子癇前期母胎界面TLR4 作用的研究進(jìn)展

黃曉彤，程湘瑋，張陽

子癇前期是一種累及多器官的妊娠期特有疾病，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒病死率升高的主要原因之一，但子癇前期的病因和發(fā)病機制復(fù)雜，目前尚未完全闡明。子癇前期患者產(chǎn)后遠(yuǎn)期出現(xiàn)心血管與代謝性疾病的風(fēng)險升高，其后代罹患心血管疾病、代謝性疾病和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙的風(fēng)險也顯著增加，但潛在機制不明[1]。Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）家族是固有免疫系統(tǒng)中的一類模式識別受體，在炎癥免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。母胎界面中TLR4 表達(dá)量最高，可調(diào)控炎癥免疫微環(huán)境穩(wěn)態(tài)[2]。既往研究指出，子癇前期TLR4 信號異常介導(dǎo)母胎界面炎癥免疫穩(wěn)態(tài)失衡，參與子癇前期發(fā)病。新近研究相繼報道子癇前期母胎界面TLR4 還調(diào)控鐵死亡、焦亡、代謝重編程和細(xì)胞衰老等病理現(xiàn)象[3-6]，并可能介導(dǎo)子代神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常，而靶向母胎界面TLR4 可能是子癇前期新型治療策略的潛在機制之一。因此，全面了解母胎界面TLR4 的作用和機制，有望為研究子癇前期的發(fā)病機制和治療手段提供可能的新方向。

1 母胎界面TLR4 信號通路概述

TLR 是一類重要的模式識別受體，屬于Ⅰ型跨膜受體蛋白，由富含亮氨酸重復(fù)序列的高度可變的胞外域和高度保守的細(xì)胞質(zhì)Toll/白細(xì)胞介素-1 受體（Toll/interleukin-1 receptor，TIR）結(jié)構(gòu)域組成。TLR4是目前研究最為熱門的TLR，廣泛表達(dá)于母胎界面免疫細(xì)胞、滋養(yǎng)細(xì)胞、胎盤間充質(zhì)基質(zhì)/干細(xì)胞（placental mensenchymal stromal/stem cell，PMSC）和蛻膜細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞。①革蘭氏陰性菌的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等多種病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）和高遷移率族蛋白B1、熱休克蛋白和纖維蛋白原等多種損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular pattern，DAMP）可活化TLR4，再寡聚化TLR4，隨后募集激活髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、誘導(dǎo)β 干擾素TIR 結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TIR domain-containing adaptor inducing interferon-β，TRIF）和TRIF 相關(guān)銜接分子（TRIF related adaptor molecule，TRAM）等下游銜接因子；②MyD88、TRIF 和TRAM被激活后發(fā)生一系列級聯(lián)生化反應(yīng)，啟動下游信號傳導(dǎo)，激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）等多種轉(zhuǎn)錄因子，最終使信號由細(xì)胞外傳入細(xì)胞核；③上述不同轉(zhuǎn)錄因子核轉(zhuǎn)位啟動相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白合成，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、IL-6 等多種炎癥因子和Ⅰ型干擾素，從而引發(fā)、維持和調(diào)控炎癥免疫反應(yīng)[7]。

2 母胎界面TLR4 與正常妊娠

妊娠早期，母胎界面適度的炎癥反應(yīng)對囊胚附著、胚胎植入和建立免疫耐受是有益的，而TLR4 可能是誘導(dǎo)妊娠早期宮內(nèi)炎癥樣反應(yīng)的關(guān)鍵。母體子宮內(nèi)膜上皮與精子的相互作用有利于妊娠早期建立免疫耐受，促進(jìn)妊娠進(jìn)展[8]。體外研究表明，敲除TLR4（TLR4-/-）的雌鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞對精子信號的反應(yīng)受損，多種細(xì)胞因子和趨化因子釋放減少[9]；體內(nèi)實驗同樣發(fā)現(xiàn)，TLR4-/-雌鼠與野生型C57BL/6（B6）雄鼠交配受孕后，子宮內(nèi)膜組織中細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)減少，子宮對中性粒細(xì)胞的募集減弱，CD4+T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）增殖受損，最終導(dǎo)致胎盤發(fā)育嚴(yán)重異常、胎鼠丟失和胎鼠生長受限等不良妊娠結(jié)局[9-10]。相反地，妊娠早期適度激活滋養(yǎng)層細(xì)胞TLR4，可增強多種細(xì)胞因子的釋放以增加囊胚種植率[11]。因此，妊娠早期母胎界面TLR4可能對維持免疫耐受和妊娠進(jìn)展至關(guān)重要。

隨著妊娠進(jìn)展，胎盤TLR4 的表達(dá)發(fā)生時空動態(tài)變化：妊娠早期，細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞中TLR4 均穩(wěn)定表達(dá)，而合體滋養(yǎng)細(xì)胞無TLR4 表達(dá)；妊娠中期，胎盤TLR4 的表達(dá)水平逐漸下降，母體整體呈現(xiàn)部分免疫抑制狀態(tài)，有利于維持胎兒所處的宮內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；妊娠晚期，胎盤TLR4 的表達(dá)水平再次升高，甚至高于妊娠早期，并主要表達(dá)于合體滋養(yǎng)細(xì)胞，這可能是因為在妊娠晚期TLR4 是子宮激活和分娩驅(qū)動的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[12]。相反，TLR4-/-孕鼠胎盤與胎膜中細(xì)胞因子和子宮激活相關(guān)基因表達(dá)顯著減少，胎盤中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及子宮肌層中的樹突狀細(xì)胞和Treg 細(xì)胞含量均顯著減少，盡管最終平均妊娠時間延長了13 h，但圍產(chǎn)期胎鼠死亡率顯著增加[13]。

因此，TLR4 可能是母體天然免疫系統(tǒng)和胎盤局部免疫微環(huán)境之間的聯(lián)系樞紐，而當(dāng)妊娠期母胎界面TLR4 表達(dá)變化的平衡被打破時，則可能導(dǎo)致子癇前期等多種臨床不良妊娠并發(fā)癥的發(fā)生。

3 母胎界面TLR4 與子癇前期

子癇前期是一種妊娠期特有的疾病，表現(xiàn)為妊娠20 周以后出現(xiàn)血壓升高和蛋白尿，并可出現(xiàn)頭痛、視物模糊、惡心嘔吐及上腹不適等癥狀，伴隨多器官的受損。子癇前期是一種多因素－多機制－多通路致病的疾病，目前相關(guān)的學(xué)說主要包括“滋養(yǎng)細(xì)胞功能障礙，子宮螺旋小動脈重鑄不足”、“炎癥免疫過度激活”、“血管內(nèi)皮細(xì)胞受損”和“遺傳因素”等。既往大量文獻(xiàn)報道：一方面，子癇前期胎盤中TLR4 表達(dá)異常升高[14]；另一方面，子癇前期孕婦腸道菌群中生成LPS 相關(guān)的微生物基因表達(dá)水平顯著升高，子癇前期孕婦糞便和胎盤中LPS 含量也異常升高，并且胎盤中多種類型的DAMP 表達(dá)水平也顯著升高[15]，故子癇前期孕婦胎盤TLR4 信號通路表達(dá)異常且過度激活[16]。此外，經(jīng)典的Nω-硝基-L-精氨酸甲酯（Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME）[17]和LPS[18]誘導(dǎo)的子癇前期動物模型中，胎盤TLR4 信號通路均表達(dá)增強和異常激活。上述研究結(jié)果共同反映了母胎界面TLR4 信號異常激活可能是子癇前期的發(fā)病機制之一，但也有研究報道與正常妊娠女性相比，早發(fā)型子癇前期患者胎盤TLR1 和TLR4 的表達(dá)顯著降低[19]，故針對子癇前期母胎界面TLR4 表達(dá)變化的結(jié)論尚未統(tǒng)一。遺傳因素方面，既往認(rèn)為TLR4 基因的rs4986790 和rs4986791 單核苷酸多態(tài)性可能是子癇前期的高危因素[20]，但一項納入5 個遺傳模型的Meta 分析報道TLR4 rs4986790 和rs4986791 單核苷酸多態(tài)性與子癇前期易感性之間無顯著相關(guān)性[21]，仍需要高質(zhì)量、大規(guī)模的前瞻性研究來進(jìn)一步驗證。因此，有關(guān)子癇前期母胎界面TLR4表達(dá)的結(jié)論之間仍存在矛盾，這可能與組織取材的不同有關(guān)，更可能與子癇前期發(fā)病機制的異質(zhì)性有關(guān)。母胎界面低表達(dá)的TLR4 可能導(dǎo)致Treg 細(xì)胞數(shù)量減少，母體對胚胎免疫耐受減弱，胎盤發(fā)育不良，引發(fā)子癇前期；母胎界面過度激活的TLR4 則可能導(dǎo)致炎癥免疫過度激活，輔助性T 細(xì)胞1（helper T cell，Th1）/Th2 免疫失衡，巨噬細(xì)胞活化，滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡和血管內(nèi)皮功能障礙，參與子癇前期的發(fā)生、發(fā)展[2]。

盡管母胎界面TLR4 最經(jīng)典的作用是調(diào)控局部炎癥免疫，但新近研究相繼報道子癇前期母胎界面TLR4 介導(dǎo)多種新型病理現(xiàn)象，如鐵死亡、焦亡、代謝重編程和細(xì)胞衰老等，與子癇前期的發(fā)病密切相關(guān)[3-6]。鐵死亡是一種由鐵依賴性脂質(zhì)過氧化損傷引起的細(xì)胞程序性死亡形式。子癇前期胎盤鐵死亡水平異常升高，子癇前期胎盤TLR4 表達(dá)水平與促鐵死亡介質(zhì)[Fe2+和丙二醛（malondialdehyde，MDA）]含量呈正相關(guān)，與抗鐵死亡介質(zhì)[血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）、谷胱甘肽過氧化物酶4和還原型谷胱甘肽] 含量呈負(fù)相關(guān)，并可能通過TLR4/轉(zhuǎn)錄激活因子3（activatingtranscriptionfactor3，ATF3）/溶質(zhì)載體家族7 成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）信號途徑介導(dǎo)胎盤鐵死亡。同時，子癇前期孕婦血清TLR4 則可能是診斷胎盤鐵死亡的血清生物標(biāo)志物，敏感度98.5%，特異度92.0%，曲線下面積0.988（95%CI：0.938～1.000）[3]。

胎盤糖代謝穩(wěn)態(tài)失衡是子癇前期等多種臨床不良妊娠并發(fā)癥的重要病理特征之一，并與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。子癇前期胎盤線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，氧化磷酸化水平降低，腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）生成受抑制，而胎盤中己糖激酶（hexokinase，HK）、磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）、6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3，PFKFB3）和丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PMK）等糖酵解關(guān)鍵酶的表達(dá)水平顯著增加[5-6]，提示子癇前期胎盤糖代謝穩(wěn)態(tài)失衡——線粒體氧化磷酸化減少，糖酵解過度激活，胎盤ATP 產(chǎn)量不足，導(dǎo)致胎盤發(fā)育不良和功能障礙。然而，目前關(guān)于子癇前期胎盤能量代謝紊亂的發(fā)生機制仍知之甚少。近年文獻(xiàn)報道，TLR4/NF-κB信號途徑誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損；TLR4 激活誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB1 核轉(zhuǎn)位，直接與PFKFB3 啟動子結(jié)合，促進(jìn)糖酵解酶PFKFB3 表達(dá)增強，最終調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞糖代謝并影響細(xì)胞功能[5-6]。

焦亡是一種新型的伴有無菌性炎癥級聯(lián)反應(yīng)的程序性細(xì)胞死亡形式。其中，激活TLR4 誘導(dǎo)NF-κB活化，調(diào)控其下游基因NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（NOD-like receptor family pyrin domaincontaining protein，NLRP）、胱天蛋白酶（caspase）、IL-1β 前體和IL-18 前體，該步驟是經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑中的重要環(huán)節(jié)。而非經(jīng)典的細(xì)胞焦亡途徑中，進(jìn)入細(xì)胞的LPS 直接與caspase-11（小鼠）或caspase-4/5（人）結(jié)合，活化GSDMD（Gasdermin D）蛋白以裂解細(xì)胞膜并釋放炎癥因子，促進(jìn)細(xì)胞焦亡。由此可見，TLR4信號途徑與細(xì)胞焦亡關(guān)系密切。子癇前期胎盤焦亡水平異常升高，且研究證實滋養(yǎng)細(xì)胞中TLR4/NF-κB信號通路調(diào)控NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的焦亡，參與子癇前期的發(fā)生、發(fā)展；此外，母胎界面TLR4/NF-κB/PFKFB3 信號更有可能介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞糖代謝重編程和NLRP3 炎癥小體誘導(dǎo)的焦亡之間的復(fù)雜串?dāng)_[5]。

細(xì)胞衰老是一種不可逆的細(xì)胞生長終末停滯狀態(tài)，且衰老細(xì)胞異常分泌多種促炎細(xì)胞因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等，進(jìn)一步影響鄰近細(xì)胞功能。正常妊娠進(jìn)展到足月分娩的過程中存在胎盤生理性衰老，而子癇前期時，胎兒生長受限及流產(chǎn)等臨床不良妊娠并發(fā)癥存在胎盤病理性衰老。其中，子癇前期PMSC 衰老程度加劇，異常分泌多種促炎細(xì)胞因子及抗血管生成相關(guān)因子。研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期PMSC 的TLR4 表達(dá)異常并過度激活，通過抑制Hedgehog 信號通路加劇PMSC衰老；衰老的PMSC 異常分泌IL-8、IL-6 等促炎細(xì)胞因子和可溶性fms 樣酪氨酸激酶-1（soluble fmslike tyrosine kinases-1，sFlt-1）等抗血管生成相關(guān)因子，誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞功能受損和胎盤血管生成障礙，參與子癇前期的發(fā)生、發(fā)展[4]。

4 母胎界面TLR4 和子癇前期患者子代神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常

據(jù)報道，母體子癇前期與其子代罹患神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病的風(fēng)險增加密切相關(guān)，包括自閉癥譜系障礙、注意缺陷多動障礙、精神分裂癥、智力障礙、癲癇和腦癱等，但其具體機制尚不明確。神經(jīng)系統(tǒng)炎癥在圍產(chǎn)期腦損傷和子代神經(jīng)發(fā)育障礙中發(fā)揮重要作用，其中TLR 介導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥免疫紊亂會影響神經(jīng)細(xì)胞狀態(tài)、突觸功能和神經(jīng)連接的細(xì)化，導(dǎo)致多種神經(jīng)病理變化。動物實驗發(fā)現(xiàn)，TLR4-/-孕鼠無法響應(yīng)宮內(nèi)注射LPS 的外源性刺激，母胎界面炎癥免疫保持穩(wěn)定；TLR4-/-孕鼠分娩的胎鼠腦組織中，腦損傷相關(guān)通路（如NOTCH 信號通路）的表達(dá)無顯著增加[22]，因此，母胎界面TLR4 介導(dǎo)的妊娠期宮內(nèi)炎癥激活與子代神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。但另一方面，向TLR4-/-孕鼠宮內(nèi)注射特殊標(biāo)記的LPS，發(fā)現(xiàn)子宮、胎膜、胎盤和胎兒組織內(nèi)均可檢測到LPS。因此，即使抑制了母體TLR4 介導(dǎo)的宮內(nèi)炎癥激活，內(nèi)毒素仍可能在羊膜腔中引發(fā)胎兒炎癥并對胎兒神經(jīng)發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響。子癇前期孕婦的子代臍帶血中TLR4的表達(dá)水平也顯著高于正常孕婦的子代，而TLR4的激活可直接損害新生兒腦發(fā)育[23]。因此，母胎界面TLR4 信號極有可能是連接母體炎癥和人類子代神經(jīng)發(fā)育障礙的潛在途徑[24]。

5 靶向母胎界面TLR4 的子癇前期新型防治手段

目前，子癇前期臨床治療主要是降壓、鎮(zhèn)靜、解痙等對癥治療和小劑量阿司匹林預(yù)防，最有效的治療仍是胎兒及其附屬物的娩出，但可能會伴隨不良圍產(chǎn)結(jié)局風(fēng)險的增加。因此，仍需進(jìn)一步探索更多可能的治療手段。TLR4 信號途徑從多機制、多通路參與子癇前期的發(fā)生、發(fā)展，如能有效改善母胎界面TLR4 的異常，有望成為子癇前期的潛在治療策略。盡管如此，有關(guān)的新藥研究仍停留在細(xì)胞/動物模型的實驗室研究層面，這些新藥均能有效改善子癇前期癥狀（高血壓、蛋白尿、胎兒生長受限、死胎和死產(chǎn)等）或胎盤發(fā)育不良，且潛在藥理機制均與作用于母胎界面TLR4 密切相關(guān)[5,17-18,25-38]，見表1。

6 結(jié)語與展望

眾所周知，TLR4 是調(diào)控母胎界面炎癥免疫的重要介質(zhì)之一，對妊娠進(jìn)展和胎盤、胎兒發(fā)育具有重要意義。母胎界面TLR4 表達(dá)異常可能誘導(dǎo)局部炎癥免疫穩(wěn)態(tài)失衡，參與子癇前期發(fā)病。然而，子癇前期母胎界面TLR4 的表達(dá)差異（過高或過低）尚無定論，早發(fā)型和晚發(fā)型子癇前期母胎界面TLR4 的表達(dá)情況是否存在不同也有待進(jìn)一步確認(rèn)。除了激活炎癥免疫外，子癇前期母胎界面TLR4 還可能調(diào)控鐵死亡、焦亡、代謝重編程和細(xì)胞衰老等病理現(xiàn)象，并與子代神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常關(guān)系密切。因此，母胎界面TLR4 的新型調(diào)控作用值得深入探索，且新型調(diào)控作用與經(jīng)典的炎癥免疫調(diào)節(jié)作用之間是否存在復(fù)雜串?dāng)_，仍有待進(jìn)一步明確。同時，TLR4 在子癇前期發(fā)生和發(fā)展的哪個階段、通過何種途徑發(fā)揮作用，也值得深入研究。最后，靶向母胎界面TLR4 可能是子癇前期新藥研究的潛在路徑之一，然而，目前臨床上僅推薦小劑量阿司匹林（50～150 mg）用于子癇前期的預(yù)防，其他藥物在子癇前期中的相關(guān)研究仍停留在實驗室或臨床前研究水平。因此，一方面，需首要關(guān)注妊娠期用藥的安全性；另一方面，基于子癇前期多因素－多機制－多通路致病的特點，未來仍需在多種不同類型的子癇前期動物模型中驗證新藥對子癇前期的防治作用，有助于進(jìn)一步明確靶向母胎界面TLR4 的新藥可能適用的子癇前期亞分類和亞分型，最終應(yīng)用于臨床。