精子膜及線粒體活性氧對男性生育力的影響及其在輔助生殖技術(shù)中的應用

劉居理 陳勝輝 李琳 姚文亮 楊麗娟 饒研文

江西中醫(yī)藥大學附屬生殖醫(yī)院（南昌市生殖醫(yī)院）（南昌 330004）

目前，精液常規(guī)分析仍然是臨床用來評估男性生育力最為主要的手段，也是最為常規(guī)的檢測。據(jù)估計，精液常規(guī)分析評價生育力僅有70%的準確性。其主要原因在于常規(guī)精液分析只檢測了精液的理化性質(zhì)、精子濃度、數(shù)量、活力等。而這些指標只能反映精液的基本情況，并不能對精子內(nèi)在功能進行評估。由于導致男性不育的因素眾多，而且存在個體差異，外加精液參數(shù)參考范圍較廣，因此除了無精子癥或嚴重少、弱、畸形精子癥外，僅僅通過精液分析對男性生育力進行評估是很不準確的。有研究［1］表明，臨床上大約有1/3的男性不育患者常規(guī)精液分析結(jié)果均正常和接近正常，因此有必要進一步完善精子功能評估的方法。

近年來，隨著研究的深入及技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了一些新的評估精子功能的方法，如精子核DNA完整性、線粒體膜電位、誘發(fā)精子頂體反應、精子活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測等。已有研究［2］表明，精子ROS對精子質(zhì)膜損傷所導致的受精能力喪失是造成男性不育的主要原因之一。研究［3］發(fā)現(xiàn)，適量ROS對精子受精具有重要的生理作用，但如果ROS過量則可造成精子損傷，導致精子活力下降、死亡率增高，從而引起男性不育。有研究表明，在25%～40%的不育男性的精液中檢測到高水平的ROS。因此，ROS對男性生育力的影響越來越受到生殖醫(yī)學工作者的重視。而采用體外受精-胚胎移植技術(shù)進行助孕過程中，需要對精液進行優(yōu)化處理。由于精漿中含有抗氧化酶，對精子具有保護作用，而精液處理通常需要去除精漿，從而使精子更易受到ROS的損傷。另外，在精液處理過程中，往往需要進行離心，而精液多次離心會顯著增加ROS水平［4］。高水平的ROS可能會增加精子DNA斷裂率，而已有研究將精子DNA損傷與胚胎死亡增加聯(lián)系起來。因此，ROS是影響男性生育力及輔助生殖技術(shù)成功的一個重要病因和病理因素，其在生殖醫(yī)學的地位是不容忽視的。

以往許多研究［5-6］都是針對精漿中的ROS進行的，而精漿ROS水平受精液中白細胞的干擾非常大［7］，導致結(jié)果與實際可能存在較大偏差，影響了研究結(jié)論的準確性，也限制了其在臨床的應用。近年來，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展以及生殖領(lǐng)域?qū)Σ∫蛱剿鞯倪M一步需求，準確評估精子膜及線粒體ROS水平顯得更具意義，因為精子本身ROS更能反映其內(nèi)在功能。而目前對精子膜及線粒體ROS在生殖領(lǐng)域的應用研究甚少，因此有必要明確精子膜及線粒體中ROS對男性生育力的影響及其在輔助生殖技術(shù)中的應用價值，以期為男性不育患者提供一個新的生育力評估手段及病因治療方向，為輔助生殖助孕患者受孕時機的選擇提供一個參考指標。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取來我院就診的男性不育患者150例，擬接受體外受精-胚胎移植助孕的夫婦50例及正常生育志愿者50例為研究對象并簽署知情同意書。男性不育患者納入標準：同居兩年以上未避孕，性生活正常而未育，女方檢測未發(fā)現(xiàn)異常，年齡≤ 45歲。正常生育志愿者納入標準：精液檢測參數(shù)在正常參考范圍內(nèi)且近2年內(nèi)已生育男性，年齡≤ 45歲。擬接受體外受精-胚胎移植助孕的夫婦納入標準為：（1）夫婦染色體檢查均為正常核型，男性檢査包括男性第二性征、陰莖、陰囊、精索、輸精管、附睪、睪丸等均無異常。（2）單純由女性輸卵管因素導致不育。女方年齡≤ 35歲，助孕次數(shù)≤ 2次，不孕年限≤ 5年，MⅡ卵子數(shù)≥ 4枚。本研究在實施前已通過醫(yī)學倫理委員會的審查批準（南昌市生殖醫(yī)院醫(yī)倫審字2021年第008號）。

1.2 分組為探討精子ROS與男性不育的關(guān)系，將研究對象分為：男性不育組（150例男性不育患者）和正常生育組（50例正常生育志愿者）。為探討精子ROS與精子膜功能和精子核DNA完整性的關(guān)系，根據(jù)精子ROS檢測結(jié)果將上述200例男性研究對象分為：ROS正常組（精子膜高ROS精子比例≤ 40%且線粒體高ROS精子比例≤ 55%）和ROS異常組（精子膜高ROS精子比例＞40%或線粒體高ROS精子比例＞55%）。為探討精子ROS與受精率，卵裂率，優(yōu)胚率及妊娠結(jié)局的關(guān)系，根據(jù)男方精液優(yōu)化處理后精子ROS檢測結(jié)果將50例擬接受體外受精-胚胎移植助孕的夫婦分為：IVF對照組（精子膜高ROS精子比例≤ 40%且線粒體高ROS精子比例≤ 55%）和IVF觀察組（精子膜高ROS精子比例＞40%或線粒體高ROS精子比例＞55%）。

1.3 研究方法

1.3.1 精液樣本采集及精液常規(guī)分析按《WHO人類精液分析實驗室技術(shù)手冊》（第5版）要求對男性不育組及正常生育組進行精液采集及常規(guī)分析和精子膜功能測定，并留取100 μL精液標本存儲于-20 ℃冰箱用于精子核DNA完整性的測定。同時對其精子膜及線粒體ROS進行測定并根據(jù)結(jié)果將研究對象分為ROS正常組及ROS異常組。

1.3.2 精子膜及線粒體ROS測定采用DCFHDA及MitoSOX Red對精子進行染色，利用流式細胞儀對精子膜及線粒體ROS水平進行檢測及分析。根據(jù)試劑盒提供的閾值：精子膜高ROS精子比例≤ 40%且線粒體高ROS精子比例≤ 55%者為活性氧正常，精子膜高ROS精子比例＞40%或線粒體高ROS精子比例＞55%者為活性氧異常。

1.3.3 精子膜功能測定精液液化后用伊紅Y對精子進行染色，利用相差顯微鏡對染色后精子進行觀察，分析精子膜功能情況。

1.3.4 精子核DNA完整性測定采用吖啶橙對精子進行染色，利用流式細胞儀對精子核DNA完整性進行檢測，通過DNA碎片指數(shù)（DFI）分析軟件對精子核DNA完整性進行分析。

1.3.5 促排卵及取卵根據(jù)患者情況選擇合適的方案進行促排卵，在B超監(jiān)測下行穿刺取卵術(shù)。

1.3.6 精液優(yōu)化處理采用雙層密度梯度離心法對接受體外受精-胚胎移植助孕夫婦的男方精液進行優(yōu)化處理后，在充分保證體外受精所需精子的情況下，留取部分精子并進行精子膜及線粒體ROS測定并根據(jù)結(jié)果將研究對象分為IVF對照組及IVF觀察組。

1.3.7 體外受精采用常規(guī)IVF受精方式進行。

1.3.8 受精觀察及胚胎評估在取卵后的第1天（D1）進行受精情況的觀察，第3天（D3）進行卵裂期胚胎的觀察，第5天（D5）及第6天（D6）進行囊胚期的觀察并記錄。

1.3.9 胚胎移植對適合新鮮移植的患者，在取卵后的第3天進行卵裂胚的移植或在取卵后的第5天或第6天進行囊胚移植。對不適合新鮮移植的患者，則將可用胚胎進行玻璃化冷凍并保存，擇期移植。

1.3.10 妊娠結(jié)局隨訪移植后35 d隨訪臨床妊娠情況。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料用均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組別精子膜及線粒體ROS檢測結(jié)果比較男性不育組與正常生育組比較，精子膜高ROS精子比例差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而精子線粒體高ROS精子比例差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在精子ROS異常率方面，男性不育組顯著高于正常生育組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同組別精子膜及線粒體ROS檢測結(jié)果比較Tab.1 The comparison of sperm membrane and mitochondrial ROS levels in different groups ±s

表1 不同組別精子膜及線粒體ROS檢測結(jié)果比較Tab.1 The comparison of sperm membrane and mitochondrial ROS levels in different groups ±s

組別男性不育組正常生育組t值χ2值P值例數(shù)150 50膜高ROS精子比35.71 ± 15.00 28.10 ± 12.17-3.247-0.001線粒體高ROS精子比44.66 ± 15.65 44.10 ± 11.19-0.234-0.815 ROS異常率（%）49.33（74/150）30.00（15/50）-4.920 0.027

2.2 不同組別精子膜功能及核完整性檢測結(jié)果比較ROS正常組與ROS異常組比較，精子膜功能正常率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而精子核DNA完整性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同組別精子膜功能及核完整性檢測結(jié)果比較Tab.2 The comparison of sperm membrane function and nuclear integrity in different groups ±s，%

表2 不同組別精子膜功能及核完整性檢測結(jié)果比較Tab.2 The comparison of sperm membrane function and nuclear integrity in different groups ±s，%

組別ROS正常組ROS異常組t值P值例數(shù)111 89精子膜功能正常率46.74 ± 6.63 41.65 ± 9.75-4.381＜0.001精子DNA碎片指數(shù)14.66 ± 9.12 16.37 ± 9.59 1.288 0.199

2.3 不同組別臨床資料比較IVF對照組與IVF觀察組比較，年齡，不孕年限，獲卵數(shù)，移植胚胎種類、數(shù)量、評分及子宮內(nèi)膜等基本情況差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性。IVF對照組、IVF觀察組受精率、卵裂率、優(yōu)胚率及臨床妊娠率分別為：75.44%vs.66.21%，95.27%vs.97.51%，49.07%vs.44.26%，61.90%vs.58.62%，兩組結(jié)果比較，受精率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而卵裂率、優(yōu)胚率及臨床妊娠率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3、4。

表3 不同組別臨床資料比較Tab.3 The comparison of clinical data in different groups ±s

表3 不同組別臨床資料比較Tab.3 The comparison of clinical data in different groups ±s

組別IVF對照組IVF觀察組t值χ2值P值例數(shù)21 29年齡（歲）31.62 ± 3.29 30.89 ± 3.21-0.786-0.436不孕年限（年）3.28 ± 1.59 3.14 ± 1.68-0.297-0.767獲卵數(shù)（個）10.67 ± 4.08 12.55 ± 4.15 1.592-0.118囊胚/卵裂移植比（%）31.25（5/16）20.83（5/24）-0.046 0.830移植胚胎數(shù)（個）1.67 ± 0.48 1.76 ± 0.43 0.696-0.490移植優(yōu)胚比（%）80.00（28/35）84.31（43/51）-0.052 0.819內(nèi)膜厚度（mm）11.05 ± 1.07 11.31 ± 1.17 0.803-0.426

表4 不同組別受精率、卵裂率、優(yōu)胚率及臨床妊娠率比較Tab.4 The comparison of fertilization rate，cleavage rate，superior embryo rate and clinical pregnancy rate in different groups

3 討論

目前，我國不孕癥的患病率為7%～10%［8］，其中接近50%是由男性因素引起的［9］。在引起男性不育的眾多因素中，ROS被認為是其中的主要原因之一［10］。在日常生活環(huán)境當中，許多常見因素如吸煙［11］、手機輻射［12］等均可促進精子ROS的產(chǎn)生，因此精子ROS與男性生殖關(guān)系密切。雖然已有許多關(guān)于ROS與精子功能的研究，但臨床應用甚少，且檢測樣本往往采用精漿，受精液中白細胞及非精子細胞的影響較大，容易產(chǎn)生偏差，從而限制了其臨床應用。而精子膜及線粒體ROS檢測的是精子本身，受其他因素影響較少，特異性更強，結(jié)果也更準確。

在輔助生殖技術(shù)中，往往需要對精液進行優(yōu)化處理以回收高活力精子，這部分用于受精的精子ROS水平也許更能反映其真實狀況。有研究［13］提示，高ROS水平會導致精子DNA碎片率的增加，進而使男性生育力降低，同時增加女方復發(fā)性流產(chǎn)風險，影響IVF助孕結(jié)局［14-15］。另外，有研究［16］表明：當ROS含量過高時，可損害精子膜的流動性，提高膜的通透性，使精子質(zhì)膜受體和下游信號通路紊亂，從而降低精子活力，影響精子形態(tài)。

為進一步明確精子ROS對男性生育力的影響及其在輔助生殖中的應用價值，以及精子ROS與精子核DNA完整性和精子膜功能的相關(guān)性。本項目利用DCFH-DA進行精子膜ROS的檢測，利用MitoSOX Red進行精子線粒體ROS的檢測。由于DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由通過細胞膜，進入細胞后可以被細胞內(nèi)的脂酶水解生成DCFH，其不能透過細胞膜，從而使探針容易被標記到細胞內(nèi)。在ROS存在的條件下，DCFH被氧化成熒光物質(zhì)DCF，發(fā)綠色熒光，熒光強度與細胞內(nèi)ROS呈正比。而MitoSOX Red是一種可以自由通過細胞膜的脂溶性陽離子染料，染料的脂溶性增加了其透過細胞膜及線粒體膜的透過率，帶正電可以使其特異性的與超氧陰離子結(jié)合并固定在核酸之上。當MitoSOX Red被超氧陰離子氧化后會與線粒體DNA結(jié)合使線粒體發(fā)出紅色熒光，熒光強度與超氧陰離子水平呈正比。因此該檢測方案具有較好的準確性及科學性。本研究顯示：（1）男性不育組精子膜ROS水平明顯高于正常生育組，精子ROS異常率也顯著增高，說明精子ROS水平與男性生育力具有一定聯(lián)系，這與既往研究結(jié)果也是相符的［17-18］。（2）ROS正常組、ROS異常組精子膜功能正常率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），本研究提示：精子膜及線粒體ROS水平與精子膜功能呈負相關(guān)，其機制可能為精子膜及線粒體ROS可通過氧化應激使精子軸絲受損，誘導精子形態(tài)缺陷，進而導致精子膜功能下降［19-20］。這與現(xiàn)有研究結(jié)果也是一致的［21］。（3）ROS正常組、ROS異常組精子核DNA完整性并差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。說明精子膜及線粒體高ROS精子比例與精子核DNA完整性無直接關(guān)系，這與既往研究顯示的高水平ROS會增加精子DNA斷裂率并不一致，其原因可能是：本研究檢測的指標是高ROS精子占所檢測精子的比例，反映的并不是精子ROS的絕對濃度，所以結(jié)論存在一定偏差。這也提示精子膜及線粒體ROS檢測可作為反映精子功能的一個獨立指標。（4）IVF對照組與IVF觀察組比較，受精率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明精子膜及線粒體ROS水平與受精率具有一定關(guān)系，ROS水平過高可導致精子受精能力降低。而本研究并未發(fā)現(xiàn)ROS與卵裂率、優(yōu)胚率及臨床妊娠率間具有顯著關(guān)聯(lián)，推測其原因可能為：過量ROS可導致精子頂體膜過氧化和頂體活性降低，使精卵融合受損導致受精失?。?2］，而并不參與受精卵后續(xù)發(fā)育過程。另外，由于本次的研究對象有限，且導致不孕不育的機制復雜，因此結(jié)果可能存在一定偏差，需有待于更多的樣本數(shù)據(jù)和更詳細的分子機制去驗證。

綜上可見，精子ROS與男性生育力具有一定關(guān)系，ROS異?？蓪е戮幽すδ苁軗p，并可影響精子受精能力，從而影響男性生育功能。精子ROS檢測可作為男性生育力評估的一個新手段并可為男性不育的診療提供依據(jù)。對于輔助生殖助孕患者，特別是卵子數(shù)量較少者，為盡力避免由于ROS過高導致受精率下降而影響后續(xù)胚胎的獲得，可根據(jù)精子ROS情況選擇合適的助孕時機。