA tissues in GSE66239 dataset and clinical specimens. And 738 and 116 hsa-miR-539-3P-targeted mRNAs were predicted in the miRDB database and the miRWalk database， respectively， and 9 targeted mRNAs were obtained after intersection. Correspondingly， hsa-miR-1246 obtained 407 and 711 targeted mRNAs in the miRDB database and the miRWalk database， respectively， and 34 mRNAs were obtained after intersection. hsa-miR-3176 obtained 482 and 3486 targeted mRNAs in the miRDB database and the miRWalk database， respectively， and 187 mRNAs were obtained after intersection. Functional enrichment analysis showed that the target genes of the above three miRNA were mainly related to the MAPK signaling pathway， FGF pathway， CD8+T cell receptor downstream pathway， S1P pathway， G protein signaling pathway， ERBB signaling pathway， interleukin signaling， neurotransmitter release and other pathways. The PPI network composed of hsa-miR-3176， hsa-miR-1246 and hsa-miR-539-3P target genes contained 121 nodes and 117 interactions. Among them， ERBB4， FGF1， CBL， GNAO1， GNAZ， PTPRT， KCNB1， KCNJ2， POLR2J2 and CD247 are the top 10 core genes in the PPI network， and these core genes were regulated by hsa-miR-3176. Functional enrichment analysis showed that these core genes were related to ERBB signaling pathway， Rap1 signaling pathway， MAPK signaling pathway， PI3K-AKT signaling pathway， CXCR4 signaling pathway， CXCR3 signaling pathway， CD8+T cell receptor signaling pathway and other biological processes. Compared with superficial temporal artery tissue， the infiltration of CD8+T cells， macrophages， mast cells， neutrophils， helper T cells， Th1 cells， TIL cells and regulatory T cells in IA increased， APC co-stimulation score， APC co-inhibition score， CCR score， immune examination point score， HLA score， pro-inflammatory score， para-inflammatory score， T cell co-stimulation score， T cell co-inhibition score and type 2 immune response score increased. Correlation analysis showed that core genes were correlated with immune cell infiltration and immune status scores.Conclusion "hsa-miR-3176， hsa-miR-1246 and hsa-miR-539-3P are lowly expressed in IA tissues， and their low expression will lead to the occurrence of intracranial aneurysms.

Key words：Intracranial Aneurysm;microRNA;Inflammatory microenvironment

顱內(nèi)動脈瘤（intracranial aneurysm，IA）破裂引起的蛛網(wǎng)膜下腔出血是最危險的腦血管疾病之一，死亡率超過30%，并導(dǎo)致嚴重的神經(jīng)功能障礙和殘疾[1-4]。IA家族史、女性、吸煙、飲酒、炎癥和高血壓等是IA發(fā)展、生長和破裂的危險因素[5，6]。然而，導(dǎo)致IA形成和破裂的細胞和分子機制尚未完全闡明。miRNA在正常生理和病理生理過程的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，這些過程參與了包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病在內(nèi)的許多人類疾病[7]。如血管平滑肌細胞中miRNA生物發(fā)生機制蛋白DICER的缺乏會導(dǎo)致血管形成缺陷和胚胎致死性。此外，miRNA在損傷后的血管壁當中異常表達。多項研究證實[8，9]，miRNA在IA中存在調(diào)節(jié)失調(diào)。有研究報道了與正常動脈相比，動脈瘤組織中有超過150個miRNA異常表達。IA當中表達失調(diào)的miRNA發(fā)揮重要作用。例如，miR-23b在IA組織中降低，其靶向的磷酸酶和緊張素同源物升高，這是平滑肌細胞病理血管重塑過程中增殖、分化和細胞因子產(chǎn)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[10]。miR-143和miR-145在IA組織和血漿中顯著下調(diào)，通過維持或抑制分化在控制血管平滑肌表型中發(fā)揮重要作用。與miR-143和miR-145的下降一致，它們的靶基因如ADAMTS2、COL1A1、COL5A1和COL5A2上調(diào)，這些基因參與細胞外基質(zhì)重塑、膠原合成和代謝。此外，miR-143和miR-145調(diào)節(jié)KLF5的表達[11]，這是一種在血管重塑中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，在病理條件下被激活的平滑肌細胞中強烈誘導(dǎo)。此外，miRNA還是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)器[12]。miR-125b在IA組織中降低[9]，它可能靶向一氧化氮合酶1（NOS1），并促進巨噬細胞介導(dǎo)的血管平滑肌細胞凋亡。miR-155是一種主要的炎性miRNA，具有免疫細胞特異性。與破裂的IA組織相比，miR-155在未破裂的IA組織中表達上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-2為miR-155靶點[13]。miR-21在未破裂的IA組織中高度上調(diào)，參與血管組織中的細胞增殖、遷移和凋亡過程[14]?？傊琺iRNA在IA的發(fā)病機制中具有很強的作用。本研究擬通過第二代基因測序技術(shù)和生物信息學方法篩選IA患者動脈瘤組織中表達失調(diào)的miRNA，并通過miRNA的靶基因探索失調(diào)的miRNA可能發(fā)揮的生物學功能，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1公共數(shù)據(jù)收集及處理 "于GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中分別下載數(shù)據(jù)集編號為GSE66239和GSE122897的數(shù)據(jù)。GSE66239數(shù)據(jù)集中包含7例顱內(nèi)動脈瘤組織和10例顳淺動脈組織的miRNA測序數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)平臺為GPL19117；GSE122897數(shù)據(jù)集中包含來自于臨床患者的44例IA組織和16例顳淺動脈組織的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)格式為Counts數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)平臺為GPL16791，Illumina HiSeq 2500。所有數(shù)據(jù)都根據(jù)相應(yīng)平臺的注釋數(shù)據(jù)利用R軟件4.1.3版本進行注釋。隨后將GSE122897數(shù)據(jù)集的Counts數(shù)據(jù)取Log2（X+1）進行標準化，其中X為目標RNA的表達量。

1.2臨床樣本的測序分析 "選取2021-2022年牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院因IA破裂出血，行開顱動脈瘤夾閉術(shù)的患者。根據(jù)牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院倫理委員會批準的協(xié)議，所有患者均被告知樣本用途并簽署知情同意書。神經(jīng)外科手術(shù)醫(yī)生在開顱夾閉過程中，切除殘余動脈瘤壁不會影響治療結(jié)果的基礎(chǔ)選擇。共采集4對IA患者開顱手術(shù)夾閉動脈瘤組織樣本及顳淺動脈組織樣本。樣本收集后立即放入-80 ℃冰箱保存。測序簡要流程為：提取的總RNA樣品經(jīng)瓊脂糖電泳和Nanodrop質(zhì)檢和定量后，構(gòu)建好文庫，用Agilent 2100 Bioanalyzer 進行文庫質(zhì)量測定，混合好的不同樣品的測序文庫，通過0.1 M NaOH變性生成單鏈DNA，使用TruSeq Rapid SR Cluster Kit （#GD-402-4001，Illumina）試劑，在Illumina flow cell擴增為簇（cluster），根據(jù)供應(yīng)商說明在Illumina NextSeq 500測序儀上進行50循環(huán)測序。測序數(shù)據(jù)經(jīng)過QC以評估測序數(shù)據(jù)是否可以用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析，QC后經(jīng)過預(yù)處理過濾步驟后，判斷比對結(jié)果是否可以用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析；如果比對結(jié)果良好，則進行miRNA表達定量分析，基于miRNA表達水平各項分析，差異表達篩選，miRNA靶基因分析，靶基因GO功能顯著性富集分析，靶基因 Pathway顯著性富集分析。詳細RNA測序流程如下。

1.2.1文庫構(gòu)建 "試劑：NEB Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina；儀器：NanoDrop ND-1000；步驟：使用每個樣品的總RNA制備miRNA測序文庫，包括以下步驟：①3'接頭連接；②5'接頭連接；③cDNA 合成；④PCR擴增；⑤挑選135～155 bp的PCR擴增片段（對應(yīng)15～35 nt的小RNAs）；將文庫變性為單鏈DNA分子，在Illumina fow cell上捕獲，原位擴增為簇（cluster），并根據(jù)供應(yīng)商說明，在Illumina NextSeq 500 測序儀上進行50個cycle測序。

1.2.2測序 "試劑：TruSeq Rapid SR Cluster Kit（#GD-402-4001，Illumina）；儀器：Illumina NextSeq 500；步驟：將文庫變性為單鏈DNA分子，在Illumina fow cell上捕獲，原位擴增為簇（cluster），并根據(jù)供應(yīng)商說明，在Illumina NextSeq 500 測序儀上進行50個cycle測序。隨后對測序數(shù)據(jù)進行分析，分析流程如下：①測序質(zhì)控：瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA樣品的完整性。NanoDrop ND-1000 測定總 RNA 準確的濃度（abs 260）以及蛋白質(zhì)污染等情況（ratio abs260/abs230）。Agilent 2100 Bioanalyzer 評估測序文庫的質(zhì)量和濃度。PCR方法進行最終文庫定量。llumina測序儀產(chǎn)生FASTQ格式的原始序列（raw sequencing data）。評估測序質(zhì)量時對每個樣品的原始序列進行統(tǒng)計Q30：Q=-10log10（P），例如Q=30代表錯誤識別的概率是0.1%，即錯誤率0.1%，正確率99.9%。②測序數(shù)據(jù)比對：測序質(zhì)控后，原始數(shù)據(jù)QC后經(jīng)過預(yù)處理（使用cutadapt去掉3’接頭序列并過濾掉過短的片段＜17 bp）得到trimmed reads，使用bowtie 比對到參考基因組上，比對的統(tǒng)計信息在下表列出。一般樣品Reads的比對率約為40%～90%。比對率受很多因素影響，包括樣品RNA質(zhì)量、文庫構(gòu)建方法、測序方法、比對軟件及參數(shù)等都可以影響比對率。③miRNA 表達定量分析：miRNA的表達定量由軟件mirdeep2通過比對結(jié)果到已知的基因組并統(tǒng)計得到。miRNA表達量閱值為每個組中CPM均值超過＞1的miRNA視為在分組中表達并進行統(tǒng)計分析Counts per million reads（CPM）的具體計算公式如下：CPM=C×106/N，C為比對到某基因上的reads數(shù)目；N為比對到所有基因的總reads數(shù)目。

1.3差異分析 "編號為GSE66239的miRNA測序數(shù)據(jù)已經(jīng)由數(shù)據(jù)原作者進行標準化，因此使用R軟件4.1.3版本當中的“Limma”程序包對7例IA組織和10例顳淺動脈組織的miRNA進行差異分析。本研究基于臨床樣本的測序數(shù)據(jù)為Counts格式，采用R軟件4.1.3版本當中的“edgR”程序包對4例IA組織和4例顳淺動脈組織的miRNA進行差異分析。以差異倍數(shù)（Fold Change）的絕對值≥1.5倍，且P＜0.05為閾值定義差異表達的miRNA。所得結(jié)果使用R軟件4.1.3版本當中的“ggplot2”程序包進行可視化，并以熱圖和火山圖的方式呈現(xiàn)。

1.4 miRNA靶基因預(yù)測 "分別通過miRDB（http：//www.mirdb.org/）[15]數(shù)據(jù)庫和miRWalk（http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）[16]數(shù)據(jù)庫預(yù)測IA組織和顳淺動脈組織間所差異表達miRNA的靶點mRNA。為提升可信度，將通過上述兩個數(shù)據(jù)庫預(yù)測的靶點mRNA進行交集。

1.5功能富集分析 "使用KEGG rest API（https：//www.kegg.jp/kegg/rest/keggapi.html）獲取最新的KEGG通路的基因注釋；對于PID通路富集分析，從Molecular Signatures Database（http：//www.gsea-msigdb.org/gsea/downloads.jsp）下載c2.cp.pid.v7.4.symbols.gmt子集合；對于Wiki通路富集分析，從Molecular Signatures Database下載c2.cp.wikipathways.v7.4.symbols.gmt子集合；對于Reactome通路富集分析，從Molecular Signatures Database下載c2.cp.reactome.v7.4.symbols.gmt子集合；對于基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析，從Molecular Signatures Database下載c5.go.bp.v7.4.symbols.gmt子集合；將以上集合作為背景，把基因映射到背景集合中，使用R軟件包clusterProfiler進行富集分析，以獲得基因集富集的結(jié)果。以上所有富集分析均設(shè)定最小基因集為5，最大基因集為5000，P＜0.05為顯著富集。

1.6 PPI網(wǎng)絡(luò) "STRING（https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫是用于預(yù)測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫。它收集了許多物種的蛋白質(zhì)相互作用信息，既包括試驗驗證的，也包括生物信息學方法推斷的；可以是蛋白質(zhì)之間直接物理相互作用，也可以為間接的功能相關(guān)性[17]。通過該數(shù)據(jù)庫，可以從中搜尋感興趣的蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系，例如直接的結(jié)合關(guān)系，或者共處的上下游調(diào)控通路等，為理解生物體中復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供見解。截至目前，該數(shù)據(jù)庫中收錄了超過5000個物種、2千多萬種蛋白、30多億個相互作用的信息。為探索目標基因所編碼蛋白的相互作用關(guān)系，本研究使用STRING數(shù)據(jù)庫進行蛋白-蛋白互作分析，進入數(shù)據(jù)庫頁面后，輸入miRNA所調(diào)控的mRNA編碼的蛋白名稱，設(shè)置可信程度≥0.4，提交得到蛋白-蛋白互作信息。隨后，將互作信息導(dǎo)入Cytescape軟件進行可視化，并通過該軟件當中的cytoHubba插件提取出PPI網(wǎng)絡(luò)當中的核心基因。

1.7免疫浸潤分析 "基于GSE122897數(shù)據(jù)集當中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，本研究通過ssGSEA算法評估了顱內(nèi)動脈瘤和對照組織免疫微環(huán)境當中16種免疫細胞的浸潤分數(shù)和12種免疫狀態(tài)評分。免疫細胞包括T細胞，B細胞，肥大細胞，樹突狀細胞，巨噬細胞，NK細胞和中性粒細胞等；免疫狀態(tài)包括APC共刺激評分，APC抑制評分，細胞毒性評分，T細胞共刺激評分，T細胞共抑制評分，1型IFN免疫反應(yīng)評分，2型IFN免疫反應(yīng)評分等。

1.8統(tǒng)計學方法 "根據(jù)連續(xù)變量是否服從正態(tài)分布選擇t檢驗或Mann-Whitney U檢驗；相關(guān)性分析均采用Spearman相關(guān)性分析；所有統(tǒng)計學分析由R軟件4.1.3完成，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 miRNA差異分析 "在GSE66239數(shù)據(jù)集中，與正常顳淺動脈組織相比，IA組織中有54個miRNA上調(diào)，1010個miRNA下調(diào)。圖1A為火山圖，其中上調(diào)的miRNA數(shù)量較少，分布比較散在，而下調(diào)的miRNA數(shù)目較多，分布比較集中。圖1B為熱圖，展示了在IA組織當中上調(diào)最顯著的Top50以及下調(diào)最顯著的Top50基因。本研究收集的臨床標本中，與正常顳淺動脈組織相比，IA組織中有23個miRNA上調(diào)，29個miRNA下調(diào)。圖1C中Up-regulated代表在IA組織中上調(diào)的miRNA，Down-regulated代表下調(diào)的miRNA。圖1D為23個上調(diào)miRNA和29個下調(diào)miRNA在4例IA組織和4例顳淺動脈組織中的表達。對GSE66239數(shù)據(jù)集以及本研究臨床樣本得出的差異miRNA進行交集，結(jié)果表明兩組數(shù)據(jù)中沒有在顱內(nèi)動脈瘤組織中共同上調(diào)的miRNA（圖1E），有3個共同下調(diào)的miRNA，分別為hsa-miR-3176，hsa-miR-1246和hsa-miR-539-3P（圖1F）。將3個下調(diào)miRNA用于后續(xù)分析。

2.2差異miRNA的靶點預(yù)測 "通過miRDB和miRWalk數(shù)據(jù)庫預(yù)測hsa-miR-3176，hsa-miR-1246和hsa-miR-539-3P的靶點mRNA并取得交集。分別在miRDB數(shù)據(jù)庫和miRWalk數(shù)據(jù)庫中預(yù)測到738個和116個hsa-miR-539-3P靶向的mRNA，交集后得到9個靶向mRNA（圖2A），hsa-miR-539-3P與其9個靶點mRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)見圖2B。相應(yīng)地，在miRDB數(shù)據(jù)庫和miRWalk數(shù)據(jù)庫中分別得到407個和711個hsa-miR-1246靶向的mRNA，交集后得到34個mRNA（圖2C），hsa-miR-1246及其靶點的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)見圖2D。在miRDB數(shù)據(jù)庫和miRWalk數(shù)據(jù)庫當中分別得到482個和3486個hsa-miR-3176靶向的mRNA，交集后得到187個mRNA（圖2E），hsa-miR-1246及其靶點的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)見圖2F。

2.3差異miRNA靶點的功能富集分析 "KEGG通路富集分析顯示，hsa-miR-3176、hsa-miR-1246和hsa-miR-539-3P的靶點基因主要與MAPK信號通路、長期抑郁、黏蛋白型O聚糖生物合成、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的合成有關(guān)（圖3A）。PID富集分析顯示，這些基因主要與FGF通路、CD8+T細胞受體下游通路、凝血酶PAR1通路、S1P通路等信號通路有關(guān)（圖3B）。WP富集分析顯示這些靶基因主要與MAPK信號通路、G蛋白信號通路、銅穩(wěn)態(tài)等過程有關(guān)（圖3C）。Reactome富集分析顯示，這些基因主要與ERBB信號通路、白介素信號、神經(jīng)遞質(zhì)釋放等有關(guān)（圖3D）。GO富集分析顯示，這些基因主要與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞遷移、細胞形態(tài)發(fā)生等生物學過程有關(guān)（圖3E）。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 "為了解hsa-miR-3176，hsa-miR-1246和hsa-miR-539-3P調(diào)控的mRNA所編碼蛋白之間的互作關(guān)系并尋找出核心基因，通過String數(shù)據(jù)庫進行蛋白-蛋白互作分析并使用Cytoscape軟件進行可視化。這些靶基因所編碼蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)見圖4A，去除沒有互作關(guān)系的節(jié)點后，網(wǎng)絡(luò)當中包含121個節(jié)點，117條互作關(guān)系。其中，ERBB4、CD274、BACE1等基因處于網(wǎng)絡(luò)中的核心位置，它們所參與的互作關(guān)系最多。隨后，通過Cytoscape軟件當中的cytoHubba工具鑒定PPI網(wǎng)絡(luò)當中的核心基因，結(jié)果顯示ERBB4、FGF1、CBL、GNAO1、GNAZ、PTPRT、KCNB1、KCNJ2、POLR2J2和CD247為PPI網(wǎng)絡(luò)當中的Top10核心基因（圖4B）。并且這些核心基因均由hsa-miR-3176調(diào)控（圖4C）。KEGG功能富集分析結(jié)果顯示，這些核心基因與長期抑郁、ERBB信號通路、Rap1信號通路、MAPK信號通路、PI3K-AKT信號通路有關(guān)（圖4D）。PID富集分析顯示，核心基因與CXCR4信號通路、CXCR3信號通路、ERBB信號通路、S1P信號、CD8+T細胞受體信號通路有關(guān)（圖4E）。WP富集分析顯示核心基因與ERBB信號通路、T細胞受體信號等生物學過程相關(guān)（圖4F）。Reactome富集分析顯示，核心基因與神經(jīng)系統(tǒng)、MAPK信號、PI3K-AKT信號、FGFR信號通路等生物學過程相關(guān)（圖4G）。GO富集分析顯示這些核心基因主要與酶聯(lián)受體蛋白信號、轉(zhuǎn)錄活性等過程相關(guān)（圖4H）。

2.5 hsa-miR-3176的靶基因與動脈瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系 "通過ssGSEA算法計算GSE122897數(shù)據(jù)集44例IA組織以及16例顳淺動脈組織當中的免疫細胞（圖5A）及免疫狀態(tài)（圖5B）評分。結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)與顳淺動脈組織相比，IA中CD8+T細胞、巨噬細胞、肥大細胞、中性粒細胞、輔助性T細胞、Th1細胞、TIL細胞以及調(diào)節(jié)性T細胞的浸潤量增加（圖5C），APC共刺激評分、APC共抑制評分、CCR評分、免疫檢查點評分、HLA評分、促炎評分、副炎癥評分、T細胞共刺激評分、T細胞共抑制評分、2型免疫反應(yīng)評分均升高（圖5D）。相關(guān)性分析顯示，CD247表達量與樹突狀細胞、B細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、肥大細胞、中性粒細胞、NK細胞、輔助性T細胞、Tfh細胞、Th1細胞、Th2細胞的浸潤量呈正相關(guān)，而ERBB4、KCNB1、PTPRT與免疫細胞浸潤分數(shù)呈負相關(guān)（圖5E）。CD247表達量與APC共刺激評分、APC共抑制評分、免疫檢查點評分、細胞毒性評分、HLA評分、促炎評分、1類MHC評分、副炎癥評分、T細胞共抑制評分、T細胞共刺激評分呈正相關(guān)，而ERBB4、KCNB1、PTPRT與這些免疫狀態(tài)分數(shù)呈負相關(guān)（圖5F）。FGF1與激活狀態(tài)的樹突狀細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、Th2細胞、APC共刺激評分、HLA評分、T細胞共刺激評分呈負相關(guān)（圖5E、5F）。GNAO1與巨噬細胞、中性粒細胞、副炎癥評分、T細胞共抑制評分、APC共刺激評分、APC共抑制評分呈負相關(guān)（圖5E、5F）。

3討論

大多數(shù)IA直到破裂時才被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致蛛網(wǎng)膜下腔出血?；颊咄ǔ?jīng)歷突然頭痛，通常伴有惡心和嘔吐、嗜睡、意識障礙、視覺異常和腦膜炎[18]。高達17%的患者在IA破裂后立即死亡，另有25%的患者在醫(yī)院護理期間死亡。破裂后24 h內(nèi)仍有較大概率發(fā)生再出血，約為15%[19]。反復(fù)蛛網(wǎng)膜下腔出血的死亡率高達50%。隨著時間的推移，再出血的風險逐漸降低到每年約3%的恒定水平。動脈瘤破裂的后果極其嚴重，1/3的存活患者在日后的生活當中需要依賴護理人員，只有20%的患者生活質(zhì)量沒有下降[20]。因此，迫切需要了解IA的分子機制，為其治療提供理論支持。

miRNA的失調(diào)與許多腦血管疾病的病因有關(guān)，miRNA表達的改變在IA中已有報道[21]。本研究使用公共的miRNA測序數(shù)據(jù)分析，并通過收集臨床標本進行miRNA測序，發(fā)現(xiàn)與對照組織相比，IA組織中有3個下調(diào)的miRNA，分別為hsa-miR-3176、hsa-miR-1246和hsa-miR-539-3P。

hsa-miR-1246是通過應(yīng)用高通量測序技術(shù)在人類胚胎干細胞中首次識別的一種miRNA。目前大多數(shù)的研究均顯示其在癌變過程中的作用。miR-1246已被發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌、乳腺癌、腎癌、口腔癌、喉癌、胰腺癌和卵巢癌以及黑色素瘤和膠質(zhì)瘤中發(fā)揮致癌作用[22-24]。然而關(guān)于其在IA當中的作用仍不清楚。目前僅有的一項研究描述了miR-1246在IA當中的診斷作用，研究發(fā)現(xiàn)IA患者血清中hsa-miR-1246表達上調(diào)，并可作為IA的診斷標志物[25]。這與本研究的結(jié)果相矛盾，本研究的臨床標本以及數(shù)據(jù)集GSE66239的差異分析都顯示hsa-miR-1246在IA組織中表達下調(diào)，因此hsa-miR-1246在IA中的表達以及生物學功能仍需進一步的研究證實。

目前關(guān)于hsa-miR-539-3P和hsa-miR-3176的研究較少。hsa-miR-539-3P在系統(tǒng)性硬化伴肺動脈高壓時表達失調(diào)[26]。hsa-miR-3176抑制FOXO3/Bcl-6信號通路，使得K562/G細胞系對伊馬替尼更敏感[27]。此外，hsa-miR-3176可作為肺鱗癌的預(yù)后標志物[28]。但是關(guān)于hsa-miR-539-3P和hsa-miR-3176在IA中的作用還未見報道，本研究證實了hsa-miR-539-3P和hsa-miR-3176在IA中表達失調(diào)，并可能作為IA的治療靶點。本研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-3176為IA的核心miRNA，因為PPI網(wǎng)絡(luò)顯示它的靶點基因在IA中處于較為核心的位置。在hsa-miR-3176的10個靶點ERBB4、FGF1、CBL、GNAO1、 GNAZ 、PTPRT、 KCNB1、KCNJ2、POLR2J2和CD247中，F(xiàn)GF1被證明與IA發(fā)病有關(guān)，KCNI2被證明在IA中表達上調(diào)，這表明hsa-miR-3176下調(diào)可能使FGF1和KCNI2的抑制作用解除，促進IA的發(fā)生發(fā)展。

絲裂原激活蛋白激酶（MAPKs）是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，兩個MAPKs：MAPK1/ERK2和MAPK3/ERK1，在MAPK/ERK信號通路中發(fā)揮核心作用。通常，它們控制著各種轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子通過磷酸化蛋白激酶調(diào)控一系列基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因涉及內(nèi)皮細胞增殖、細胞骨架和血管重構(gòu)。此外，MAPK級聯(lián)可被廣泛的細胞外刺激激活，如生長因子、細胞因子。在動物實驗中，在氣球損傷的動脈和高血壓血管組織中可以看到ERK的快速激活。此外，ERK在體外大鼠主動脈血管平滑肌細胞中被激活，以應(yīng)對循環(huán)應(yīng)變和剪切應(yīng)力。然而，與循環(huán)應(yīng)變相比，培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞在剪切應(yīng)力下的ERK活性更高。此外，也有報道稱MAPKs參與了miRNA表達的調(diào)控。然而，miRNA和MAPKs在IA病理中的作用尚不清楚。本研究結(jié)果表明，hsa-miR-3176、hsa-miR-1246和hsa-miR-539-3P的靶基因與MAPK通路密切相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)IA組織中免疫細胞浸潤失調(diào)，如CD8+T細胞，巨噬細胞，中性粒細胞，肥大細胞均在IA組織中表達上調(diào)。單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞等炎癥細胞在血管壁的募集和浸潤是IA形成和進展的關(guān)鍵階段。炎癥細胞的浸潤是炎癥細胞因子的主要來源，炎癥細胞因子具有多種作用，包括內(nèi)皮細胞和免疫細胞的調(diào)節(jié)、激活、增殖、遷移和凋亡。滲透后，炎癥細胞不僅產(chǎn)生促炎細胞因子，還分泌基質(zhì)降解膠原酶和促進動脈瘤形成的蛋白酶進展[29]。在本研究中，hsa-miR-3176的靶點基因CD276的表達與T細胞、B細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、單核細胞的浸潤分數(shù)以及促炎分數(shù)呈正相關(guān)，表明CD274在IA中可能充當炎癥介質(zhì)。事實上，CD274作為炎癥介質(zhì)，與眾多炎癥性疾病有關(guān)。如CD274通過調(diào)節(jié)HIF-1α通路，促進LPS誘導(dǎo)的血管炎癥[30]。而阻斷CD274可減輕中性粒細胞所介導(dǎo)的慢性肺阻塞性疾病的炎癥反應(yīng)[31]。CD274也受到miRNA調(diào)控，如miR-142通過抑制巨噬細胞中CD274的表達而抑制盲腸結(jié)扎穿刺誘導(dǎo)的炎癥，提高膿毒癥小鼠的存活率[32]。雖然關(guān)于CD274與IA關(guān)系的研究尚未報道，但本研究發(fā)現(xiàn)了CD274是hsa-miR-3176的靶點，并與IA炎癥微環(huán)境當中的免疫細胞浸潤密切相關(guān)，可能為IA的發(fā)病機制提供了靶點。

本研究的優(yōu)勢在于通過對公共數(shù)據(jù)庫當中的數(shù)據(jù)進行全面的生物信息學分析，并結(jié)合本研究臨床測序數(shù)據(jù)，著重于探索miRNA介導(dǎo)AI的可能機制，通過差異表達分析、miRNA靶點預(yù)測、PPI網(wǎng)絡(luò)、功能富集分析、免疫浸潤分析探索miRNA下游可能的機制以及可能影響的通路和表型。然而本研究也存在它的局限性和不足之處。首先大多數(shù)的結(jié)果基于生物信息分析，雖然通過自身測序數(shù)據(jù)驗證了miRNA在IA當中的失調(diào)，但關(guān)于miRNA及其下游靶點的調(diào)控關(guān)系以及各自的分子功能未進行實驗驗證。總體而言，目前的發(fā)現(xiàn)使研究者們能夠更好地理解AI的遺傳和表觀遺傳機制，這些機制可能具有作為治療靶點的價值，為后續(xù)的研究提供方向和奠定基礎(chǔ)。

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收稿日期：2023-02-28；修回日期：2023-03-16

編輯/成森