子宮內(nèi)膜容受性不良不孕癥女性宮腔菌群特征研究

任姝晴，宋殿榮，張繼雯，懷其娟，趙琳，張崴

生殖健康是當(dāng)今時(shí)代最核心的生命科學(xué)問(wèn)題之一，一項(xiàng)發(fā)表在《柳葉刀》雜志上的研究顯示，2007—2020 年我國(guó)不孕癥的發(fā)病率已從12%攀升至18%。人類(lèi)輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）為不孕癥患者帶來(lái)治療希望的同時(shí)也面臨著臨床妊娠率僅有30%的巨大挑戰(zhàn)[1]。胚胎質(zhì)量和子宮內(nèi)膜容受性是影響ART 成功的重要因素，臨床反復(fù)種植失敗的原因有2/3 是子宮內(nèi)膜容受性不良（poor endometrial receptivity，PER）引起的[2]。目前如何提高子宮內(nèi)膜容受性是生殖領(lǐng)域亟待解決的難點(diǎn)問(wèn)題。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，生殖道微生物在女性生育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，生殖道菌群失調(diào)可能會(huì)影響子宮內(nèi)膜容受性，導(dǎo)致不孕。此外，研究者們發(fā)現(xiàn)宮腔并非是無(wú)菌的，以乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌的ART 患者胚胎種植率和臨床妊娠率較高，妊娠結(jié)局較好。因此，本研究通過(guò)16S rRNA 高通量測(cè)序分析PER 不孕癥女性宮腔菌群特征，對(duì)研究不孕癥具有積極意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取2021 年7 月—2022 年5 月于天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院（我院）婦科就診的不孕癥女性。不孕癥診斷標(biāo)準(zhǔn)：育齡夫婦雙方同居1 年以上，有正常性生活，沒(méi)有采用任何避孕措施的情況下未能成功受孕稱(chēng)為不孕癥[3]。目前超聲評(píng)估子宮內(nèi)膜容受性尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和方法，大多數(shù)研究采用超聲形態(tài)學(xué)指標(biāo)和血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)相結(jié)合的方法診斷[4-5]。評(píng)估項(xiàng)目：①子宮內(nèi)膜厚度及形態(tài)，取子宮內(nèi)膜縱切標(biāo)準(zhǔn)圖像，取至宮底1.5～2.0 cm 處測(cè)量子宮內(nèi)膜厚度，測(cè)量3 次取平均值，并根據(jù)圖像顯示的子宮內(nèi)膜形態(tài)，將子宮內(nèi)膜分為3 型：A 型為三線型，B 型為過(guò)渡型，C 型為均質(zhì)強(qiáng)回聲型。A 型判定為良好，B 型為中等，C 型為不良。子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm 判定為良好，＜8 mm 為不良。②子宮內(nèi)膜容積，子宮內(nèi)膜容積的勾邊范圍為內(nèi)膜宮底部至宮頸內(nèi)口間子宮肌層和內(nèi)膜交界處。子宮內(nèi)膜容積≥2 mL 評(píng)定為良好，＜2 mL 為不良。③子宮動(dòng)脈血流參數(shù)，將超聲探頭置于宮頸兩側(cè)，在彩色血流最明顯處用脈沖多普勒測(cè)量其頻譜，所有的血流均測(cè)定至少4～5 個(gè)心動(dòng)周期，通過(guò)超聲機(jī)器自帶軟件得到子宮動(dòng)脈的阻力指數(shù)（resistance index，RI）、搏動(dòng)指數(shù)（pulsatility index，PI）、收縮期峰值血流速度與舒張末期血流速度比值（S/D）。以RI＜0.85、PI＜3、S/D＜8 判定為良好；以RI≥0.85、PI≥3、S/D≥8 判定為不良。以均滿(mǎn)足以上超聲評(píng)定指標(biāo)診斷為PER。具體方法：經(jīng)陰道超聲探頭頻率為3.5～7.5 MHz，傘擴(kuò)角度為120°，使超聲入射與血流方向的角度＜30°，選擇在人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）日或黃體轉(zhuǎn)化日進(jìn)行陰道超聲檢查。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡20～40 歲；②經(jīng)診斷確定為PER 不孕癥女性及子宮內(nèi)膜容受性良好的不孕癥女性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①排除因排卵障礙、盆腔因素和男方因素導(dǎo)致的不孕癥；②72 h內(nèi)進(jìn)行性生活、盆浴、陰道灌洗，局部上藥或正在服用抗生素或停藥不超過(guò)1 周的患者；③既往患有內(nèi)分泌疾病，感染性疾病，精神障礙，焦慮抑郁癥，腫瘤史，腦、肝、腎、血液系統(tǒng)等重要器官?lài)?yán)重疾病，神經(jīng)、精神疾患無(wú)法合作。最終納入63例不孕癥患者，根據(jù)超聲評(píng)估子宮內(nèi)膜容受性的結(jié)果分為PER 組（40 例）和子宮內(nèi)膜容受性良好的對(duì)照組（23 例）。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者及家屬知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 取材 使用無(wú)菌擴(kuò)陰器擴(kuò)張陰道暴露宮頸，用宮頸鉗固定宮頸，消毒宮頸管，探針明確子宮腔深度后進(jìn)行手術(shù)，刮取子宮內(nèi)膜組織，手術(shù)時(shí)刮匙等避免接觸陰道壁。將采集到的樣本放入無(wú)菌凍存管內(nèi)，-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)錂z，避免反復(fù)凍融。

1.2.2 16S rRNA 高通量測(cè)序 提取子宮內(nèi)膜組織的DNA，對(duì)16S rRNA V3～V4 區(qū)域進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，使用Qubit（Invitrogen，美國(guó)）定量，構(gòu)建文庫(kù)，并在Agilent 2100 生物分析儀（Agilent，美國(guó)）和Illumina（Kapa Biosciences，Woburn，MA，美國(guó)）的文庫(kù)定量試劑盒上分別評(píng)估文庫(kù)的大小和數(shù)量，通過(guò)NovaSeq PE250 平臺(tái)進(jìn)行文庫(kù)測(cè)序（浙江省杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司），得到特征序列。使用SILVA（release 132）分類(lèi)器對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控及Feature 聚類(lèi)，獲取Feature 對(duì)應(yīng)的分類(lèi)單元及其相應(yīng)豐度信息，根據(jù)Feature 分類(lèi)鑒定結(jié)果，獲得每個(gè)樣本在門(mén)、綱、目、科、屬、種水平的具體組成和豐度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法通過(guò)QIIME2 計(jì)算α 多樣性和β 多樣性。采用線性判別分析效應(yīng)量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）進(jìn)行組間顯著性差異分析，找到2 組在各水平的生物標(biāo)志物（Biomarker）。本研究LEfSe 分析的閾值設(shè)置為P＜0.05，線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）值＞3.5。采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；定性資料用例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組患者超聲檢測(cè)參數(shù)比較PER 組子宮內(nèi)膜厚度和子宮內(nèi)膜容積低于對(duì)照組，子宮動(dòng)脈PI、RI和S/D 高于對(duì)照組，2 組子宮內(nèi)膜分型分布不同，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。見(jiàn)表1。

表1 2 組患者超聲檢測(cè)參數(shù)比較

2.2 2 組患者一般情況比較2 組患者年齡、月經(jīng)周期、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、不孕時(shí)間和不孕類(lèi)型比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 2 組患者一般情況比較

2.3 16S rRNA 檢測(cè)結(jié)果分析

2.3.1 宮腔菌群物種注釋 2 組患者宮腔菌群在門(mén)、綱、目、科、屬、種水平上均鑒定出多種微生物菌群。見(jiàn)表3。

表3 2 組患者宮腔菌群結(jié)構(gòu)組成分析表

2.3.2 擴(kuò)增子序列變異（aplication sequence variant，ASV）數(shù)目比較 PER 組宮腔特有ASV 數(shù)目2 129個(gè)，對(duì)照組宮腔特有ASV 數(shù)目1 011 個(gè)，2 組宮腔共有ASV 數(shù)目677 個(gè)。表明2 組宮腔中存在一些相同微生物物種，但PER 組宮腔微生物物種數(shù)高于對(duì)照組。見(jiàn)圖1。

圖1 2 組患者宮腔ASV 數(shù)目比較韋恩圖

2.3.3 宮腔菌群α 多樣性分析 PER 組宮腔菌群Observed、Chao 1、Shannon、Simpson 指數(shù)稍高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。表明2 組患者宮腔菌群α 多樣性無(wú)顯著性差異。見(jiàn)圖2。

圖2 2 組患者宮腔菌群α 多樣性指數(shù)小提琴圖

2.3.4 宮腔菌群β 多樣性分析 對(duì)照組宮腔樣本個(gè)體間群落結(jié)構(gòu)相似趨于聚集，PER 組宮腔樣本個(gè)體間群落結(jié)構(gòu)差異較大趨于分散。PER 組宮腔菌群個(gè)體間差異顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 2 組患者宮腔菌群主坐標(biāo)分析圖

2.3.5 物種組成分析——物種堆疊圖 門(mén)（Phlyum）水平，PER 組宮腔優(yōu)勢(shì)菌門(mén)變形菌門(mén)（Proteobacteria）相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組（50.52%vs.19.35%，P＜0.05），對(duì)照組宮腔優(yōu)勢(shì)菌門(mén)厚壁菌門(mén)（Firmicutes）相對(duì)豐度顯著高于PER 組（62.01% vs.36.77%，P＜0.05）。屬（Genus）水平，2 組優(yōu)勢(shì)菌屬均為乳桿菌屬（Lactobacillus），PER 組宮腔優(yōu)勢(shì)菌屬乳桿菌屬相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組（21.76%vs.45.96%，P＜0.05），羅爾斯通菌屬（Ralstonia）相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組（18.01%vs.0.48%，P＜0.05）。種（Species）水平，PER組宮腔優(yōu)勢(shì)菌種未分類(lèi)的羅爾斯通菌（Ralstonia_unclassified）相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組（18.01% vs.0.48%，P＜0.05），對(duì)照組宮腔優(yōu)勢(shì)菌種卷曲乳桿菌（Lactobacillus_crispatus）相對(duì)豐度顯著高于PER 組（23.78%vs.3.82%，P＜0.05）。見(jiàn)圖4～6。

圖5 2 組患者屬水平宮腔菌群相對(duì)豐度分布堆疊圖

圖6 2 組患者種水平宮腔菌群相對(duì)豐度分布堆疊圖

2.3.6 2 組患者宮腔門(mén)、屬、種水平菌群相對(duì)豐度表達(dá)量變化程度的比較 PER 組宮腔厚壁菌門(mén)較對(duì)照組顯著下調(diào)（P＜0.05），PER 組宮腔乳桿菌屬和卷曲乳桿菌種較對(duì)照組下調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；PER 組宮腔變形菌門(mén)、羅爾斯通菌屬和未分類(lèi)的羅爾斯通菌種較對(duì)照組顯著上調(diào)（均P＜0.01）。見(jiàn)表4。

表4 2 組患者宮腔門(mén)、屬、種水平菌群相對(duì)豐度表達(dá)量變化程度的比較

2.3.7 宮腔差異菌群分析 PER 組宮腔菌群門(mén)水平的生物標(biāo)志物為變形菌門(mén)，綱水平生物標(biāo)志物為變形菌綱，目水平生物標(biāo)志物為伯克霍爾德菌目，科水平生物標(biāo)志物為伯克霍爾德菌科、弧菌科、Rhodocyclaceae 和Halomonadaceae，屬水平的生物標(biāo)志物為羅爾斯通菌屬、弧菌屬、明串珠菌屬、Methyloversatilis 和Halomonas，種水平為未分類(lèi)的羅爾斯通菌、未分類(lèi)的弧菌、未分類(lèi)的明串珠菌、未分類(lèi)的Halomonas。對(duì)照組宮腔菌群門(mén)水平的生物標(biāo)志物為厚壁菌門(mén)，目水平生物標(biāo)志物為微小桿菌目和棒狀桿菌目，科水平生物標(biāo)志物為微小桿菌科和棒狀桿菌科，屬水平生物標(biāo)志物為微小桿菌屬，種水平生物標(biāo)志物為未分類(lèi)的微小桿菌和不能培養(yǎng)的乳桿菌。見(jiàn)圖7。

圖7 2 組患者宮腔菌群差異分析LDA 得分圖（Biomarker）

3 討論

子宮內(nèi)膜容受性在女性生殖過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。宮腔微環(huán)境作為胚胎種植的直接接觸環(huán)境，宮腔菌群的平衡和穩(wěn)定對(duì)宮腔微環(huán)境具有積極意義。隨著16S rRNA 測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，如今，越來(lái)越多的研究表明宮腔菌群與子宮內(nèi)膜容受性存在一定聯(lián)系[6-8]。

3.1 PER 患者宮腔菌群特征本研究顯示2 組患者宮腔菌群相對(duì)豐度均較高的物種有：厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)和擬桿菌門(mén)，這與其他學(xué)者報(bào)道的不孕癥和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者宮腔優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的構(gòu)成是一致的[9-11]。2 組患者宮腔中存在一些相同微生物物種，但PER 組宮腔微生物物種數(shù)高于對(duì)照組。PER 組宮腔內(nèi)乳桿菌屬和卷曲乳桿菌種相對(duì)豐度均顯著低于對(duì)照組。乳桿菌在宮腔中發(fā)揮著重要作用，其主要通過(guò)產(chǎn)生乳酸、過(guò)氧化氫、細(xì)菌素、類(lèi)細(xì)菌素和生物表面活性劑抑制致病菌的生長(zhǎng)。此外，乳桿菌可刺激宿主吞噬細(xì)胞的能力，同時(shí)刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、IL-12、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）和干擾素（interferon，IFN）等，增強(qiáng)宿主的免疫能力，對(duì)早期胚胎著床起到一定作用[12]。然而并非所有的乳桿菌都是有益的，卷曲乳桿菌產(chǎn)生乳酸和過(guò)氧化氫能力比惰性乳桿菌強(qiáng)；惰性乳桿菌產(chǎn)乳酸能力較差且不能產(chǎn)生過(guò)氧化氫，還可分泌膽固醇依賴(lài)性細(xì)胞毒素溶血素[13]。因此，宮腔以卷曲乳桿菌為特征的優(yōu)勢(shì)菌種可能對(duì)子宮內(nèi)膜容受性具有保護(hù)作用。

3.2 PER 患者宮腔差異菌及其與子宮內(nèi)膜容受性的聯(lián)系宮腔菌群差異分析顯示，PER 組宮腔生物標(biāo)志物主要包括伯克霍爾德菌科、伯克霍爾德菌目、羅爾斯通菌屬和弧菌屬等，其中羅爾斯通菌屬歸屬于伯克霍爾德菌科。與本研究較為類(lèi)似的是，2019年Kitaya 等[6]發(fā)現(xiàn)反復(fù)種植失敗患者有1/4 的子宮內(nèi)膜樣本中檢測(cè)到了伯克霍爾德菌，而首次體外受精-胚胎移植成功婦女（對(duì)照組）樣本中均未檢測(cè)到該菌。2021 年Odawara 等[14]對(duì)不孕癥患者子宮內(nèi)膜組織的研究發(fā)現(xiàn)，卵泡期常見(jiàn)的菌群依次是乳桿菌、加德納菌、普雷沃菌、雙歧桿菌、伯克霍爾德菌和大腸埃希菌；而黃體期常見(jiàn)的菌群依次是乳桿菌、伯克霍爾德菌、鏈球菌、加德納菌、雙歧桿菌和奇異菌。可以看出不論是卵泡期還是黃體期，不孕癥患者宮腔均有伯克霍爾德菌的存在。國(guó)內(nèi)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)與非慢性子宮內(nèi)膜炎患者比較，慢性子宮內(nèi)膜炎患者宮腔中存在特征性差異菌群，其中具有診斷效能的分別是伯克霍爾德菌、代爾夫特菌、鞘氨醇單胞菌、苔蘚伯克霍爾德菌和刺狀鞘氨醇單胞菌等，它們對(duì)慢性子宮內(nèi)膜炎的診斷準(zhǔn)確度均為60%～70%[15]。此外，使用左炔諾孕酮宮內(nèi)緩釋節(jié)育系統(tǒng)患者的宮腔中?？梢詸z測(cè)到伯克霍爾德菌[16]。伯克霍爾德菌也可能是導(dǎo)致輸卵管卵巢膿腫的潛在病原體之一[17]。因此，伯克霍爾德菌可能是導(dǎo)致生殖道感染的一種關(guān)鍵致病菌。本研究中伯克霍爾德菌是PER 組的特征菌，提示該菌可能與PER 有關(guān)。伯克霍爾德菌、羅爾斯通菌和弧菌都屬于革蘭氏陰性菌，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外壁的重要組成成分，可以激活宿主細(xì)胞膜表面的Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4），宮腔菌群能與TLR 結(jié)合激活絲裂原激活的蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）和核因子κB（nuclear factor-κB）信號(hào)通路并介導(dǎo)子宮內(nèi)膜發(fā)生免疫炎性反應(yīng)，導(dǎo)致大量細(xì)胞因子的表達(dá)，包括TNF-α、IL-1β和IL-6 等[18]。宮腔促炎反應(yīng)與抗炎反應(yīng)的失衡可能會(huì)直接或間接激活子宮內(nèi)膜慢性炎癥反應(yīng)，影響子宮內(nèi)膜容受性從而導(dǎo)致著床失敗。

綜上，宮腔內(nèi)乳桿菌相對(duì)豐度的下降以及特征致病菌伯克霍爾德菌、羅爾斯通菌、弧菌等相對(duì)豐度的升高可能與PER 有關(guān)，維持宮腔菌群的平衡或許有利于改善子宮內(nèi)膜容受性。未來(lái)，宮腔菌群結(jié)構(gòu)和（或）功能變化與子宮內(nèi)膜容受性發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性及可能機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究來(lái)闡明，為從調(diào)節(jié)宮腔菌群失調(diào)的角度預(yù)防不孕癥奠定基礎(chǔ)。