低溫缺血-再灌注對離體大鼠心房肌Kir2.1和CaMKⅡ表達的影響

何幼芹 高鴻 種朋貴 劉艷秋 佟睿 吳學艷

1貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院麻醉科（貴陽 550003）；2中山大學附屬第一醫(yī)院貴州醫(yī)院（貴陽 550025）；3貴州醫(yī)科大學麻醉學院（貴陽 550004）

再灌注心律失常（RA）是心肌缺血-再灌注損傷的特征性表現(xiàn)之一［1］，房性心律失常為RA中的常見類型，以房顫較為常見［2］。復極時程在心律失常的發(fā)生與維持中發(fā)揮著重要作用，表現(xiàn)為復極時程延長，心律失常發(fā)生風險顯著增加［3］。本課題組前期研究［4］揭示，低溫全心缺血-再灌注后房性心律失常心房肌復極時程顯著延長。內(nèi)向整流鉀電流（Ik1）內(nèi)向整流特性對維持心肌細胞的長平臺期和3期復極具有重要作用；當Ik1的活動降低，動作電位復極延長。構成Ik1的主要成分為內(nèi)向整流鉀通道2.1（Kir2.1）［5］，其表達下調(diào)可致動作電位復極時程延長，增加房性心律失常的發(fā)生風險［6］。亦有研究揭示，Ca2+/CaM依賴激酶Ⅱ（CaMKⅡ）表達增加可引起蘭尼堿受體2（ryanodine receptor 2，RyR2）磷酸化加重，進一步導致心肌跨室壁復極離散度（TDR）增加，從而增加心律失常發(fā)生的風險［7-9］。然而，低溫全心缺血-再灌注房性心律失常心房肌復極時程延長是否與Kir2.1和CaMKⅡ的表達改變有關，目前尚無研究報道。故本實驗擬用Langendorff離體大鼠心臟灌注模型研究再灌注后房性心律失常心房肌中Kir2.1和CaMKⅡ的表達，以探討其復極時程延長的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 Langendorff離體大鼠心臟灌注模型的制備將體質(zhì)量為320～380 g的健康成年雄性SD大鼠（貴州醫(yī)科大學動物實驗中心提供）成功制備為Langendorff離體大鼠心臟灌注模型，具體操作步驟詳見以往的研究［10］。本研究已獲得貴州醫(yī)科大學動物倫理委員會審批。

1.2 模型分組與處理按照隨機數(shù)字表法將成功制備的langendorff離體大鼠心臟灌注模型16例隨機分為對照組（C組）和缺血-再灌注組（IR組），每組8例。根據(jù)是否發(fā)生再灌注房性心律失常，將IR組進一步細分為再灌注非房性心律失常亞組（R-NAA）和再灌注房性心律失常亞組（R-AA）。C組使用37 ℃ K-H液平衡灌注120 min。IR組使用37 ℃ K-H液平衡灌注30 min后停止，注射4 ℃Thomas液（20 mL/kg）使心臟停跳60 min，停跳30 min時使用半量4 ℃ Thomas液（10 mL/kg）對離體心臟進行復灌，停跳期間用低溫Thomas液（4 ℃）對心臟保護，后再次灌注37 ℃ K-H液30 min。

1.3 MAPD50和MAPD90的測量于右心房游離前臂放置自制的復合電極，用BL-420生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）于平衡灌注30 min（T0）、平衡灌注105 min/再灌注15 min（T1）和平衡灌注120 min/再灌注30 min（T2）時記錄右心房心外膜單相動作電位（MAP），測量單相動作電位復極50%和90%的時程（MAPD50和MAPD90），記錄平衡灌注90 min/再灌注即刻后離體心臟房性心律失常發(fā)生情況。

1.4 Western blot檢測 Kir2.1和CaMKⅡ的表達分別取上述3組試驗后的適量心房肌組織，于其中加入一定比例的蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑混合液，冰上勻漿并12 000 r/min離心15 min；BCA法進行樣品蛋白定量；將總蛋白/樣品加載到十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜并封閉2 h，分別使用Ⅰ抗［（Kir2.1 抗體，1∶2 000稀釋）、（CaMKⅡ抗體，1∶1 000稀釋）］4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜后分別使用辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗［（Kir2.1抗體，1∶8 000稀釋）、（CaMKⅡ抗體，1∶2 000稀釋）］室溫孵育2 h，TBST洗膜后加入ECL超敏試劑采用全自動凝膠成像分析系統(tǒng)（ZF-158）進行分析。使用Image J軟件測量各組帶強度，GAPDH蛋白印跡帶作為內(nèi)參進行量化，計算Kir2.1和CaMKⅡ蛋白相對含量。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 27.0軟件進行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用重復測量資料的方差分析，計數(shù)資料比較采用Fisher確切概率法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 心律失常發(fā)生情況C組在整個灌注過程中均無房性心律失常發(fā)生。再灌注后IR組有2只發(fā)生房性早搏，有1只發(fā)生房顫，其房性心律失常發(fā)生率為37.5%，房顫發(fā)生率約為12.5%。

2.2 低溫缺血-再灌注對離體大鼠心房肌MAPD50和MAPD90的影響與T0時點比較，R-NAA組和R-AA組T1時MAPD50明顯延長，R-AA組T2時MAPD50明顯延長（P＜0.05）；與T0時點比較，R-NAA組和R-AA組T1、T2時MAPD90明顯延長（P＜0.05）；與C組比較，R-NAA組和R-AA組T1時MAPD50明顯延長，R-AA組T2時MAPD50明顯延長（P＜0.05）；與R-NAA組比較，R-AA組T1、T2時MAPD50明顯延長（P＜0.05）。與C組比較，R-NAA組和R-AA組T1、T2時MAPD90明顯延長（P＜0.05）；與R-NAA組比較，R-AA組T1、T2時MAPD90明顯延長（P＜0.05）。見表1。

表1 3組大鼠右心房不同時點MAPD50和MAPD90的比較Tab.1 Comparison of MAPD50 and MAPD90 at different time points in right atrium of rats in three groups ±s，ms

注：與C組比較，*P＜0.05；與R-NAA組比較，△P＜0.05；與T0比較，▲P＜0.05

項目T0 T1 T2 MAPD50 MAPD90組別C組R-NAA組R-AA組C組R-NAA組R-AA組n8 5 38 5 3 20.10 ± 2.23 21.69 ± 2.71 28.22 ± 3.37*△▲43.14 ± 3.74 47.58 ± 4.56*▲52.15 ± 4.99*△▲19.15 ± 2.03 19.21 ± 2.17 19.09 ± 2.51 42.26 ± 1.62 43.34 ± 2.46 43.48 ± 3.81 19.42 ± 1.99 23.95 ± 2.10*▲29.05 ± 3.81*△▲43.82 ± 2.85 48.76 ± 2.66*▲54.22 ± 3.85*△▲

2.3 低溫缺血-再灌注對離體大鼠心房肌Kir2.1和CaMKⅡ蛋白表達的影響Western blot 檢測結果顯示，R-NAA組和R-AA組Kir2.1表達明顯少于C組（P＜0.05），且R-AA組明顯少于R-NAA組（P＜0.05）；R-NAA組和R-AA組 CaMKⅡ表達較C組明顯增加（P＜0.05），且R-AA組 CaMKⅡ表達較R-NAA組明顯增加（P＜0.05）。見表2。

表2 3組大鼠心房肌Kir2.1和CaMKⅡ表達的比較Tab.2 Comparison of the expression of Kir2.1 and CaMKⅡ in atrial myocardium of rats in three groups ±s

注：與C組比較，*P＜0.05；與R-NAA組比較，△P＜0.05

組別C組R-NAA組R-AA組CaMKⅡ0.49 ± 0.15 1.14 ± 0.25*1.65 ± 0.30*△n8 5 3 Kir2.1 1.99 ± 0.44 1.30 ± 0.39*0.46 ± 0.23*△

3 討論

房性心律失常發(fā)生的病理改變主要包括心房電重構和結構重構，而房性心律失常發(fā)生的早期主要表現(xiàn)為心房電重構，包括電生理與離子通道的改變。再灌注房性心律失常是心房肌缺血-再灌注損傷的特征性表現(xiàn)之一。既往的研究［11］證實，復極時程延長、傳導速度減慢、L型Ca2+電流過度激活、心房早期后除極［12］、氧化應激［13-14］等是已知引起房性心律失常的常見原因。盡管房性心律失常發(fā)生的分子機制已經(jīng)得到了廣泛研究，但在低溫全心缺血-再灌注時有關再灌注房性心律失常發(fā)生的信息卻十分有限。本課題組前期研究揭示，全心低溫缺血-再灌注后心房肌復極時程延長［4］，但其分子機制目前尚不清楚。

本次研究根據(jù)是否發(fā)生再灌注房性心律失常將IR組進一步細分為R-NAA組和R-AA組，更能準確揭示再灌注房性心律失常心房肌復極時程延長的可能分子機制。MAPD主要反映心肌細胞動作電位0～3相復極；其中，MAPD50和MAPD90分別與心肌細胞動作電位復極2期和3期有關［15］。Ik1是心房肌細胞動作電位復極的關鍵電流；當其活動降低，心肌動作電位復極時程延長；作為Ik1的主要構成成分，Kir2.1蛋白由基因KCNJ2編碼，其表達下調(diào)可使心肌動作電位復極時程延長，增加房性心律失常的發(fā)生風險［6，16-17］。LAMMERS等［18］的研究揭示，Kir2.1蛋白的表達與復極時程呈反向改變，即Kir2.1蛋白表達下調(diào)則復極時程延長。RyR2廣泛存在于肌漿網(wǎng)上，介導心肌興奮-收縮偶聯(lián)，當其功能紊亂時，可引起Ca2+滲漏，使舒張期心肌細胞出現(xiàn)鈣超載，從而引發(fā)心律失常。作為RyR2的調(diào)控因子之一，CaMKⅡ?qū)τ诰S持RyR2一定的磷酸化發(fā)揮重要調(diào)控作用。當缺血等病理狀態(tài)下CaMKⅡ表達增加，可使得RyR2的磷酸化加重，導致復極時程延長，進一步使心肌TDR增加，從而增加心律失常發(fā)生的風險［7-9］。另有研究揭示，CaMKⅡ蛋白表達與復極時程呈正向改變；即CaMKⅡ蛋白表達增加，則心肌組織復極時程延長［7-8］。因此推斷，Kir2.1和CaMKⅡ蛋白表達改變與心肌復極時程密切相關。因此，檢測Kir2.1和CaMKⅡ蛋白表達對揭露低溫全心缺血-再灌注心房肌復極時程延長具有重要意義。故本研究觀察了低溫缺血-再灌注房性心律失常心房Kir2.1和CaMKⅡ蛋白表達的變化，從分子水平探討再灌注房性心律失常心房肌復極時程延長的可能分子機制。Kir2.1和CaMKⅡ基因的表達受多因素調(diào)控。例如：激素、體液、某些信號分子以及一些小分子RNA 可上調(diào)或下調(diào) Kir2.1和CaMKⅡ基因的表達，從而影響Kir2.1和CaMKⅡ的功能。本研究采用Langendorff大鼠心臟灌注模型，可以排除激素、體液等干擾因素。本次研究結果提示，R-AA組心房肌MAPD50和MAPD90較C組和R-NAA組明顯延長，與課題組前期研究結果一致。與此同時，Western blot結果顯示，R-AA組心房肌Kir2.1蛋白表達較其他兩組明顯下調(diào)，與XIA等［19］的研究結果相似。本次研究結果揭示，R-AA組心房肌CaMKⅡ蛋白表達較C組和R-NAA組明顯增加，與國外研究［7-8］結果一致。因此，我們有理由推斷，Kir2.1表達下調(diào)和CaMKⅡ表達增加可能與再灌注房性心律失常心房肌復極時程延長有關。

綜上所述，Kir2.1蛋白表達下調(diào)和CaMKⅡ蛋白表達增加可能與低溫全心缺血-再灌注后房性心律失常心房肌復極時程延長有關。